甘油診斷/測定試劑盒及甘油的濃度測定方法

2023-07-08 03:57:46 2

專利名稱：甘油診斷/測定試劑盒及甘油的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種甘油診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定甘油濃 度的方法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
技術背景甘油又名丙三醇，是一種無色、無嗅、味甘的粘稠液體。甘油大量用作 化工原料，用於製造合成樹脂、塑料、油漆、硝酸甘油.、油脂和蜂蠟等， 還用於製藥、香料、化妝品、衛生用品等工業中，甘油是食品加工業中通 常使用的甜味劑和保溼劑，大多出現在運動食品和代乳品中。歐盟的一個檢測游離甘油含量的標準是EN 14106，這個標準首先對生 物柴油進行萃取，經過萃取後進行氣相色譜分析，到目前為止，已經有幾 種氣相色譜分析方法被報導過。Lozanoetal. (1996)用帶有脈衝安培檢 測器的高效液相色譜來檢測從甲酯或乙酯中萃取出來的甘油溶液。其它的檢測游離甘油含量的色譜和非色譜測試方法有Greenhill建 議了一種酶法測試的替代方法，甘油經過酶轉化後生成的H202用作形成醌 亞胺色素的轉化物，而色素的濃度可以通過光譜法進行檢測。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，計量/連續 監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定甘油濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的甘油診 斷/測定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生 化分析儀上進行甘油濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得 到切實的推廣應用。本發明甘油濃度測定方法原理如下甘油+腺苷三磷酸甘油激酶甘油-3-磷酸+腺苷二磷酸甘油-3-磷酸+輔酶 甘油-3-磷酸脫氫酶甘油酸磷酸+還原型輔酶這種方法應用甘油激酶(Glycerokinase; EC2.7丄30)偶聯甘油-3-磷酸 脫氫酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.8; EC 1.1.1.94; EC 1.U.177)酶促反應速率比色法/終點法。甘油激酶酶解甘油反應產生甘油 -3-磷酸，再通過偶聯甘油-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處 沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測 定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸 光度上升的程度/速度，可以測算甘油的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明甘油診斷/測定試劑盒 較為理想緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L腺苷三磷酸 8 mmol/L甘油激酶 10000 U/L甘油-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L本發明的甘油診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩衝液、穩定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸。 試劑2緩衝液、穩定劑、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶。 輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸。 試劑2緩衝液、穩定劑、甘油-3-磷酸脫氫酶。 試劑3緩衝液、穩定劑、甘油激酶。輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後 使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定甘油濃度的方法，其輔酶可以 是NADP+、 NAD+或thio- NAD十中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的甘油診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L腺苷三磷酸 8 mmol/L甘油徵酶 10000 U/L甘油-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍千燥，製成乾粉試劑；使用 前，加入純淨水，復溶後使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘油樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘 左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出甘油的濃度大小。實施例二本實施例的甘油診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1 '三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 10Ommol/L穩定劑腺苷三磷酸50 mmol/Lmmol/L8 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L穩定劑甘油激酶甘油-3-磷酸脫氫 500 mmol/L10000U/L12000U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C,反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘油樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出甘油的濃度大小。實施例三本實施例的甘油診斷/測定試劑為三試劑，包括: 試劑l三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液穩定劑腺苷三磷酸 試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 穩定劑甘油-3-磷酸脫氫酶100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L畫mmol/L 500 mmol/L 12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩衝液 100mmol/L穩定劑 甘油激酶500 mmol/L10000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。測定甘油濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測甘油樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為 正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出甘油的濃度大小。申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯法的甘油的濃度測定方法，其方法原理如下甘油+腺苷三磷酸 甘油激酶 甘油-3-磷酸+腺苷二磷酸甘油-3-磷酸+輔酶 甘油-3-磷酸脫氫酶 甘油酸磷酸+ 還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出甘油的濃度大小測定結果。
2. —種甘油診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩衝液 20-穩定劑 l一 輔酶 1--500 mmol/L-4000 mmol/L6 mmol/L1000-1000-50 mmol/L-80000 U/L-80000 U/L腺苷三磷酸 甘油激酶甘油-3-磷酸脫氫酶其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述甘油診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸 組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述甘油診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸組成; 試劑2，由緩衝液、穩定劑、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、 甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。
5. 根據權利要求2所述甘油診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷 酸組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸組成; 試劑2，由緩衝液、穩定劑、甘油-3-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝 液、穩定劑、甘油激酶組成。輔酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、 腺苷三磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述甘油診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括穩定 劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的甘油診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定甘油濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、輔酶、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出甘油的濃度大小。
文檔編號G01N33/50GK101329335SQ200710024730
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優先權日2007年6月21日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司