單劑量豬肺炎支原體疫苗的製作方法

2023-07-08 00:53:41

專利名稱：單劑量豬肺炎支原體疫苗的製作方法
單劑量豬肺炎支原體疫苗 發明領域
本發明涉及一種通過對約3至10日齡動物施以單劑有效量豬肺炎 支原體(Mycoplasma hyopneumoniae ) ( M. hyo )疫苗來治療或預防 由豬肺炎支原體感染所致動物疾病或病症的方法。所述豬肺炎支原體 疫苗可以是完全或部分滅活細胞或改良活體製劑、亞單位疫苗、或核 酸或DNA疫苗。根據本發明施用的豬肺炎支原體疫苗可用合成或重組 方法製備。
背景技術：
豬肺炎支原體(M. hyo)是一種能引發豬地方性動物肺炎的細菌 病原體。地方性動物肺炎是導致下列症狀的慢性疾病食物轉化不良、 發育障礙及繼發性肺部感染易感性。豬肺炎支原體很容易通過呼吸道 分泌物以及通過母豬-豬仔傳遞而進行傳播，並在豬場中大規模流行。 美國約有99%的豬群被感染，養豬業每年因此耗費約3億美元。
已知的抵禦豬肺炎支原體的疫苗大多數都是基於含佐刑的豬肺炎 支原體全細胞滅活製劑。此外，基於免疫原性多肽或蛋白質的疫苗可 以通過豬肺炎支原體基因的克隆和重組表達的方法進行合成或製備。 能夠在體內表達所述多肽或蛋白質的豬肺炎支原體基因也可用作疫 苗。
全細胞滅活豬肺炎支原體疫苗的例子包括RESPISURE和 STELLAMUNE，其均可從美國輝瑞乂>司獲得。
另外， 一些重組製備的可用作亞單位疫苗的豬肺炎支原體免疫原 性多肽和蛋白質在本領域中已有描述。公開號為W096/284172的國際專 利申請中描述了 6種豬肺炎支原體蛋白抗原，其分子量分別為46-48、 52-54、 60-64、 72-75、 90-94和110-114kDa，而且公開了分子量為52-54、 60-64和72-75 kDa的抗原的部分蛋白質序列以及分子量為 46-48 kDa的抗原的全長核苷酸序列和胺基酸序列。
編碼豬肺炎支原體蛋白質P46的基因，即p46，也已經被Futo等 人克隆(1995;J. Bacteriol 177:1915-1917)。該小組的研究表明 體外表達的基因產物可用於診斷豬肺炎支原體感染的抗體免疫應答而 不與其他種類的支原體發生交叉反應(Futo等，1995;J. Clin.Microbiol. 33: 680-683 ) 。 Futo等人描述的p46基因的序列和 診斷用途進一步公開於歐洲專利0475185 Al。
Wise和Kim ( 1987， J. Bacteriol. ， 169: 5546-5555 )才艮道了名為 p70、 p65 (P65，同上)、p50和p44的4種豬肺炎支原體膜整合蛋白 質，後3種經共價脂連接而被修飾，可誘導強的體液免疫應答。對該 免疫應答的保護效果未做研究。編碼P65蛋白質的基因也已克隆，其 序列和在疫苗及"^斷中的用途已描述於美國專利5， 788, 962。
國際專利申請W091/15593公開了豬肺炎支原體的5種蛋白質，其 表觀分子量分別為150、 90、 85、 70和43kDa。其中提供了編碼85kDa 蛋白質(蛋白質C)的編碼基因的全長序列，以及編碼其他4種蛋白 質的部分核苷酸序列。
Faulds的美國專利US5， 252， 328公開了免疫反應性豬肺炎支原體 蛋白質的氨基末端序列，其分子量為36、 41、 44、 48、 64、 68、 74.5、 79、 88.5、 96和121 kDa。其他根據電泳遷移率鑑定的而未公開蛋白 質序列的蛋白質的表觀分子量為22. 5、 34和52kDa。儘管US5， 252， 328
提及這些蛋白質可用於疫苗製劑，但未報導任何疫苗實驗結果。
國際專利申請WO 95/09870公開了純化豬肺炎支原休粘附素的生
化方法，所述粘附素是支原體的膜整合蛋白，負責粘附到宿主的上呼
吸道上皮細胞的纖毛上。W0 95/09870也建議了這些蛋白質的測試方
法及用途，例如在疫苗和診斷方面的用途。
King等人的研究論文(1997; Vaccine 15: 25-35 )公開的分子量為
124 kDa的粘附素Mhpl是P97的一個菌株變體。
Wilton等人(1998， Microbiology 144: 1931-1943 )測定出了 P97的一種94 kDa變體。此外，研究表明p97基因是還編碼名為P102的 第二種蛋白質的操縱子的一部分，該第二種蛋白質的推測分子量約 102 kDa (Hsu等，1998， Gene 214:13-23) 。 Minion和Hsu在國際專 利申請99/26664中提出P102可用於疫苗，但未報導疫苗實驗。
沒有任何一種已知的豬肺炎支原體疫苗被報導在對大約3-10日齡 的豬施以單劑量治療時是有效的。這樣的疫苗將消除對多劑量的需求， 並因此大大減少世界範圍內豬群大規模接種疫苗相關的費用和勞動 力。因此需要一種對約3至10日齡豬施以單劑量疫苗接種以有效地保
發明概述
本發明提供一種治療或預防由豬肺炎支原體感染所致動物疾病或 病症的方法，所述方法包括對約3至10日齡動物施以單劑有效量的豬 肺炎支原體疫苗。
本發明方法可消除對額外劑量的需求，所述額外劑量旨在產生或 維持抵禦豬肺炎支原體的免疫力。本發明的單疫苗接種方法能為血清 反應陰性和血清反應陽性的豬提供抵禦毒性豬肺炎支原體的保護。本 發明方法能有效地治療或預防由豬肺炎支原體感染導致的症狀，例如 預防和減輕豬肺的病灶。
本發明方法包括對豬施以單劑有效量的豬肺炎支原體疫苗，所述 疫苗包含完全或部分細胞製劑(如菌菌或改良活體製劑)，亞單位疫 苗，例如這樣一種亞單位疫苗，其包含一個或多個豬肺炎支原體衍生 多肽或蛋白質或者所述多肽或蛋白質的免疫原性片段，或編碼所述多 肽、蛋白質或免疫原性片段的一個或多個豬肺炎支原體基因，所述基 因或核酸能在體內進行表達。豬肺炎支原體疫苗中提供的豬肺炎支原 體多肽、蛋白質及其免疫原性片段和基因或核酸可以用本領域公知技 術來合成或重組製備。
根據本發明施用的豬肺炎支原體疫苗可包括附加成分，如佐劑。 可以使用的多種佐劑包括那些此處描述的以及本領域公知的。
6發明詳述
本發明包括一種治療或預防由豬肺炎支原體感染所致動物疾病或
病症的方法，所述方法包括對約3至10日齡動物施以單劑有效量豬肺炎支原體疫苗。
本發明的單劑疫苗接種方法可消除對豬施用額外劑量的需求，該額外劑量旨在產生和/或維持抵禦豬肺炎支原體的免疫力。
為清楚公開，並且非限制性的，對本發明的詳細描述將分成如下幾個部分，各部分描述或說明某些特徵、實施例或發明的應用。
某些實施例中，本發明方法中所使用的疫苗包括部分或全細胞豬肺炎支原體滅活製劑(菌苗)或改良活體疫苗以及藥物學上可接受的栽體，或者部分或全細胞豬肺炎支原體滅活製劑(菌苗)或改良活體疫苗以及佐劑。
在其他一些具體實施例中，本發明的方法中所使用的疫苗包括免疫原性蛋白質或多肽或其片段以及藥物學上可接受的載體，或者免疫原性蛋白質或多肽或其片段以及佐劑。
定義及縮寫
術語"治療或預防"在涉及豬肺炎支原體感染時是指抑制豬肺炎支原體細菌的複製、抑制豬肺炎支原體的傳播、或防止豬肺炎支原體在其宿主體內定居，以及減輕豬肺炎支原體感染所致疾病或病症的症狀。如果細菌荷載量減少、肺部感染減輕和/或攝食量和/或生長增加，那麼就可以認為所述治療達到了治療效果。
術語"豬肺炎支原體疫苗"是指能夠用於預防或治療由豬肺炎支原體感染所致病症或疾病的疫苗，該疫苗可包括任何能夠有效治療或預防豬受豬肺炎支原體感染的疫苗。能夠用於本發明的豬肺炎支原體疫苗包括，例如，完全或部分豬肺炎支原體細胞製劑、滅活或改良活體疫苗、亞單位疫苗，所述亞單位疫苗含有一個或多個豬肺炎支原體衍生的多肽或蛋白質或所述多肽或蛋白質的免疫原性片段、或者編碼一個或多個豬肺炎支原體衍生多肽或蛋白質、或其免疫原性片段的一個或多個豬肺炎支原體基因或核酸，且所述基因或核酸能夠在豬體內表達。豬肺炎支原體多肽、蛋白質、所述多肽和蛋白質的免疫原性片段、或豬肺炎支原體基因或核酸可用本領域公知技術合成或重組製備。優選的，本發明的方法使用的豬肺炎支原體疫苗為菌苗。術語"動物"是指全部非人類動物，包括哺乳動物。
術語"豬，，是指小豬(piglets) ， swine， pigs， porcine， 大母豬(sows)，小母豬(gilts) ， barrows，公豬(boars )以及豬科的成員。
優選地，本發明的方法施用於非人類哺乳動物，最優選的，豬。術語"菌苗"是指適用於疫苗用途的滅活的完全或部分豬肺炎支原體細胞製劑。
術語"有效量"是指足以在其施用的受試者體內激發產生免疫應答的豬肺炎支原體疫苗的量。所述免疫應答可以包括但不限於，內在的、細胞的和/或體液的免疫的誘導。
滅活(部分或全細胞)及改良活體疫苗用於本發明方法的傳統滅活或改良活體疫苗的製備方法是本領域公知的。
本發明所述的單劑量疫苗接種方法所施用的豬肺炎支原體菌苗可獲自多種公眾可用的來源。例如，豬肺炎支原體菌苗可從豬肺炎支原體分離物中製取。豬肺炎支原體的很多分離物對本領域普通技術人員來說均為熟知的並可獲自，例如美國典型培養物保藏中心，10801Boulevard大學，馬納薩斯(Manassas) ， VA 20110-2209,包括例如ATTC序號為25095， 25617， 25934， 27714和27715。
豬肺炎支原體分離物還可用已知技術直接獲自自然或實驗感染的豬的肺損傷組織。
豬肺炎支原體分離物可用多種已知方法進行滅活，例如，用美國專利5, 565, 205中公開的二元吖丙啶(BEI)處理細菌分離物、或用如福馬林、熱、BPL、放射或戊二醛進行滅活。
適用於本發明方法的豬肺炎支辰體菌苗還可獲自多種商業來源。該來源包括但不限於RESPIFEND (Fort Dodge，美國家庭用品公司)，HY0RESP (梅裡亞公司)，M + PAC (先靈葆雅公司)，PROSYSTEM M(Intervet)，INGLEVAC M (Boehringer) ， RESPISURE (輝瑞/>司)，和STELLAMUNE MYCOPLASMA (輝瑞/>司)。
用於本發明方法的優選的豬肺炎支原體菌苗來源為RESPISURE和STELLAM匿MYCOPLASMA。
用於本發明方法的特別優選的豬肺炎支原體菌苗來源為RESPISURE-1 (輝瑞公司)，包含林系P-5722-3 (NL1042), 獲自美
國普度大學。
優選地，P-5722-3林用BEI滅活並且選用商業可獲得的佐劑，優選AMPHIGEN (Hydronics，美國)使其佐劑化。優選劑量為2. Oml。常用防腐刑包括硫柳汞/EDTA。可以加入載體，優選為PBS。製備改良活體疫苗的方法，如經培養傳代以減低毒林的毒性，是本領域熟知的。
亞單位疫苗
本發明方法的實施可以使用含有純化的豬肺炎支原體免疫原性蛋白質，多肽及所述蛋白和多肽的免疫原性片段。所述蛋白質和多肽可以用本領域公知技術進行製備。另外，可以採用本領域技術人員所熟
知的方法測定蛋白質純度或均質性，例如，先對樣品進行聚丙烯醯胺
凝膠電泳，然後再觀測染色凝膠上的單個多肽條帶。可以使用HPLC
或其他本領域熟知的相似方法進行更高的解析度測定。
在一個具體的實施例中，用於本發明的疫苗包含至少一種豬肺炎
支原體蛋白質，如，但不限於，P46， P65， P97， P102, P70， P50和
P44。
在另一個實施例中，用於本發明方法的疫苗包含豬肺炎支原體菌苗(滅活的完全或部分細胞或改良活體)或豬肺炎支原體蛋白質或多肽或其免疫原性片段和至少另外一種免疫原(滅活的完全或部分細胞或改良活體)或免疫原性或抗原性蛋白質、多肽或其免疫原性片段，優選為病毒、細菌或寄生蟲多肽。所述另外的病原和蛋白質、多肽或
其免疫原性片段包括，但不限於豬流感病毒(SIV)，豬生殖和呼吸疾病病毒(porcine reproductive and respiratory disease virus,PRRS或坤申禾Jt豬病(mystery swine disease))， 斷奶後腹瀉(post-weaning diarrhea ， PWD)和豬增生性腸炎 (porcineproliferative enteritis, PPE )。該組合物作為聯合疫苗是有益的。
在另一個具體的實施例中，所述蛋白質或多肽的免疫原性片段含有用於本發明方法的免疫原性蛋白質和多肽(包括但不限於P46， P65，P97， P102， P70， P50和P44)中至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少IOO個連續胺基酸。
此外，用於疫苗的豬肺炎支原體蛋白為基本純化的或均質的。本發明方法所釆用的蛋白質或多肽一般是從表達編碼這些蛋白質的重組核苷酸的宿主細胞中純化得來的。所述蛋白質的純化可通過本領域熟知的多種方法實施。參見，比如，"Methods in Enzymology" ， AcademicPress, Inc., San Diego,"蛋白質純化原理和方法"，1982 ，Springer-Verlag， New York中所述的技術。
純化的豬肺炎支原體多肽和蛋白質以及其免疫原性片段還可用已知的合成方法來製備。
疫苗製劑
用於本發明的疫苗的合適製劑包括可注射的液體溶液或懸浮液；也可以是在注射前適合溶於或懸浮於液體中的固體形式。也可以製成乳化劑。所述活性免疫原成分常與藥物學上可接受並能與該活性成分匹配的佐劑相混合。
可以將所述多肽配製成中性或鹽類的疫苗形式。藥物學上可接受的鹽類包括酸加成鹽(與所述肽游離氨基基團形成的)以及與無機酸形成的鹽類，所述無機酸如，鹽酸或磷酸，或與乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等有機酸形成的鹽。與游離的羧基形成的鹽類也可以衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鉀、或氫氧化三鐵等無機鹼，
以及異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等有機鹼。
本發明所述的疫苗製劑含有免疫有效量的豬肺炎支原體免疫原和藥物學上可接受的載體。疫苗製劑包含免疫有效量的一種或多種抗原以及藥物學上可接受的栽體。藥物學上可接受的栽體是本領域所熟知的，包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、無菌的等滲含水緩衝液及其組合。這種可接受栽體的一個實例是含有一種或多種穩定劑的生理平衡培養基，所述穩定劑如穩定的水解蛋白、乳糖等。優選該載體是無菌的。製劑形式應該適合所述的施用方式。
可以用標準方法將純化後的抗原用於疫苗製劑。例如應該將所述純化蛋白質調整到一合適的濃度，配以任一合適的疫苗佐劑並包裝。合適的佐劑包括，但不限於礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性劑，例如溶血卵磷脂；糖甙，例如皂甙和Quil A或GPI-0100等皂甙衍生物；P曰離子表面活小生劑，例ft口 DDA ( quaternary hydrocarbon a邁邁oniumhalogenide; Pluronic多元醇；聚陰離子和多原子離子；聚丙烯酸，非離子嵌段多聚物，例如PluronicF-127(B. A. S. F. ， USA); Avridine和Rantidine;肽；重組突變不穩定毒素，例如白細胞毒素(rmLT)或霍亂毒素(CT);化學結合或近分子轉運體(chemically bound orclose proximity molecular transporters );礦物油，例如MontanideISA-50 (Seppic， Paris, France);聚羧乙烯，Amphigen (Hydronics，美國)，Omaha, NE.美國，Alhydrogel， (Superfos Bisector,Frederikssund， Denmark)油類乳狀液(oil emulsions)， 例如BayolF/Arlacel A等礦物油與水的乳狀液，或者植物油、水和乳化劑如卵磷脂的乳狀液；明鞏，MDP， N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr MDP) ， N-乙醯-去甲(nor)-胞壁醯-L-丙氨醯-D -異穀氨醯胺，N —乙醯胞壁醯-L -丙氨醯-D -異穀氨醯胺醯一 L _丙氨酸-2 - ( 1， 一 2， 一 二棕扭l醯-sn -甘油基一 3 —羥基磷醯氧基)-乙胺；膽固醇細胞因子及佐劑的組合物。多原子離子可作為分散劑、增稠劑、抗結塊劑，從而使疫苗在延長的沉澱期後重懸為單分散懸液。佐劑組合物可以是水劑，膠嚢(控釋或緩釋)或微膠囊等形式。
也可以將所述免疫原引入到脂質體中，或者偶聯到多糖和/或其它可用於疫苗製劑的聚合物上。當重組抗原是一種半抗原，即具有抗原性因而能與相關抗體選擇性反應，但不具有免疫原性因而不能激發免疫應答的分子時，可以將所述半抗原共價偶聯到 一種栽體或免疫原性
分子上；例如，血清白蛋白等大分子蛋白可賦予與其偶聯的半抗原免疫原性。可以配製所述半抗原-栽體用作疫苗。
基因和核酸疫苗
本發明可以使用編碼免疫原性蛋白，多肽及所述蛋白質和多肽的免疫原性片段的豬肺炎支原體基因或核酸。該基因和核酸可在體內表達而且可以用本領域熟知方法進行製備。
在一個具體實施例中，用於本發明的疫苗包含至少一種基因或核
酸，所述基因或核酸編碼豬肺炎支原體蛋白，例如，但不限於，P46,P65, P97, P102， P70， P50和P44。
在另一個具體實施例中，本發明中使用的基因或核酸編碼豬肺炎
支原體蛋白或多肽的免疫原性片段，所述免疫原性片段含有本發明中所採用的免疫原性蛋白和多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、或至少IOO連續胺基酸，所述免疫原性蛋白或多肽包括，但不限於P46， P65， P97， P102， P70， P50和P44。
在本發明方法的另一些實施例中，基因或核酸用本領域熟知方法來施用，例如，使用基因槍。
在本發明方法的另一些實施例中，所使用的基因或核酸為DNA疫苗。此外，該核酸或基因可與脂質體或本領域熟知的其它促進轉染的因子聯合使用。
用於製備和傳遞DNA疫苗的方法是本領域熟知的。參見，例如，Krishnan， B. R， "DM疫苗在獸醫學中的現狀"Advanced Drug DeliveryReviews, Elsevier Science (2000)。表達系統
可以用多種的宿主表達栽體系統來表達本發明所述的抗原性蛋白質序列。這類宿主表達系統可以是目的編碼序列可以從中產生並隨後純化的栽體，也可以是當用合適的核苷酸編碼序列轉化或轉染後能夠在原位展示出本發明的豬肺炎支原體基因產物的細胞。這些包括但不
限於孩t生物，例如用含有mhp3編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌(例如，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌)；用含有豬肺炎支原體基因產物編碼序列的重組酵母表達栽體轉化的酵
母(例如，糖酵母、畢赤氏酵母)；用含有豬肺炎支原體編碼序列的重組病毒表達載體(例如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;菸草花葉病毒，TMV)感染或用含有豬肺炎支原體編碼序列的重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉化的植物細胞系統；或者用含有取自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒啟動子(如腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7. 5K啟動子)的重組表達構建體轉化的哺乳動物細胞系統(例如，COS、 CH0、 BHK、 293、 3T3 )。在一個優選實施例中，所述表達載體是細菌系統。
豬肺炎支原體多肽和蛋白質及其免疫原性片段還可用活體重組病毒和細菌載體比如腺病毒或沙門氏菌。實際使用的載體也是本領域熟知且容易獲得的或可由本領域技術人員使用本領域熟知方法構建。
劑量和施用方法
根據本發明，對約3-10日齡的豬施以單劑有效量的豬肺炎支原體可提供抵禦隨後豬肺炎支原體攻擊的有效免疫力。優選的，對約6-約8日齡的豬施以豬肺炎支原體疫苗。最為優選的，對約7日齡的豬施以豬肺炎支原體疫苗。
單次劑量實施中豬肺炎支原體菌苗疫苗的有效劑量為每劑中包含約1乂106至約5xl0"變色單位(color changing unit) ( CCU)。優選的，能提供有效免疫力的豬肺炎支原體菌苗疫苗單劑包含lx108至約5 x 1(TCCU及更優選的，約5 x 108至5 x 10，CU。
根據本發明，當使用優選的菌苗產品RESPISURE-1時，單劑施用RESPISURE-1的量為約0. 5-3. Oml，優選的約1. 5ml至約2. 5ml，更優選的，約2ml。
本發明包含一個或多個蛋白或多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的豬肺炎支原體亞單位疫苗的有效量為約0. Olpg至約200 pg。
本發明包含一個或多個編碼免疫原性蛋白或多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的豬肺炎支原體基因或核酸(優選DNA)的豬肺炎支原體疫苗的有效量為約0. 1 p g至約200mg。
根據本發明，疫苗的施用可以採用本領域所熟知的途徑，包括口腔、皮內、肌內、黏膜局部、經皮和腸胃外(例如，靜脈內的，腹膜內的，皮內的，皮下，肌肉內)。還可以使用無針頭的傳遞裝置進行施用。施用還可以通過聯合途徑完成，如，首次施用採用腸胃外途徑，隨後的施用釆用黏膜途徑。優選的施用途徑為肌內施用。
本發明疫苗的有效劑量(免疫劑量)還可以根據模型測試系統中的劑量-反應曲線中推出。
本發明接種疫苗的方法為血清反應陽性和血清反應陰性的小豬均可提供針對豬肺炎支原體的保護性免疫力。血清反應陽性的小豬是指血清中含有抗豬肺炎支原體抗體的小豬。血清反應陰性的小豬是指血清中不含可檢測水平的抗豬肺炎支原體抗體的小豬。
本發明進一步描述於，但不限於，下列實施例中。
實施例1
豬肺炎支原體菌苗的製備豬肺炎支原體NL1042抹用二元吖丙啶(BEI))進行滅活。在生長期末，將培養物的pH調高至7.8±0.2，並保持pH在此範圍內至少一小時。在此期間，加入經濾過滅菌處理的2-溴乙基銨氫溴酸鹽(2-BromoEthylAminehydrobromide) (BEA)水溶液至終濃度約4.0mM。在提高的pH下，BEA會化學轉化為BEI。培養物於37士2T下持續攪拌溫育至少24小時。
溫育24小時後，加入經濾過滅菌處理的硫代疏酸鈉水溶液至終濃度約4mM以中和過剩的BEI。再將培養物於37土2X:下持續攪拌溫育24小時。
滅活後，但在用硫代硫酸鈉中和前，取樣品並檢測滅活完成情況。將含有0. 0026%酚紅的新培養基用5-20%接種體接種，並在檢測顏色改變前在37土2。C下至少孵育一周，所述顏色改變為滅活失敗的表現。大量樣本在37士2t:的巰基醋酸鹽培養液中，和室溫下的胰腖豆腖培養液中，檢測無菌狀態。滅活的培養物移入滅菌儲存容器中並在組裝前保存於2-8r下。
通過體外血清學實驗定量最終容器中的抗原以測定效價。用於功
效研究中的疫苗效價決定了在失效期時疫苗所必須表現的最小活性。
每一 系列或第 一亞系的完成產品的整體或最終容器樣品用下述方法進行豬肺炎支原體的檢測。
菌苗保存於-50X:的100ml的小瓶。小瓶解凍後，等分為15ml並在使用前保存於5+/-2匸。
為檢測組裝系列的效價，該組裝系列的 一個樣本與參照物進行比較，並確定這一組裝系列的RP單位值。組裝系列或組裝亞系在起始時優選包含至少6. 33RP，並且在整個期間至少為5. 06RP。
RP指的是相對效價。可以用與參照疫苗相比較的相對抗原量來測定RP值。在本申請中，將參照疫苗RP值確定為1。本發明單劑量產品優選具有6. 33RP值，即為參照疫苗的6. 33倍。
加入硫柳汞(Merthiolate)作為防腐劑，終濃度不要超過O. 01%(w/v)。
加入10。/。乙二胺四乙酸(EDTA， 二鈉鹽或四鈉鹽)溶液作為防腐劑，終濃度大約為O. 07% (w/v)。
實施例2
動物大約1周齡的豬被選用以接種疫苗。其豬肺炎支原體血清狀況用
ELISA實驗進行測定。ELISA值《0. 50的豬為豬肺炎支原體陰性。ELISA 值大於0. 50的豬為豬肺炎支原體血清陽性。
疫苗
豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1 (輝瑞公司)用來給豬免疫接種。 使用該疫苗前，用與參照豬肺炎支原體菌苗相比較的相對抗原量來確 定其效價。參照疫苗UP=1. 0)每劑量包含大約8000單位的抗原(在 滅活前收穫的存活細胞的大約1 - 2 x 10SCCU)，用能測定疫苗中豬肺 炎支原體抗原的固相免疫實驗對其進行檢測。
在製備RESPISURE-1中使用的同一液體佐劑(AMPHIGEN)用作安
慰劑(即，沒有細菌細胞。) 攻擊接種體(challenge inoculum)
以10ml均分的肺組織勾漿形式提供的攻擊接種體，凍於-70匸， 並被視為豬肺炎支原體株11 (Ll 36)的衍生物。解凍該接種體並用 Friis Mycoplasma Broth稀釋為1:25的稀釋液，並在接種前保持冰 浴。每隻豬在以下每個實施例中的特定日時經鼻接受5ml的劑量(每 個鼻孔2. 5ml的1: 25懸液)。攻擊的每一天，肺接種體的一等份要 進行培育以確定不存在細菌的感染。其後在三天中的每一天，用滴定 法測定第二等分，結果顯示了接種體包含大約16-i(r變色單位(ccu) 的豬肺炎支原體。 實驗步驟
豬在母豬體上時即用耳部標記進行識別[(-1)天]。該豬按照普 遍隨機分組法被分配至圍欄中和治療組中。豬的分組是基於窩和斷奶 圍欄進行的。
在第0天，豬經肌內接種2ml劑量的豬肺炎支原體菌苗 RESPISURE-1 (輝瑞公司)，或經肌內接種2ml劑量的安慰劑。每隻豬 在以下每個實施例中的特定日時經鼻接受5ml劑量的1: 25懸液。全 部豬每天都要監測和檢查疾病的臨床症狀。
在攻擊第1天後的特定時間，無痛處死全部豬並作屍檢。取出肺並進行評測。屍檢測定包括評估支原體呼吸系統疾病相關的病理程度。 每一片肺葉都要檢測，並畫出病灶的草圖以評估其佔每片肺葉的 百分比。並記錄總的病灶程度。 數據分析
根據豬肺炎支原體感染的典型肺病灶百分比來評估功效。治療組
(接種組)中豬的全部肺病灶的百分比顯著(P<0. 05)小於安慰劑組 中的豬。
總病變肺百分率
每片肺葉的百分數用下面的單個肺葉與肺總質量的比例來加權平 均左頭葉10%，左中葉10%，左尾葉25%。右頭葉10%,右中葉10%， 右尾葉25%,其他為10%。然後將加權的肺葉值相加即可得出總病變肺 百分率(Pointon等，1992 )。
實施例3
評測豬抵禦毒性豬肺炎支原體攻擊的保護作用，所述豬為於3-8 日齡施以單劑量豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1 (輝瑞公司)的豬肺 炎支原體血清型陽性的豬。
在疫苗接種時或其前後，對RESPISURE- 1進行五個複製效價測定 實驗。用與疫苗參照物相比的相對抗原量來測定相對效價(RP)。疫 苗參照物的RP = 1. 0，包含大約8000單位的豬肺炎支原體抗原。五 項實驗的RP值分別為5. 42，3.96，4.71，5. 49和4. 36。
第0天，T02治療組中的豬(見下面表l)經肌內接種劑量為2ml的 豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1 (輝瑞公司)。T01組中的豬經肌內接種 劑量為2ml的安慰劑。在第178， 179和180天，每隻豬均經鼻接種劑量 為5ml的l:25的攻擊接種體懸液。這三天中的每一天，在接種時培養一 等份攻擊物，以確定不含細菌汙染。第二等份用反滴定法來確定攻擊 儲存物中包含大約10'CCU/ml的豬肺炎支原體。所有的豬每日都要進行
檢測並檢查疾病的臨床症狀。
攻擊第一天後30天，無痛處死全部豬並作屍檢。將肺取出並進行評估。屍檢測定包括評估支原體呼吸系統疾病相關的病理程度。每一 片肺葉都要檢測，並畫出病灶的草圖以評估其佔每片肺葉的百分比。 並記錄總的病灶百分數。
表1
治療組接種物數量接種後0天第178天'攻擊第179天^丈擊第180天i攻擊 T01 安慰劑26 26 26 26 26
T02 疫苗26 26 242 223 223
i毒性豬肺炎支原體接種體
271和73號豬由於丟失耳部標記而在攻擊前從研究中除去，因為這些豬 會導致無法確定每隻動物的身份。36號豬由於麻醉併發症在第178天死 亡。31號豬由於麻醉併發症在第179天死亡。
表2中總結了肺病灶結果。該結果顯示疫苗接種的豬(T02)的肺炎 所致肺病灶的最小均方值顯著(P-O. 0385)低於給予安慰劑的豬(T01) (2. 0對4. 5%)。
嫋2.總病變肺百分率的總結 治療組 化合物 豬的數量聶小均方值 範圍 T01 安慰劑 26 4. 5a 0-36.75
T02 疫苗 22 2. Ob 0-13.75
"不同的上標值具有顯著的統計學意義(P-0, 038"。
該結果顯示，將豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1給予大約1周齡的 豬單疫苗接種，可誘導出其對隨後毒性豬肺炎支原體攻擊的抵抗力。
實施例4
評測豬抵禦毒性豬肺炎支原體攻擊的保護作用，所述豬為於3-8 日齡施以單劑量豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1的豬肺炎支原體血清 型陰性的豬。在疫苗接種時或其前後，進行針對疫苗的五項複製效價實驗。用
與疫苗參照物相比的相對抗原量來測定RP。疫苗參照物的RP = 1.0， 包含大約8000單位的豬肺炎支原體抗原。五項實驗的RP值分別為 5.42，3.96，4.71，5. 49和4. 36。
第0天，T02治療組中的豬經肌內接種劑量為2ml的豬肺炎支原體菌 苗RESPISURE-1。 T01組中的豬經肌內接種劑量為2ml的安慰劑。在第 173， 174和175天，每隻豬均經鼻接種劑量為5ml的l: 25的攻擊接種體 懸液。這三天的每一天中，在接種時培養一等份攻擊物，以確定不存 在細菌汙染。第二等份用反滴定法來確定攻擊儲存物中包含大約 106CCU/m 1的豬肺炎支原體。所有的豬每日都要進行檢測並檢查疾病的
臨床症狀。
攻擊第一天後29天，無痛處死全部豬並作屍檢。將肺取出並進 行評估。屍檢測定包括評估支原體呼吸系統疾病相關的病理程度。每 一片肺葉都要檢測，並畫出病灶的草圖以評估每葉相加的總百分比。 並記錄總的病灶程度。
表3
治療組接種物 數量接種後O天第173天'攻擊第174天'攻擊第175天'攻擊 T01 安慰劑 26 26 252 2< 24
T02 疫苗 26 26 233 205 20
1毒性豬肺炎支原體
2123號豬由於慢性膿毒性多關節炎而在第19天被無痛處死。 3222號豬於第40天死亡。屍檢發現大量心包積液和心外膜出血。102號 豬由於直腸脫垂而於第95天無痛處死。2(M號豬於第1W天死亡。由於 屍體高度腐爛所以未作屍檢。
4244號豬在第一天攻擊後由於麻醉併發症於第1"天死亡。 s用NEEA對3隻豬評分
表4中總結了肺病灶結果。分析顯示疫苗接種的豬0"02)的肺炎所 致肺病灶的最小均方值顯著(P=0. OOOl)低於給予安慰劑的豬(T01)(0. 3對5. 9%)。
表4.總肺病灶百分數的總結 病變肺的百分數
治療組接種物豬的數量最小均方值 範圍
T01安慰劑24 5. 9a 0-36
T02疫苗 20 0. 3b 0-6
"不同的上標值具有顯著的統計學意義(P=0. 0001)。
該結果顯示，將豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1給予豬單疫苗接 種，可誘導出其對隨後毒性豬肺炎支原體攻擊的抵抗力。
實施例5
測評豬抵禦毒性豬肺炎支原體攻擊的保護作用，所述豬為於3-8 日齡施以單劑量豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1的豬肺炎支原體血清 型陰性的豬。
在疫苗接種時或其前後，進行針對菌苗的五項複製效價實驗。用 與疫苗參照物相比的相對抗原量來測定RP。疫苗參照物的RP = 1.0， 包含大約8000單位的豬肺炎支原體抗原。五項實驗的RP值分別為 5.42,3.96， 4.71,5, 49和4. 36。
第0天，T02治療組中的豬經肌內接種劑量為2ml的豬肺炎支原體菌 苗。T01組中的豬經肌內接種劑量為2ml的安慰劑。在第76， 77和78天， 每隻豬均經鼻接種(每鼻孔2.5ml)劑量為5ml的l:2S的攻擊接種體懸 液。這三天的每一天中，在接種時培養一等份攻擊物，以確定不存在 細菌汙染。第二等份用反滴定法來確定攻擊儲存物中包含大約 16CCU/ml的豬肺炎支原體。所有的豬每日都要進行檢測並檢查疾病的 臨床症狀。
攻擊第一天後29天，無痛處死全部豬並作屍檢。將肺取出並進 行評估。屍檢測定包括評估支原體呼吸系統疾病相關的病理程度。每一片肺葉都要檢測，並畫出病灶的草圖以評估其佔每片肺葉的百分比。 並記錄總的病灶百分數。
表5中總結了該實驗設計。
表5
治療組 接種物 數量免疫後0天第176'天攻擊第177'天攻擊第178'天攻
圭
T01 安慰劑 26 26 232 2 3 23
T02 疫苗 26 26 213 21 21
'毒性豬肺炎支原體接種物
22 37和139號豬於第-l天檢測為豬肺炎支原體陽性。於第14天將其從 研究中除去並被無痛處死。220號豬由於母豬碾壓於第3天死亡。 3238， 240和277號豬於第-l天檢測為豬肺炎支原體陽性。於第14天將 其從研究中除去並被無痛處死。280號豬由於食慾下降和萎靡於第7天 無痛處死。177號豬由於慢性衰竭綜合症於第40天死亡。
表6總結了肺病灶結果。全部分析顯示出免疫接種的豬(T02)的 肺炎所致肺病灶百分率的最小均方值顯著地(P-O. 0001 )低於施以安 慰劑的豬(T01) (0.5對9.9%)。
表6.總病變肺百分率總結 病變肺百分比
治療組 接種物豬數目最小均方值 範圍 T01 安慰劑 23 9. 9a 0至40.5
T02 疫苗 21 0. 5b 0至5
a'b不同的上標值為統計學差異(P=0. 0001 )
本申請還公開了以下內容
1. 一種在動物中治療或預防因豬肺炎支原體感染而引發的疾病 或病症的方法，該方法包括對約3至約10日齡的動物施用單劑有效量 的豬肺炎支原體疫苗。
2. 根據段落1所述的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗配劑為滅活的、全部或部分豬肺炎支原體細胞製劑。
3. 根據段落2所述的方法，其中所述單劑量豬肺炎支原體疫苗 每劑量包含約1 x 106至約5 x l(T變色單位(CCU)。
4. 根據段落2所述的方法，其中所述疫苗的施用量為約0. 5至 約3. Oml。
5. 根據段落2所述的方法，其中所述豬肺炎支原體細胞製劑為 RESPIS(JRE-1。
6. 根據段落2所述的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗還包含
豬肺炎支原體以外的病毒或細菌抗原。
7. 根據段落6所述的方法，其中所述病毒或細菌抗原選自豬流 感病毒(SIV)、豬生殖和呼吸疾病病毒(PRRS或神秘豬病)，斷奶 後腹瀉(PWD)和豬增生性腸炎(PPE)。
8. 根據段落2所述的方法，其中所述豬肺炎支原體製劑經肌內 注射施用。
9. 根據段落1所述的方法，其中所述豬在免疫接種後能被保護 多至25周。
10. 根據段落1所述的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗還包含佐劑。
11. 根據段落1所述的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗為亞單 位疫苗。
12. 根據段落12所述的方法，其中所述亞單位疫苗包含一個或 多個免疫原性多肽或蛋白質或所述多肽或蛋白質的免疫原性片段。
13. 根據段落13所述的方法，其中所述多肽或蛋白質選自P46， P65， P97， P102， P70， P50和P44。
14. 根據段落1所述的方法，其中豬肺炎支原體疫苗包含一個或 多個編碼一個或多個免疫原性多肽或蛋白質或所述多肽或蛋白質的免 疫原性片段的基因或核酸，且所述基因或核酸可在體內表達。
15. 根據段落15所述的方法，其中所述基因或核酸選自p46， p65, p97, p102， p70， p50，和p44。
權利要求
1.有效量的單劑豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)疫苗用於製備藥物的用途，所述藥物用於對約3至約10日齡動物治療或預防因豬肺炎支原體感染而引發的疾病或病症，其中所述豬肺炎支原體疫苗包含滅活的豬肺炎支原體全細胞製劑，而且所述單劑豬肺炎支原體疫苗包含至少約1×108變色單位(CCU)。
2. 根據權利要求1的用途，其中所述動物是豬。
3. 根據權利要求2的用途，其中所述豬對於豬肺炎支原體是血 清反應陽性的。
4. 權利要求2的用途，其中所述豬對於豬肺炎支原體是血清反 應陽性的。
5. 根據權利要求2的用途，其中所述豬在免疫接種後被保護長 達25周。
6. 根據權利要求1的用途，其中所迷單劑豬肺炎支原體疫苗包 含每劑約1xl8至約5xl(T變色單位(CCU)。
7. 根據權利要求6的用途，其中所述單劑豬肺炎支原體疫苗包 含每劑約5xl08至5xl(T變色單位(CCU)。
8. 根據權利要求1的用途，其中所述疫苗的量是約0.5至約 3. Oml。
9. 根據權利要求1的用途，其中所述疫苗的量是約1. 5ml至約 2. 5ml。
10. 根據權利要求l的用途，其中所述疫苗的量是約2ml。
11. 根據權利要求1的用途，其中所述豬肺炎支原體細胞製劑是 RESPISURE-1。
12. 根據權利要求1的用途，其中所述豬肺炎支原體疫苗還包含豬肺炎支原體以外的病毒或細菌抗原。
13. 根據權利要求12的用途，其中所述病毒或細菌抗原選自豬 流感病毒(SIV)、豬生殖和呼吸疾病病毒(PRRS或神秘豬病)、斷 奶後腹瀉(PWD)和豬增生性腸炎(PPE)。
14. 根據權利要求1的用途，其中所述豬肺炎支原體製劑適用於 肌內施用。
15. 根據權利要求1的用途，其中所述豬肺炎支原體疫苗還包含佐劑。
16. 根據權利要求15的用途，其中所述佐劑選自礦物凝膠；表 面活性劑，例如溶血卵磷脂；糖戒，包括皂戒或皂戒衍生物例如Quil A或GP1-0100; Pluronic多元醇；聚陰離子；非離子嵌段多聚物，礦 物油，油類乳狀液(oil emulsions),植物油、水和乳化劑如卵砩脂 的乳狀液；明礬，細胞因子，CpG寡核苷酸，和MDP， N-乙醯-胞壁 醯-L -蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr MDP) ， N-乙醯-去甲(nor) —胞壁醯-L -丙氨醯-D -異穀氨醯胺，N —乙醯胞壁醯-L -丙氨醯 一 D -異穀氨醯胺醯-L -丙氨酸-2 - (1， - 2， - 二棕櫚醯-sn -甘油 基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺；rmLT和AMPHIGEN。
17. 根據權利要求1的用途，其中所述豬肺炎支原體疫苗還包含 藥物學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及一種通過對約3至10日齡動物施以單劑有效量豬肺炎支原體(M.hyo)疫苗來治療或預防由豬肺炎支原體感染所致動物疾病或病症的方法。所述豬肺炎支原體疫苗可以是完全或部分滅活細胞或改良活體製劑、亞單位疫苗、或核酸或DNA疫苗。根據本發明施用的豬肺炎支原體疫苗可用合成或重組方法製備。
文檔編號A61K39/116GK101524532SQ200810186079
公開日2009年9月9日 申請日期2002年6月7日 優先權日2001年7月2日
發明者L·G·薩巴迪尼, R·L·凱赫 申請人:輝瑞產品公司