亞鐵離子診斷/測定試劑盒及亞鐵離子濃度測定方法
2023-07-08 02:31:21 1
專利名稱：亞鐵離子診斷/測定試劑盒及亞鐵離子濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定 亞鐵離子濃度的方法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
技術背景鐵和總鐵結合力在人體代謝過程中極為重要。鐵是人體正常生理過程中不可缺少的物質。人體含鐵約3 5g，其中70%存在於紅細胞血紅蛋白 中；25%分布在單核巨噬細胞系統(即網狀內皮系統，肝、脾、骨髓中鐵 蛋白和含鐵血黃素)；4. 9%分布於肌紅蛋白、細胞色素、含鐵的酶；0. 1 %為循環血槳中的鐵。人體內的鐵來源於食物，主要在十二指腸和小腸上部被吸收。體內鐵 以鐵蛋白和含鐵血黃素形成貯存在骨髓、脾和肝臟內。有少量鐵與血漿轉 鐵蛋白結合，通過血漿輸送至各組織，被利用或被貯存。血清鐵的測定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。後者由於靈 敏度不高及基底的幹擾，比分光光度法可靠性差。分光光度法應用一類含 -N-C-C-N-結構的生色原，與亞鐵形成五元環，產生紫紅色。較早使用的 有聯吡啶和紅移菲羅啉；近來多推薦靈敏度較高的亞鐵嗪。此外，尚有應 用鉻天青S與高鐵的反應。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定亞鐵離子濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的亞鐵離 子診斷/測定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行亞鐵離子濃度測定，而且測定速度快、準確度高， 因而可以得到切實的推廣應用。本發明亞鐵離子濃度測定方法原理如下順烏頭酸+水 烏頭酸酶 檸檬酸檸檬酸檸檬酸裂解酶乙酸+草醯乙酸草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶 L-蘋果酸+輔酶 這種方法應用需要亞鐵離子激活的烏頭酸酶(aconitase ; EC4.2丄3) 酶(偶)聯檸檬酸裂解酶(citrate lyase ; EC4丄3.6)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase ; EC Ll.1.37)酶促反應速率比色法。烏頭酸酶在亞鐵離 子激活下酶解順烏頭酸產生檸檬酸，再通過(偶)聯合檸檬酸裂解酶、蘋 果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成 為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm 處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算 亞鐵離子的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明亞鐵離子診斷/測定 試劑盒較為理想緩衝液 100mmol/L穩定劑 還原型輔酶500 mmol/L0.25 mmol/L順烏頭酸 烏頭酸酶10 mmol/L 6000 U/L 12000 U/L蘋果酸脫氫酶 18000 U/L本發明的亞鐵離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液 體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、順烏頭酸。 試劑2緩衝液、穩定劑、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加 水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1試劑2緩衝液、穩定劑、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶。 試劑3緩衝液、穩定劑、烏頭酸酶。還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在 試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在 使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定亞鐵離子濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 還原型輔酶 順烏頭酸 烏頭酸酶檸檬酸裂解酶 12000 U/L蘋果酸脫氫酶 18000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使 用前，加入純淨水，復溶後使用。500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 6000 U/L在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸 光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離子樣 品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間 大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的 濃度大小。 實施例二本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液穩定劑還原型輔酶順烏頭酸100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L烏頭酸酶 6000 U/L檸檬酸裂解酶 蘋果酸脫氫酶12000U/L18000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離子樣 品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)， 延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的 濃度大小。 實施例三本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 10Ommol/L 穩定劑 50 mmol/L還原型輔 順烏頭酸0.25 mmol/L10 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L檸檬酸裂解酶12000U/L18000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑100mmol/L500 mmol/L烏頭酸酶6000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。測定亞鐵離子濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37-C，反應 時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測亞鐵離子樣品與試劑1 、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3 分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的 濃度大小。申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類 同，不另一一例舉。總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的亞鐵離子濃度測定方法，其方法原理如下順烏頭酸+水烏頭酸酶檸檬酸檸檬酸檸檬酸裂解酶乙酸+草醯乙酸草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶L-蘋果酸+輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出亞鐵離子的濃度大小測定結果。
2. —種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩衝液 20——500 mmol/L穩定劑 l一 4000mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L順烏頭酸 1——50mmol/L烏頭酸酶 1000——80000 U/L檸檬酸裂解酶 1000——80000 U/L蘋果酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也 可以配製成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特徵在於-由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、擰檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、梓檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑、還原 型輔酶、順烏頭酸組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、烏頭酸酶、檸 檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、 檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑、還原 型輔酶、順烏頭酸組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、檸檬酸裂解酶、 蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、烏頭酸酶組成。還 原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包 括穩定劑14000 mmol/L或0.in/。-100。/c)體積比。所述穩定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定亞鐵離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑混合，使之發生酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101324622SQ20071002338
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司