含核酸和醋孟南的製劑的製作方法

2023-12-10 10:09:32 7

專利名稱：含核酸和醋孟南的製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，具體地涉及一種可增對加疫苗抗原的免疫應答數量和質量的新型免疫增強制劑的開發。本發明的技術目標是開發可增強核酸疫苗的免疫應答水平的製劑。
背景技術：
增強這種新型(核酸)疫苗的佐劑的應用並不十分成功。近來已發現可增強核酸疫苗的新化合物。DNA免疫領域的最初發現之一是明礬不能增強這類疫苗，而明礬是市場上最常用的疫苗佐劑。
DNA直接免疫始於1990年。現在這方面的研究在預防性疫苗領域以及用體細胞的基因治療來治療癌症、感染和代謝性疾病的領域中均得到發展。
與其它疫苗策略相比，DNA疫苗有一些優點。象減毒或重組病毒一樣，質粒載體能激活T-CD8+細胞毒細胞(Wang，B.等1993美國科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)90，4156-4160)，(Xiang，Z.Q.等1994病毒學(Virology)199，132-140)。
一旦接種，DNA能持續數月表達其組成型基因(Wolff，J.A.等1990科學(Science)2471465)。而且，DNA似乎並不對靶細胞致病或誘變，因為大多數質粒以環型、非複製和非整合的形式存在(Wolff，J.A.等1990科學2471465)。既沒有誘導產生抗DNA的抗體(Xiang，Z.Q.等1995，病毒學209569)也沒有在接種部位誘發嚴重炎症反應或其它併發症。而且，質粒DNA易於操作，產生大量高純度質粒也相對便宜(Tsuji，T.等1997歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol.)27782-787)。
儘管所述免疫應答誘導和維持的機制尚不清楚，編碼細胞因子的質粒和編碼共刺激因子的質粒的共接種策略還是得到了成功的應用。已知在該免疫應答中涉及一些其它因素，例如可能影響轉錄率的載體本身的特性(Davis等1993人類基因治療(Hum.Gene ther.)4，151-159)。
目前知道肌細胞能呈遞主要組織相容性系統(MHC)I類分子相關的抗原(Pardoll，D.M.和Beckerrieg，A.M.1995免疫(Immunity)3165)(Cohen，J.，1993科學.2591745)，但這些細胞表達MHC I類和Ⅱ類分子的水平很低。為了有效呈遞抗原，對於在T細胞受體(TCR)與MHC的抗原特異性相互作用之後T細胞的激活和增殖而言，共刺激信號或抗原非依賴性次級信號是必需的(Bluestone，J.A.，1995免疫2555)。
使用編碼共刺激分子B7-1和B7-2的質粒，肌細胞表達的共刺激信號可提高(Hohifeld，R.y Engel，A.G.，1994當代免疫學(ImmunolToday)，15，269)，從而誘導對入侵抗原特異的T細胞更高水平的激活和增殖。應用到腫瘤免疫學時，已證明一些腫瘤的弱免疫原性是由於缺乏共刺激分子引起的。在腫瘤細胞中轉化編碼B7-1或B7-2分子的DNA，大大地增強了抗腫瘤免疫(Townsend，S.E.和Allison，J.P.1993科學，259368)(Gajewski，T.F.，1996免疫學雜誌(J.Immunol.)156465)(Yang，G.等1995免疫學雜誌1542794)。
最近報導，與僅接種病毒抗原基因相比，以相同腺病毒(載體)接種編碼B型肝炎表面抗原(HBsAg)和B7-1分子的基因誘導了更高水平的HBsAg特異的細胞毒性應答(He，X.-S.等1996美國科學院院刊，937274)。還顯示，與僅接種HIV-1質粒DNA相比，編碼B7-1的質粒DNA與HIV-1疫苗DNA共接種增加了HIV-1特異的細胞應答。可以證明，B7-2增加細胞免疫依賴於γ-IFN(Tsuji，T.等1997歐洲免疫雜誌27782-787)。這篇文章顯示共接種B7-1沒有任何增強效果。這種現象可解釋為抗原呈遞細胞(APC)誘導B7-2比誘導B7-1更快(Hathcock，K.S.等1994 J.Exp.Med.180631)，所以最初抗原呈遞優選B7-2。其他作者得到類似的結果，說明CD8+細胞毒性淋巴細胞的應答增強(Kim，J.J.等1997 Nature Biotechnology 15641-646)。
γ-IFN是一種能增強T細胞介導應答、上調MHC決定簇表達的多效細胞因子。用γ-IFN處理培養的成肌細胞增加了T細胞對細胞溶解的易感性，並提供T細胞系增殖的信號。然而，發現將編碼狂犬病病毒G蛋白的質粒和編碼γ-IFN的質粒共接種沒有增加抗病毒免疫應答(Xiang，Z.等1995免疫2，129-135)。
新近研究顯示，γ-IFN的作用依賴於所用啟動子(Xiang，Z.等1997疫苗(Vaccine)15卷(8)896-898)。
粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)也被以質粒的形式共接種(Xiang，Z.等1995免疫2，129-135)。這種細胞因子通過激活或招募專門的抗原呈遞細胞(Heufler，C.等1988 J.Exp.Med.167，700-705)可誘導初級免疫應答(Tao，M.-H.等1994自然(Nature)362，755-758)。
1995年Xiang等證明，將編碼GM-CSF的質粒和編碼狂犬病病毒G蛋白的質粒共接種後，編碼GM-CSF的質粒具有增強抗狂犬病病毒G蛋白的體液免疫應答的效果。二質粒在時間上(數小時)分開接種對狂犬病病毒抗體應答沒有任何效果。這提示個體APC細胞的共轉染或APC細胞與分泌細胞接近是重要因素，顯示了該細胞因子的局部活性(Xiang，Z.等1995免疫2，129-135)。
共接種表達GM-CSF的質粒觀察到抗體應答增強，顯示了GM-CSF對Th細胞應答的初級效果，導致抗原特異B細胞激活的增加。在採用細胞因子依賴性細胞系的實驗中，對IL4的應答缺乏指示，如前所示DNA疫苗主要誘導Th細胞，而且細胞因子GM-CSF增強了這種模式的應答(Xiang，Z.等1995免疫2，129-135)。
IL-12是一種非常重要的免疫調節細胞因子。已顯示，其表達質粒和編碼HIV-1蛋白的質粒共接種，增強了HIV-1特異的細胞介導的免疫。儘管該免疫應答誘導和維持的機制尚不清楚，這種策略還是成功的(Takashi，T.等.1997.免疫學雜誌1584008-4013)。
除了其佐劑特性之外，用IL-12治療HIV-1陽性患者減緩了其向愛滋病發展的進程(Clerici，M.等1993科學2621721)。它還能使一些參數轉為正常，例如自然殺傷細胞(NK)介導的細胞毒活性(Chehimi，J.等1992 J.Exp.Med.175789)。IL-12還抑制CD4+細胞的細胞凋亡(Radrizzani，M.等1995細胞免疫學(Cell.Immunol.)16114)。
在編碼IL-6和血凝素的質粒共施用研究中，用Accell基因槍接種，接種小鼠得到保護免於流感病毒的攻擊。僅接受了表達血凝素質粒的小鼠顯示對病毒攻擊的清除加快，但並不能得到保護而抗感染。在病毒攻擊後共接種小鼠的肺中沒有病毒(Larsen，D.L.等1998病毒學雜誌(J.Virol.)72(2)1704-1708)。
對於基因治療，設計有效的基因導入系統是很重要的。近來研究了編碼卵白蛋白的質粒DNA和微米級大小的聚合物顆粒的結合和穩定性，所述聚合物顆粒包括可生物分解的乳酸和乙醇酸共聚微球、聚DTH碳酸酯(一種假聚胺基酸)和幾乎1微米的聚酯(poliestiren)顆粒。所有這些顆粒的大小和電荷都不相同，它們已用黏膜和胃腸外免疫進行了分析。與接種游離DNA相比，施用連接到顆粒上的DNA能獲得更高水平的應答。用微粒化系統進行鼻內(i.n.)接種在血清中產生了高水平應答(Alpar，H.O.等1997生物化學學會學報(BiochemicalSociety Transactions)25，337S)。
人們已在鼠科動物模型中評價了烏苯美司(UBX)，一種抗癌免疫調節劑，對於抗HIV-1的DNA疫苗的佐劑效應。給balb/c小鼠肌肉共接種UBX產生的IgG抗體應答水平，比沒有共接種UBX的應答水平高103-105倍。該化合物還引起更高水平的特異抗HIV的遲髮型超敏反應(DTH)和細胞毒應答(CTL)。這種再刺激淋巴細胞的細胞因子模式表明，UBX增加IL-2和γ-IFN的水平，降低IL-4的產生。免疫球蛋白亞類分析顯示，以UBX為佐劑的實驗組IgG2a增加，而IgGl和IgE合成降低。由於其弱免疫原性和低毒性，UBX作為DNA疫苗的佐劑應用於臨床是很吸引人的(Sasaki，S.等1998臨床和實驗免疫學(Clinical and Experimental Immunology)111-130-35)。
使用甘露聚糖覆蓋的化學結構如N-叔丁基N』-十四烷胺丙脒(diC14脒)，增強了對編碼HIV-1gp160蛋白基因質粒的抗原特異性免疫應答。diC14的甘露聚糖覆蓋物顯著增加DNA誘導的抗原特異的DTH應答。這種混合物還增強CTL活性。當用體內抗γ-IFN的抗體處理小鼠時上述免疫調節效應被抑制，證明在DNA疫苗產生的細胞免疫的誘導過程中γ-IFN起重要作用。亞類分析和細胞因子模式顯示，與覆蓋甘露聚糖的diC14脒結合的DNA疫苗產生Th1應答(Sasaki，S.等1997歐洲免疫學雜誌27(12)3121-3129)。用編碼HIV-1抗原的質粒作為DNA疫苗通過鼻內(i.n.)和肌內(i.m.)途徑評價了脂多糖衍生物單磷醯脂質A。兩個途徑產生了相似水平的細胞免疫，但鼻內接種的動物腸道分泌IgA比較高。MPL-A增強這兩個途徑的免疫應答(Sasaki，S.等1998傳染病與免疫(Infection and Immunity)66(2)823-826)。
與誘導的應答類型有關的一個重要因素是質粒載體編碼抗原所表達的細胞區室。在一項研究中，能持續誘導中和效價的牛皰疹病毒1D蛋白以分泌、錨定至細胞膜或細胞內的形式表達，結果證明血清轉變(seroconversion)速率不同。用真正形式-細胞膜錨定-的糖蛋白D免疫的小鼠，以及用分泌形式糖蛋白D免疫的小鼠，其血清轉變早於細胞質形式免疫的小鼠。在最初14周中，真正形式免疫的小鼠產生IgG的水平較高。細胞質形式免疫小鼠產生的抗體效價的幾何平均值最低，但在第23周其效價增加，超過真正形式免疫得到的抗體效價。脾淋巴細胞的細胞因子的模式是Th1應答的特徵，它對所有抗原形式均產生γ-IFN。對於分泌形式，ELISA中IgG同種型模式與細胞因子模式不相關(Lewis P.J.等1997疫苗15(8)861-864)。
用卵白蛋白作為抗原模型研究了細胞定位和效率之間的關係。令人吃驚的是，分泌形式產生的抗體效價和CTL應答最高(Boyle J.S.等1997國際免疫學(International Immunology)9，12 1897-1906)。
新近的工作證明，免疫應答的量依賴於免疫途徑。在用DNA和用蛋白質接種的小鼠中，皮內免疫獲得的抗體效價比肌肉免疫途徑高。儘管用DNA免疫得到的IgG水平與用可溶性蛋白免疫類似，但通過肌肉和皮內途徑接種質粒產生的抗卵白蛋白抗體的親抗原性比可溶性蛋白對照分別高100至1000倍。IgG亞類分析證明，肌內途徑接種質粒時IgG2a應答增加，並伴隨γ-IFN產生增加。經i.d.途徑接種可溶性蛋白和DNA時IgG1是主要亞類，同時產生可檢測的IL-4。CTL應答僅在用DNA免疫時才產生。DNA免疫與蛋白質免疫不同，因為DNA免疫能產生很強的CTL應答並且其產生的抗體親抗原性更高，而這兩個參數在疫苗設計中是非常重要的(Boyle J.S.等.1997美國科學院院刊94(26)14626-14631)。
許多天然來源的複雜糖刺激免疫系統和網狀內皮系統的細胞(Davis，S.E.1975 Am.Chem.Soc.Sympos.Series 15，Jeanes A.Hodge J.Eds.Am.Chem.Soc.Washington D.C.)。其中包括植物和真菌中的聚合物如葡聚糖、右旋糖酐和香菇多糖，所有這些都是葡萄糖聚合物，此外還有甘露聚糖，如葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。還發現果聚糖和木聚糖(Tizard，I.R．等1989 Mol.Biother 1290-296)。這些聚糖對巨噬細胞(有葡聚糖和甘露聚糖受體)的活性包括誘導吞噬作用和誘導分泌細胞因子、白三烯和前列腺素。香菇多糖，蘑菇中常見的一種葡聚糖，刺激綿羊紅細胞的細胞應答和抗體應答，而果聚糖則促進B細胞有絲分裂並是巨噬細胞的激活劑(Simon，P.M.1994 Exp.Opin.Invest.Drugs 3(3)223-239)。醋孟南是一種由甘露糖組成的甘露聚糖，其中每10個殘基大約有8個殘基被氧乙醯化。它作為歷來使用的藥用植物翠葉蘆薈(Aloe barbadensis Miller)葉中的粘液物質或膠的主要成分而被抽提出來。不同體外實驗提示，甘露聚糖激活單核細胞和巨噬細胞，誘導產生γ-IFN、腫瘤壞死α因子、GM-CSF、IL-1β和IL-6(Peng，S.Y.等1991 Mol.Biother.379-87)。醋孟南增強細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的產生(Womble，D.等1988 Int.J.Immunopharmacol．10967-974)和自然殺傷(NK)細胞的細胞毒活性(Marshall G.D.等1993，免疫學雜誌(第Ⅱ部分)150摘要1381)，還輕微增強體外人同種異體反應(alloresponse)。
細胞毒活性和γ-IFN分泌的增加使得醋孟南可用於抗病毒和抗腫瘤治療。其抗逆轉錄病毒活性在患有貓白血病(feline leukemia)的動物中得到證實(Sheets，M.A.等1991 Mol.Biother.341-45)。愛滋病和癌症患者的臨床實驗目前正在進行。
最近有幾個專利申請描述了將醋孟南用作疫苗佐劑(McAnalley，B.H.EP0619117 A2)，(Nordgrem，R.M.WO93/14195)，(Aguilar，J.C.等CU27/1997)，但將醋孟南用於含有DNA作為抗原的疫苗製劑或任何含有特定核酸的製劑，則沒有任何報導。
DNA疫苗的一個主要問題是產生抗體很少。解決這個問題的最常見方法是向肌肉導入誘導壞死的化合物，幾天後將DNA接種至再生肌肉中。在正常肌肉中導入DNA後產生的應答不如在再生肌肉中導入DNA產生的應答好，因而要在傳統接種疫苗面前使DNA疫苗成為一種現實的策略，還需要在這方面進行實用性的開發(Davis，H.L.等1994疫苗12(16)1503-1509)。
本發明的詳細描述在本發明中我們第一次報導了一種疫苗製劑，其主要成分是適當比例的醋孟南多糖和核酸疫苗。
由於混合兩種成分後產生的免疫應答增強，所以這種製劑是新型的。
這些結果支持將具更高水平免疫原性的醋孟南-核酸疫苗製劑應用於免疫預防和免疫治療疾病，所述疾病優選由細胞內病原體和癌症引起。
目前，醋孟南這種潛能所涉及的機制尚不清楚。一個提議的機制涉及具有對病原體表面呈現的抗原模式特異的特異受體的巨噬細胞和樹突狀細胞。由於其化學引誘物的特性，在接種部位可產生很強的單核細胞增多(monocytemia)。
由於醋孟南的粘稠性，它成了在接種部位增加抗原持久性的有效載體。我們不排除醋孟南的其它活性，如誘導細胞因子、激活吞噬作用機制和招募增加抗原呈遞活性的免疫系統不同細胞群體。
根據物種不同，本發明製劑的給藥對象可用10μl-5ml體積和0.001-5mg劑量的核酸免疫。醋孟南劑量範圍是在最終疫苗製劑中總己糖濃度0.001mg/ml-0.5mg/ml，相當於凍乾重量0.01-5mg/ml的範圍。
新一代佐劑醋孟南的低反應原性以及抗醋孟南的T非依賴性應答，是這種製劑的十分吸引人的特徵。
結果用student t檢驗處理p＜0.05則認為差異顯著。
結果說明，採用醋孟南和pCMVβgal，可獲得增強的抗體應答，其效價顯著高於接種溶於PBS的質粒所得到的應答。一般地，腹膜內接種組(組4和5)的效價顯著高於組2和3的效價。第45天加入草酸鈣至濃度0.5mg/ml(組4)時產生的差異沒有保持到第90和120天(

圖1)。
接種質粒是在沒有肌肉壞死或對肌肉預處理的情況下進行的。這就解釋了在接種溶於PBS的pCMVβgal後為什麼抗體效價如此之低(組1)。
結果的統計分析用Student t檢驗進行p＜0.05則認為差異顯著。
結果說明，醋孟南可成功地與pCMVβgal一起配製和使用。當兩種製劑均經肌肉接種時，與施用溶於PBS的等量DNA(圖2)相比，組1(含醋孟南)產生了更高的抗體效價。
我們既沒有使用預先處理的肌肉也沒有使用任何引起壞死的物質在免疫的小鼠肌肉中誘導任何再生狀態。
結果的統計分析用Student t檢驗進行p＜0.05則認為差異顯著。
結果顯示，使用醋孟南製劑(每劑0.35mg／ml acem.+100μg質粒)兩種途徑得到的抗CR2抗體應答均顯著優於接種溶於PBS的質粒所獲得的應答(組2)。
我們既沒有使用預先處理的肌肉也沒有使用任何引起壞死的物質在免疫的小鼠肌肉中誘導任何再生狀態。
結果的統計分析用Student t檢驗進行p＜0.05則認為差異顯著。
結果顯示，在最後一次接種的15天之後，pCMVβgal質粒DNA-Opc蛋白質複合物和醋孟南一起使用時的血清抗β-半乳糖苷酶IgG抗體應答高於僅接種這種複合物時的抗體應答。
圖2.三個劑量的時間表(第0、15和30天)。在第45天取血樣。兩組均經肌肉途徑接種體積為100μl的100μg質粒。
圖3.五個劑量的時間表(第0、21、44、64和76天)。在第92天取血樣。所有組別均接種體積為100μl的100μg質粒。免疫途徑是肌肉途徑(i.m.)(第1-3組)和腹膜內途徑(i.p.)(第4和5組)。
圖4.四個劑量的時間表(第0、14、28和42天)。在第56天取血樣。通過肌肉和鼻內途徑分別給小鼠接種體積為100μl和50μl的100μg質粒。
權利要求
1．一種核酸和醋孟南的疫苗製劑，其特徵在於所述核酸在抗原投送系統中是游離的、被吸附的或被包裹的，其中醋孟南增強免疫應答。
2．根據權利要求1的核酸和醋孟南疫苗製劑，其特徵在於醋孟南劑量變化範圍是0.01-5ml最終疫苗製劑中總己糖濃度0.001mg/ml-0.5mg/ml，相當於凍乾重量0.01-5mg/ml。
3．根據權利要求1的核酸和醋孟南疫苗製劑，其特徵在於所述核酸的劑量範圍是0.001-5mg。
4．根據權利要求1的核酸和醋孟南疫苗製劑，其為治療產品。
5．根據權利要求1的核酸和醋孟南疫苗製劑，其為預防產品。
6．根據權利要求1的核酸和醋孟南疫苗製劑，其用於全身給藥。
7．根據權利要求1的核酸和醋孟南疫苗製劑，其用於黏膜給藥。
全文摘要
本發明涉及醫學領域,具體涉及含有疫苗抗原的新型佐劑製劑。準確地說,本發明追求的技術目標是開發能增加和/或調節生物對核酸疫苗的免疫應答的製劑。為此,本文開發了一種主要成分為適當比例的DNA和醋孟南的製劑。本發明的製劑可用於製藥工業作為人和獸醫的疫苗製劑。
文檔編號A61K39/21GK1287493SQ99801915
公開日2001年3月14日 申請日期1999年9月3日 優先權日1998年9月7日
發明者J·C·阿桂拉魯比多, V·L·穆茲奧岡薩萊茲, G·E·桂蘭尼託, E·潘頓阿里阿司, M·D·J·裡爾安古羅, D·皮查多迪阿茲, E·伊格雷西亞斯皮萊茲, A·赫萊拉布赫, B·桑德茲奧昆多, A·穆薩奇歐拉薩, D·昆塔納瓦茲奎司, L·克羅姆貝特曼南戴茲 申請人:遺傳工程學和生物工藝學中心