改良的噬菌粒表達載體的製作方法
2023-07-07 11:59:46
專利名稱:改良的噬菌粒表達載體的製作方法
技術領域:
本發明涉及分子生物學和抗體工程等領域。更具體地,涉及一種改良的用於噬菌體展示法篩選單鏈抗體中的噬菌粒表達載體。
背景技術:
抗體作為疾病預防、診斷和治療的製劑已有上百年的發展歷史。早期製備抗體的方法是將某種天然抗原經各種途徑免疫動物,成熟的B細胞克隆受到抗原刺激後,將抗體分泌到血清和體液中。
實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物,因此稱之為多克隆抗體。多克隆抗體是人類有目的利用抗體第一步。多克隆抗體的不均一性,限制了對抗體結構和功能的進一步研究和應用。
雜交瘤技術的誕生被認為是抗體工程發展的第一次質的飛躍,也是現代生物技術發展的一個裡程碑。利用這種技術製備的單克隆抗體在疾病診斷、治療和科學研究中得到廣泛的應用。這種單克隆抗體多是由鼠B細胞與鼠骨髓瘤細胞經細胞融合形成的雜交瘤細胞分泌的,具有鼠源性,進入人體會引起機體的排異反應;完整抗體分子的分子量較大,在體內穿透血管的能力較差;生產成本太高,不適合大規模工業化生產。在80年代初,抗體基因結構和功能的研究成果與重組DNA技術相結合,產生了基因工程抗體技術。
抗體工程技術的發展,即將鼠源單克隆抗體改造為人源化抗體,或者直接產生人源抗體,大大減少鼠源抗體帶來的副作用如人抗鼠抗體反應等,有利於臨床應用。目前,人源化或人源抗體的產生主要採用三種方法(1)鼠源抗體改造用人類抗體的Fc段和部分Fab替換鼠源抗體片段,減少小鼠來源的片段,以減輕人類對抗體的不良反應;(2)轉基因方法將人類抗體基因轉移至小鼠,免疫動物後產生人類抗體;(3)噬菌體展示技術是近年發展的新方法,利用噬菌體的特性篩選抗體可以直接篩選人源抗體,該方法利用人抗體基因構建含有VH和VL的組合文庫,以噬菌體表面顯示系統篩選抗原特異性人源抗體。它以細菌克隆取代了B細胞克隆,被譽為抗體技術的革命性進展。
上述三種方法各有利弊。前二種方法能篩選高親和力抗體,但費用大,不易操作,第三種方法操作簡便、花費少,但親和力有時較低。
採用噬菌體抗體庫技術篩選抗體不必進行動物免疫,易於製備稀有抗原的抗體、篩選全人源性抗體和高親和力抗體。噬菌體抗體庫技術是生命科學研究的突破性進展之一,同時也將抗體工程的研究推想了一個新的高潮。
噬菌體選擇方法對於抗體或短肽的分離都不受限制,而且適用於其它具有生物活性的分子的研究,如細胞因子、受體、酶底物、酶抑制劑、抗體酶、DNA結合蛋白、構建具有特異性結合分子的受體域、以及纖維素結合域等。據報導,抗體的支架不同可形成用於各種類型分子的合適的結合配體,而且許多例子可說明,宿主支架可容納許多有效的可調節一些合適的置換的區域,(可根據這點製備局部變化的庫),這些支架包括β-摺疊蛋白、α-螺旋束蛋白、這兩個蛋白的組合、以及綠色螢光蛋白(GFP)和纖維素結合域等。
目前常用於構建人源噬菌體展示單鏈抗體文庫所用的噬菌粒表達載體為pHEN-2。然而,該載體在使用過程中常常會有相當比例的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產物因為種種未知因素而無法有效地插入單鏈抗體庫。
因此,本領域迫切需要開發能夠更有效地用於構建人源噬菌體展示單鏈抗體文庫的新的噬菌粒表達載體。
發明內容
本發明的目的就是提供一種能夠更有效地用於構建人源噬菌體展示單鏈抗體文庫的新的噬菌粒表達載體。
在本發明的第一方面,提供了一種噬菌粒表達載體,它是改良的pHEN2載體,其中pHEN2中多酶切位點中的ApaL1酶切位點被去除或被BssH II酶切位點置換。
在另一優選例中,pHEN2中多酶切位點中的ApaL1酶切位點被BssH II酶切位點置換。其中,所述的ApaL1酶切位點是GTGCAC,所述的BssH II酶切位點是GCGCGC。
在另一優選例中,所述表達載體的多酶切位點的序列如SEQ ID NO1所示。
在本發明的第二方面,提供了一種本發明上述改良的pHEN2的噬菌粒表達載體的用途,它被用於通過噬菌體展示法篩選單鏈抗體。
圖1顯示了噬菌粒表達載體pHEN2多酶切位點圖譜。
圖2顯示了將ApaL1酶切位點用BssH II酶切位點置換的示意圖。
具體實施例方式
本發明人經過研究發現,pHEN-2噬菌粒載體在使用過程中常常會有相當比例的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產物無法有效地插入單鏈抗體庫的一個主要原因是存在ApaL1酶切位點。通過消除ApaL1酶切位點,就可顯著提高人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產物插入單鏈抗體庫的效率。
根據對已知免疫球蛋白可變區基因序列的統計結果,本發明人發現部分輕鏈可變區VL中存在限制性酶切位點ApaL I,該位點在群體中的出現頻率4/162=6.45%(表1)。
表1 被切割的功能片段數目
統計發現,而ApaL I又是有些人偏愛使用的一種酶。如果輕鏈文庫的克隆過程中使用ApaL I酶便會不可避免的破壞部分VL基因序列的完整性,從而導致部分RT-PCR人免疫球蛋白輕鏈基因編碼產物無法插入單鏈抗體庫,使終庫容有所下降。
一種對pHEN-2噬菌粒載體進行改造的方法是消除ApaL I酶。
在另一優選例中,對pHEN-2噬菌粒載體進行改造的方法是用限制性酶切位點BssH II替換ApaL I酶的酶切位點。本發明人對現有的用於構建噬菌體展示單鏈抗體文庫的噬菌粒表達載體pHEN-2進行改造,利用第三位密碼子的擺動性,在保證編碼胺基酸不發生改變的前提下,通過PCR引物引入兩個鹼基的定點突變,從而將限制性酶切位點ApaL I更改為在免疫球蛋白資料庫中未見出現的限制性酶切位點BssH II(圖2),從而進一步優化了輕鏈文庫的克隆及鑑定條件,從而儘可能保證了所構建的單鏈抗體文庫的多樣性,提高了實際庫容量。
可用於本發明的定點突變技術是本領域中很常規的一種技術,有許多文獻對定點突變技術有描述。
本發明的主要優點在於,能夠使更多的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產物有效地插入單鏈抗體庫,從而儘可能保證了所構建的單鏈抗體文庫的多樣性,提高了實際庫容量。本發明人成功地利用此改造質粒構建了滴度為109的非免疫人源單鏈抗體文庫。
下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1對pHEN-2的酶切位點的改造噬菌粒表達載體pHEN2是本領域一種常用的噬菌粒表達載體(購自英國劍橋大學MRC中心),其多酶切位點圖譜如圖1和SEQ ID NO1所示。
試驗方法合成以下引物ForwardGCTGCAGGTCGACCTCGAGTG(SEQ ID NO3)
ReverseATCGAGCTCCTGCAGTTGGACCTGCGCGCTACCGCCAGAGCCACCTC(SEQ ID NO4)以pHEN2為模板,用以下方法將pHEN-2酶切位點改造為BssH II酶切位點。
利用上述引物進行PCR,將所獲得的PCR產物及pHEN2質粒分別用限制性內切酶Sac I和Nco I進行酶切,將兩者連接轉化後,抽提質粒,經DNA測序驗證原pHEN2質粒中的Apa I位點已改造成為BssH II位點。
結果通過定點突變的方法,獲得了pHEN-2的酶切位點(GTGCAC)改造為BssH II酶切位點(GCGCGC)的改良的噬菌粒表達載體,其中酶切位點的改造對編碼的胺基酸序列無影響。改造的多酶切位點的序列如SEQ ID NO2所示。
實施例2構建人源單鏈抗體文庫用常規方法合成了五十多條可用於擴增人抗體重鏈和輕鏈可變區的PCR引物,提取了四個人胎肝和胎脾以及一份人骨髓細胞和15個健康成人的外周血淋巴細胞的mRNA;採用RT-PCR方法,分別以針對免疫球蛋白不同家族的引物,從中擴增抗體重鏈和輕鏈可變區基因;先後克隆入改造的噬菌粒表達載體中,經數百次電轉化,構建了人源單鏈抗體文庫,其中分別採用pHEN-2(對照)和實施例1中製備的改良的pHEN-2。然後,梯度稀釋噬菌體抗體庫並感染對數生長期的E.coli TG1菌液,塗LB氨苄平板,37℃過夜,利用菌落記數法測定文庫的滴度。
結果表明,用改造的pHEN-2質粒構建的非免疫人源單鏈抗體文庫的滴度為109,而對照(未改造的pHEN-2)是5×106。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之後,本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海人類基因組研究中心120改良的噬菌粒表達載體1300363391604170PatentIn version 3.12101211369212DNA213人工序列220
221misc_feature223pHEN-2的多酶切位點4001ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcaaa ttctatttca 60aggagacagt cataatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactcg120cggcccagcc ggccatggcc caggtgcagc tgcaggtcga cctcgagtgg tggaggcggt180tcaggcggag gtggctctgg cggtagtgca caggtccaac tgcaggagct cgatatcaaa240cgggcggccg cacatcatca tcaccatcac ggggccgcag aacaaaaact catctcagaa300gaggatctga atggggccgc atagactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc tcatacagaa360aattcattt3692102211369212DNA213人工序列220
221misc_feature223改造的pHEN-2的多酶切位點4002ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcaaa ttctatttca 60
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221misc_feature223引物4003gctgcaggtc gacctcgagt g 21210421147212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4004atcgagctcc tgcagttgga cctgcgcgct accgccagag ccacctc 4權利要求
1.一種噬菌粒表達載體,其特徵在於,它是改良的pHEN2載體,其中pHEN2中多酶切位點中的ApaL1酶切位點被去除或被BssH II酶切位點置換。
2.如權利要求1所述的表達載體,其特徵在於,pHEN2中多酶切位點中的ApaL1酶切位點被BssH II酶切位點置換,其中所述的ApaL1酶切位點是GTGCAC,所述的BssH II酶切位點是GCGCGC。
3.如權利要求1所述的表達載體,其特徵在於,所述表達載體的多酶切位點的序列如SEQ ID NO1所示。
4.如權利要求1所述的噬菌粒表達載體的用途,其特徵在於,用於通過噬菌體展示法篩選單鏈抗體。
全文摘要
本發明公開了一種改良的用於噬菌體展示法篩選單鏈抗體中的噬菌粒表達載體,它是改良的pHEN2載體,其中pHEN2中多酶切位點中的ApaL1酶切位點被去除或被BssH II酶切位點置換。改良的pHEN2噬菌粒表達能夠使更多的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產物有效地插入單鏈抗體庫,從而儘可能保證了所構建的單鏈抗體文庫的多樣性,提高了庫容量。
文檔編號G01N33/577GK1618974SQ200310108759
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優先權日2003年11月21日
發明者張新, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心