一種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用的製作方法

2023-07-08 00:42:56

專利名稱：：一種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物技術的分子生物學和生物化學領域，具體涉及一種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：惡性腫瘤是一種嚴重危害人類健康的重要疾病，腫瘤的防治是一個全球性問題，引起世界各國的廣泛重視。開發切實有效的抗腫瘤藥物，是當前亟待解決的重大課題。目前的傳統腫瘤化療藥物有垸化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤抗生素、鉑類抗腫瘤藥物等，作用機制多為抑制細胞的DNA、RNA及蛋白質合成，對腫瘤細胞作用的特異性較差，故常具有較大的副作用，例如骨髓抑制、肝腎功能損害。隨著分子生物學在腫瘤防治研究的多層次全方位滲透，臨床上也越來越多地將腫瘤生物治療與傳統的化學治療相結合，從而達到最佳的治療效果。以現代分子生物學、細胞生物學和分子免疫學等前沿科學為基礎，強調腫瘤發生發展及轉歸的分子基礎，針對CD分子、膜受體信號傳導、基因轉導、血管形成等靶位，設計相應藥物(單抗或小分子等)，用於腫瘤的防治，治療具有針對性、特異性(靶向性)和有效性，對正常造血、免疫和主要器官功能大都沒有負面影響和明顯毒性報導。這種腫瘤治療新思維和新模式，將成為現代腫瘤綜合治療新模式的裡程碑。尤其是分子靶向治療，已有多個藥物在腫瘤治療上成功應用。中期因子Midkine(MK)是一種受視黃酸誘導的肝素結合生長因子，人MK基因位於染色體llqll.2，由5個外顯子和4個內含子組成。成熟的人MK蛋白由121個胺基酸殘基組成，相對分子量為13.4KD,是一個分泌性的鹼性肝素結合蛋白。研究表明，MK可促進多種細胞的生長、存活和遷移，在神經發生和器官發生過程中的上皮一間充質相互作用中發揮作用。MK在很多方面顯示與腫瘤發生有關的活性，包括促細胞增殖、抗細胞凋亡、促纖維蛋白溶解和血管新生等，而且在許多惡性腫瘤及其衍生腫瘤細胞株中表達增加，可能成為腫瘤診斷和治療的一個耙點。傳統的分子靶向抗腫瘤藥物多為單抗類藥物(例如賀賽汀、美羅華等)，隨著生物技術的發展，多肽作為藥物在臨床上的應用越來越廣泛，相應的研究也日益受到重視。多肽類藥物具有分子量小、無免疫原性、可控緩釋、可口服給藥、生產方便等優點。由於新給藥技術的發展、新生產技術和極具活力的研發活動的開展，許多製藥公司、生物技術公司都步入了這一領域。在基因組學和蛋白組學領域的進步都為多肽類藥物的研究提供了新的動力。多肽與靶蛋白的結合力，類似抗原抗體反應的分子間作用力。親合力高的多肽有可能達到抑制靶蛋白活性這種效果。噬菌體展示技術於1985年首先由Smkh發明，在1988年由Parmley和Smith提出構建噬菌體隨機肽庫的設想，而在1990年則由三個研究小組構建並成功篩選噬菌體肽庫，從而標誌著噬菌體肽庫技術的誕生。噬菌體肽庫的基本原理是將隨機肽段的DNA序列插入到噬菌體衣殼蛋白的基因組，插入的DNA經噬菌體表達以後，以肽展示在噬菌體衣殼蛋白上，肽段與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白而呈現於噬菌體表面，並利用噬菌體能大量複製的特點，得到不同重組噬菌體的多個拷貝，而不影響噬菌體的浸染與擴增能力。這一技術使基因型和表型得以巧妙地結合，從而為不同的研究提供了有利工具。生物大分子之間的相互作用，實質上是功能位點間的相互作用，並不一定需要整個分子的完全接觸，MK與其受體間的相互作用以及MK與抗-MK抗體間的相互作用也不例外。因此，只要能找到受體分子或封閉性抗體分子上與MK結合的肽序列(或模擬肽)來競爭性或封閉性抑制MK與其受體相結合，進而就能達到抑制MK促腫瘤生長的作用。在噬菌體隨機肽庫中恰恰包含了極大量的，在胺基酸組成序列上相互有差異的小肽，這些小肽呈現於噬菌體表面，他們可以在序列上充當或模擬生物大分子間相互作用的功能位點。噬菌體隨機肽庫技術的優勢在於其篩選通量大，操作簡便。目前已經商品化的噬菌體隨機肽庫最常用的是由美國NewEnglandBiolabs公司(簡稱NEB)在M13噬菌體基礎上開發的噬菌體文庫，M13噬菌體是一種溶源性噬菌體，它只感染而不裂解宿主菌，最終以分泌蛋白的形式排出，宿主菌保持其原有的活性，並不斷分泌擴增的噬菌體。NEB公司的產品包括7肽庫，12肽庫，環7肽庫三種文庫，其中前面兩種屬於非構象型肽庫，第三種是一個構象型肽庫。兩類肽庫的區別主要在於，構象型肽庫是將兩個半胱氨酸的核苷酸序列加於隨機肽DNA序列的兩端，二硫鍵能夠相結合成環從而使呈現的肽段形成具有功能活性的空間結構，進而模擬天然分子的相互作用；而非構象約束型肽庫所呈現的肽段則為線形，則不使所呈現的隨機肽形成二硫鍵。
發明內容本發明的目的是提供一種與人中期因子蛋白特異性結合的封閉肽，在抗腫瘤藥物中的應用。本發明採用的技術方案是一種人中期因子蛋白封閉肽(下文中用MK-P3表示)，具有如下胺基酸序列CTSTAMDNC。所述MK-P3通過以下方法篩選得到(1)選擇靶蛋白選擇人中期因子蛋白作為隨機肽庫篩選的耙蛋白。採用原核表達系統高效表達並純化得到人中期因子重組蛋白。(2)生物淘洗篩選以人中期因子蛋白為靶蛋白，對噬菌體表面的隨機7肽庫和環7肽庫進行生物淘洗3輪。(3)測定特異性隨機肽序列生物淘洗後，選取pfu值約為100的平板上的藍色噬斑，感染宿主菌，37。C培養，離心後，上清中加入PEG/NaCl，於0。C沉澱M13噬菌體單鏈DNA，離心後沉澱溶於TBS/NaN3，得樣品ssDNA用於測序。(4)序列分析對測序結果進行分析，確定篩選得到的中期因子特異結合多確定MK-P3的胺基酸序列後，其合成可採用Fmoc-胺基酸樹脂固相合成法進行，經過HPLC純化，質譜(MS)鑑定，純度>90%。採用MTT法，檢測MK-P3對HepG2和HUVEC細胞增殖的影響；製備BALB/c小鼠移植瘤模型，檢測MK-P3對腫瘤生長及微血管密度的影響。經實驗驗證MK-P3具有抗腫瘤作用，可用於製備抗腫瘤藥物。進一步，所述MK-P3可應用於製備抑制惡性腫瘤細胞生長的藥物。再進一步，所述MK-P3可應用於製備抑制惡性腫瘤新生血管生成的藥物。本發明提供了一種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用，該多肽可抑制惡性腫瘤細胞生長、尤其是抑制惡性腫瘤新生血管生成，為新藥篩選提供了基礎，具有重大臨床意義。圖1為MK封閉肽對HepG2細胞(A)和HUVEC(B)增殖的抑制作用；圖2為BALB/c小鼠移植瘤HE染色(X200);A為模型對照；B為MK-P3;圖3為BALB/c小鼠移植瘤MVD(X200);A為模型對照；B為MK-P3。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例l:人中期因子蛋白封閉肽的篩選(一)人中期因子蛋白的表達純化根據人中期因子的mRNA序列，可溶性表達並純化人中期因子蛋白。(二)噬菌體多肽庫的篩選及陽性克隆的鑑定和序列分析噬菌體7肽庫和環7肽庫篩選(固體包被法)MK重組蛋白包被平皿，包被量為15pg/孔，經封閉液封閉後，洗滌平皿。加入10iul原庫/L(100fil0.r/^TBST稀釋)，室溫輕搖10-60min後洗滌平皿，酸性洗脫液100pl洗脫結合噬菌體，洗脫液離心後，以150jillMTris-HCl(PH9.1)中和後。收集洗脫物，取少量用於測定洗脫物滴度，其餘用於擴增。噬菌體滴度的測定挑選生長良好的ER2537單菌落，接種於LB/Tet中，孵育至對數生長中期(OD6oo=0.5)。LB培養基IO倍比稀釋噬菌體，以l:10加入ER2537中，混均後塗板(LB/IPTG/Xgal)培養。噬斑計數以噬斑數為100左右的平皿為準。回收率(％)二洗脫噬菌體數/加入噬菌體數x100。/^。噬菌體的擴增ER2537單菌落接種於LB/Tet中過夜培養，以1:100接種至LB中，加入待擴增的噬菌體，37°C，270r/m培養4.55h。收集培養物離心，上清中加入1/6體積的PEG/NaCl，4。C沉澱過夜。離心，用1mlTBS懸浮沉澱(並至少溶解1h)，離心後用1/6體積的PEG/NaCl再次沉澱，冰上孵育60min;4°C，12000xg，離心10min，棄上清，再次離心30sec，用槍頭吸棄殘留上清。TBS(0.02。/。NaN3)重懸沉澱(至少溶解1h)，離心去除不溶雜質。上清4'C保存。擴增後的洗脫物進行滴度測定，準備進行下一輪篩選。第二、三輪篩選程序與第一輪篩選相仿，僅有以下幾點不同1、投入篩選的肽庫為上一輪篩選的洗脫擴增物，控制噬菌體數量在l2xl0"pfu。2、結合後的洗滌過程中，使用的洗滌液PBST中Tween-20的濃度提高至0.5%,洗滌次數增至10次。3、第三輪篩選的洗脫物取lOpl鋪板測滴度，餘者4t:保存，不再擴增。隨機挑選第三輪分隔良好的藍色噬斑，培養後進行ELISA分析和DNA序ELISA方法比較陽性噬菌體克隆對靶蛋白的結合能力-在噬菌體洗脫液滴度測定時，在<100個藍斑的平板上，挑選輪藍色克隆，2mlER2537菌液，37。C震蕩培養5h。2次離心，稀釋用於ELISA檢測。MK蛋白100pg/孔包被酶標板過液，封閉，洗滌後加陽性噬菌體克隆，以各輪未結合噬菌體做陰性對照。室溫孵育2h，TBST洗滌後加入HRP標記抗M13抗體(1:5000)，室溫震蕩lh，TBST洗板，顯色後於酶標板測4卯nm處A值。測序模板的快速純化擴增噬斑，在第一次離心後，吸取500)ul含有噬菌體的上清，轉入新的離心管中。加入200ialPEG/NaCl，室溫靜置10min。離心，用100|^1碘化物緩衝液重懸沉澱物，加入250fal乙醇。室溫孵育10min，室溫短暫孵育將選擇性沉澱單鏈噬菌體DNA，而大部分噬菌體蛋白保留在溶液中。離心10min，用70%乙醇洗滌沉澱物，真空吸乾後，用30piTE緩衝液重懸沉澱物。取5|_il作為測序模板，送出測序。實驗結果經過3輪篩選，7肽庫中與MK特異性結合的噬菌體已從原始肽庫中篩選並富集出來(見表l)。各陽性克隆與目標蛋白均具有一定結合力(見表2)，將篩選出的陽性克隆送上海中科新生命生物技術有限公司測序，根據DNA序列推導相應的胺基酸序列，共測出14組不同序列(見表3)。選擇與靶蛋白結合力高及序列測定重複次數多的陽性克隆序列，合成了3條線性肽和3條環肽(見表4)，序列分別為CVIHWDFIC;CTWLHWWAC;CTSTAMDNC;LLWYDEI;HAIYPRH;PVPRSRP，委託杭州中肽公司合成。表1:以MK為靶分子篩選噬菌體7肽庫及環7肽庫的回收率tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10名稱多肽序列MK陽P1CVIHWDFICMK-P2CTWLHWWACMK-P3CTSTAMDNCMK陽P4LLWYDEIMK-P5HAIYPRHMK-P6PVPRSRP實施例2:MTT法檢測封閉肽對人HepG2肝癌細胞和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)生長的抑制作用實驗分組實驗由篩選出的多肽MK-P3作用於HepG2和HUVEC兩種細胞，其中每種細胞又分為15|imol/L、50pmol/L和150pmol/L3個濃度梯度組。MTT檢測細胞增殖人肝癌細胞系(HepG2)及人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)由浙江大學傳染病研究所提供，用含10%小牛血清及100U/ml青黴素，100ng/ml鏈黴素的DMEM培養基(Gibco公司)，置37°C,5%0)2培養箱中培養。取對數生長期細胞接種至96孔板，200^1/孔，3Xl3個細胞/每孔，每組設3孔，重複3次，37°C，5%(302培養箱中培養，待細胞出現60-80%融合後，換無血清培養基培養24h後，加入不同濃度MK封閉肽，設不加封閉肽孔為空白對照。繼續培養48h後，每孔加20^MTT，37°C，5%002培養箱孵育卯min,測定4卯nm光吸度值"49Q)，通過細胞生長倍增數量評價封閉肽對H叩G2和HUVEC生長的影響，計算細胞增殖抑制率。抑制率(％)=["柳對照一Am用藥)/^柳對照]X100%。實驗結果-MK封閉肽抑制HepG2和HUVEC增殖MK-P3在15Mg/ml時即能顯著抑制HepG2和HUVEC增殖作用，當濃度進一步升高至50)Lig/m和150pg/ml，其抑制作用也隨之增強，具有劑量依賴性(圖1)。實施例3:製備BALB/c小鼠移植瘤模型，分析MK封閉肽在小鼠體內的抗血管生成及抗腫瘤活性作用動物模型建立H22細胞由浙江大學傳染病研究所提供；BALB/c小鼠，18-20g，雌雄各半，由上海必凱實驗中心提供，。將H22細胞注射入BALB/c小鼠腹腔，10-14d左右取腹水，收集腫瘤細胞。用1640培養基調細胞懸液濃度至5X10"ml，每隻BALB/c小鼠背部皮下取一點種植細胞懸液0.1ml，觀察小鼠背部腫瘤形成情況及其表面有無紅腫及破潰。實驗分組及處理取BALB/c小鼠96隻，隨機分為8組，每組12隻(1)MK-P3組腹腔注射MK-P30.5mg'kg";(2)模型對照組腹腔注射PBS;(3)陽性對照組腹腔注射5-FU10mg'kg—、以上各組動物於注射H22細胞當日開始給藥，1-7組每日腹腔注射給藥2次，5-FU每日一次，連續注射給藥21天。開始給藥後第28天BALB/c小鼠處死，切取腫瘤稱重，計算抑瘤率抑瘤率(％)=(模型對照組平均瘤重量-治療組平均瘤重量)/模型對照組平均瘤重量X100。/。。腫瘤組織液氮凍存備用。免疫組織化學(ABC法)檢測腫瘤組織中微血管密度腫瘤組織用10%福馬林固定，石蠟包埋，4pm厚連續切片，常規HE染色觀察腫瘤細胞形態。免疫組織化學法檢測腫瘤組織中微血管密度(MVD):用VIII抗體標記微血管，了解腫瘤組織新生血管情況並檢測腫瘤組織中微血管密度(MVD)。ABC免疫組織化學法按照說明書的步驟進行。MVD判斷方法先在40倍顯微鏡下觀察整張切片的血管分布情況，選擇癌灶內微血管最密集的5個區域，即"熱點"，然後在200倍鏡下計數每個區域中的血管數，取5個區域的平均值作為該只小鼠腫瘤MVD，取同一組內小鼠腫瘤的平均MVD作為該組腫瘤的平均MVD。計數由2位不知臨床資料的病理科高年資醫生完成。染成棕色的血管內皮細胞或血管內皮細胞族，只要他們和鄰近的微血管、腫瘤細胞或其他結締組織分幵，就視為一個微血管；同一個血管的"頭"與"尾"正巧在同一切面上，也作為2個微血管計算。血管腔和紅細胞不作為判斷微血管的標準。實驗結果-MK封閉肽抑制BALB/c小鼠腫瘤生長細胞接種後第七天，BALB/c小鼠背部皮下開始出現腫塊，到第14天，各小鼠背部皮下均出現腫瘤塊，小鼠移植瘤率高達100%。MK封閉肽對移植瘤均有不同程度抑制作用，MK-P3的抑瘤率為56.4%。(見表5)。表5:MK封閉肽抗BALB/c小鼠移植瘤試驗瘤重與抑瘤率分組瘤重(g)抑瘤率(％)MK-P10.5mg.kg-1組2.42±0.56*22.0MK-P20.5mg.kg-1組2.31±0.645*25.4MK-P30.5mg.kg-'組1.35±0.88**56.4MK-P40.5mg-kg-'組2.31±0.49*25.5MK-P50.5mg'kg-1組2.26±0.34**27.0MK-P60.5mg'kg-1組2.50±0,16*19.313陽性對照(5-FU10mg'kg-')組1.692±0.563*45.4模型對照(PBS0.1ml/只)組3.099±0.452—x±s，n=12，*屍<0.05，**屍湖州市中心醫院—種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用6Patentlnversicm3.219〈212〉PRT<213〉Unknown<220〉人工序列〈400〉1CysVallieHisTrpAspPhelieCvs1529<212〉PRT人工序列<400〉2CysThrTrpLeuHisTrp丁rpAlaCys1.5<210〉3〈211〉9〈212〉PRTUnknown〈220>人工序列<400〉3CysThrSerThi'AlaMetAspAsnCvs1'5〈210〉47PRT〈213〉Unknown《220〉〈223〉人工序列<400〉4LeuLeuTrpTyrAspGlulie155<211〉7〈212〉PRTUnk訓n<223〉人工序列序列表.ST25.txt5HisAlalieTyrProArgHis157〈212>PRTUnknown人工序列〈400〉6ProValProArgSerArgPro1權利要求1、一種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用，所述的人中期因子蛋白封閉肽具有如下胺基酸序列CTSTAMDNC。2、如權利要求l所述的應用，其特徵在於所述的人中期因子蛋白封閉肽應用於製備抑制惡性腫瘤細胞生長的藥物。3、如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述的人中期因子封閉肽應用於製備抑制惡性腫瘤新生血管生成的藥物。全文摘要本發明涉及一種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用，所述的人中期因子蛋白封閉肽具有如下胺基酸序列CTSTAMDNC。本發明提供了一種人中期因子蛋白封閉肽在製備抗腫瘤藥物中的應用，該多肽可抑制惡性腫瘤細胞生長、尤其是抑制惡性腫瘤新生血管生成，為新藥篩選提供了基礎，具有重大臨床意義。文檔編號A61P35/00GK101255190SQ20071030130公開日2008年9月3日申請日期2007年12月26日優先權日2007年12月26日發明者戴利成,沈建芬申請人:湖州市中心醫院