一種巴曲酶及其製備方法與專用編碼基因的製作方法

2023-07-23 20:58:26 2

專利名稱：一種巴曲酶及其製備方法與專用編碼基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種巴曲酶及其製備方法與專用編碼基因。
背景技術：
1963年，Klobusitzi和Konig從美洲矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶，即巴曲酶。迄今為止，已得到三十多種類凝血酶的全部和部分胺基酸序列，它們的一級結構非常相似，這些凝血酶都能夠酶切哺乳動物的血漿纖維蛋白原，使之轉變為纖維蛋白，從而影響動物的出血-凝血過程。在這些蛇毒類凝血蛋白酶中，尤其對巴曲酶和安克洛(Ancrod)的物理、化學性質與臨床應用，研究的較為清楚(Stocker K andBariow G.H.Methods Enzymol.1976，45214-223)。
巴曲酶的特異性作用底物是纖維蛋白原，與凝血酶不同的是，它只切割纖維蛋白原的A鏈，而不作用B鏈。當它水解血漿纖維蛋白原A鏈中的Arg16-GLy17位鍵時，能夠釋放出纖維蛋白肽A，從而快速地將血液中的纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，接著這些纖維蛋白就能聚集成疏鬆的易於被纖維蛋白酶水解的血栓來封閉傷口，實現快速止血的功效。在使用較大劑量的時侯，巴曲酶有降低血中纖維蛋白原濃度，改善血液黏度和血液的流體力學特性，從而起到降纖酶的功效(Pirkle H and Stocker K.Thromb Haemost.1991，65444-450；MarshN.A.Blood Coagul Fibrinolysis.1994，5339-410)。基於這樣一些生物化學特性，巴曲酶已經被成功地開發成止血藥和降纖藥。有高效止血功能的製劑(國外商品名Reptilase，中文譯名「立止血」，另外還含有凝血因子X激活物)；有降纖作用的製劑(國外商品名Defibrase，中文譯名「降纖酶」)。在歐洲，巴曲酶正在替代人凝血酶作為止血藥物。
目前在我國上市7種蛇毒毒液中分離純化的類凝血酶製劑。臨床使用歷史最悠久的類凝血酶是巴曲酶和馬來西亞紅口蝮蛇(A.rhodostoma)蛇毒的安克洛。國內有五步蛇毒祛纖酶、東北白眉蝮蛇抗栓酶(清栓酶)、江浙蝮蛇抗栓酶和『立止血』仿製品『巴曲亭』(該藥(保護期為2001.8.21-2007.8.21也是從蛇毒中提取製備而成)等用於臨床。但是從蛇的毒液中提取巴曲酶的生產成本太高。
巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈，但是巴曲酶分子中有12個半氨酸，形成六種分子內二硫鍵；還有糖基化修飾，其分子內有兩個N-糖基化位點Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr227。成熟的巴曲酶分子是由231個胺基酸殘基組成的單鏈蛋白，理論計算出其分子量為25.5kD，等電點為7.39，國外從B.atrx.moojuni毒液中生物提取的巴曲酶的實際分子量為42kD，這種分子量的偏差是由於糖基化修飾緣故。此外，B.atrox的其它亞種以及其它種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不過其分子量從29kD到42kD不等，這也是由於不同亞種之間胺基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。雖然研究者對巴曲酶的性質有了比較多的了解，但是，對這種蛇毒成分的分子生物學研究一直進展緩慢。1991年，日本科學家Maeda等首次利用重組DNA技術得到了B.atrox moojenii類凝血酶的基因，並克隆到大腸桿菌中獲得融合表達(MAEDA M，SATOH S，SUZUKI S，et al.J Biochem.1991，109632-637)。2002年，楊青等報導長白白眉蝮類凝血酶Gussruobin和大連蛇到蝮類凝血酶Gloshedobin在畢氏酵母中獲得表達(楊青，胡學軍，許小明，等.生物化學與生物物理學報.2002，34(1)6-10)。2004年，K.H.Chung等亦是採用畢氏酵母表達B.atrox.moojuni的巴曲酶，具有與天然巴曲酶相同的生物學活性，純化後產量達到6.95μg/ml(Weon-Kyoo You，Kwang-Hoe Chung，et al.FEBS.2004，57167-73)。2004年，中國的黃秀東等(中國專利公告號為CN1534093)採用畢氏酵母表達B.atrox.moojuni的巴曲酶，純化後產量達到20KU/ml。
採用基因工程的手段生產富含二硫鍵和糖基化修飾的蛋白一直都是一個技術難題，尤其是生產有多對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶類分子。這是因為二疏鍵配對錯誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體。真核細胞表達系統(酵母、CHO和昆蟲細胞等)中能保證較高二硫鍵配對正確率。在真核生物中分泌蛋白的摺疊和組裝是在內質網(endoplasmicreticulum，ER)上完成的，在內質網上有許多分子伴侶(molecular chaperone)。分子伴侶的概念為在生物大分子的摺疊(folding)、組裝(assembly)、轉運及降解等過程中起協助作用，參與協助抗原的呈遞和遺傳物質的複製、轉錄及構象的確立；參與細胞周期調控、抗衰老、凋亡調控等，但自身並不發生任何變化的一大類廣泛存在於生物體內的蛋白質分子。如結合蛋白(Kar2p，binding protein，Bip)，它能夠識別內質網蛋白的信號序列(signal sequence)；Bip蛋白還具有ATP酶活性，能夠水解ATP提供其作用於蛋白質摺疊所需的能量；蛋白二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)可輔助二硫鍵的正確配對。

發明內容
本發明的目的是提供一種巴曲酶及其製備方法與專用編碼基因。
本發明所提供的製備巴曲酶的專用基因，具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列2經替換1-3個鹼基，編碼相同功能蛋白的核苷酸序列；3)在1)所述序列的5′端連接IL-2信號肽基因序列得到的核苷酸序列。
4)在高嚴謹條件下可與1)、2)或3)所述序列的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述高嚴謹條件為雜交後用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
所述IL-2信號肽基因的核苷酸序列為自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸。
所述編碼基因具有下述的核苷酸序列之一
1)序列表中序列2；2)序列表中序列4；3)序列表中序列6；4)序列表中序列8。
本發明所提供的製備巴曲酶的方法，是將上述的編碼基因通過真核表達載體導入酵母菌或哺乳動物細胞系中表達，獲得巴曲酶蛋白。
所述方法中，所述酵母菌可為畢赤酵母，優選為畢赤酵母GS115/His-。
所述哺乳動物細胞係為CHO細胞系。
當所述編碼基因導入酵母菌中時，所述真核表達載體為pPIC9；當所述編碼基因導入哺乳動物細胞系中時，所述真核表達載體為pcDNA3.1。
所述編碼基因導入酵母菌發酵表達所用發酵培養基含有山梨醇和大豆蛋白腖。所述編碼基因導入酵母菌發酵表達的方法優選為在30℃，pH5.0，在基礎培養基終發酵20小時後，按0.8ml/min加入5％甘油100ml，飢餓30分鐘，再加入3g大豆蛋白腖，調pH至6.9，按0.2ml/min加入含0.2％體積山梨醇的甲醇誘導培養90小時；所述基礎培養基為40g/L甘油，18g/L K2SO4，15g/L MgSO4.7H2O，4.13g/L KOH，0.9g/L CaSO4.2H2O，13.3mL/L H3PO4。
所述方法還包括將表達獲得的巴曲酶蛋白進行純化。其中，酵母表達巴曲酶的純化方法為將發酵上清液加入2M硫酸銨鹽等預處理後，先經過疏水層析介質(STREAMLINETMPhenyl)，再經過陽離子交換介質(SP SepharoseTMFF)和肝素瓊脂糖凝膠FF介質(HeparinSepharose FF)，最後再進行一步凝膠過濾層析(SephacrylS-100)就可以製備出巴曲酶純品。
上述的方法製備的巴曲酶蛋白也是本發明的保護範圍。
所述巴曲酶蛋白的核苷酸序列是1)序列表中序列1；2)序列1的氨基端第59位Ala突變為Arg的胺基酸序列(序列表中序列5)；3)序列1的氨基端第128位Thr突變為Arg的胺基酸序列(序列表中序列7)；4)序列1的氨基端連接IL-2信號肽的胺基酸序列(序列表中序列3)；所述IL-2信號肽的胺基酸序列為自GENBANK號為NP_000577的氨基端第1-20位胺基酸序列。
本發明選擇酵母和CHO細胞都喜好的遺傳密碼子，人工合成了巴曲酶全長基因序列，將該基因分別插入到Pichia pastoris的分泌型表達載體pPIC9類載體和CHO細胞的表達載體pcDNA3.1中進行分泌表達，成功地表達出了生物學活性高的巴曲酶蛋白。通過優化發酵過程中的一系列條件，如加入一定量的山梨醇(有利於酵母產生更多的基礎蛋白包括分子伴侶，糖基化酶等)和大豆蛋白腖(可以延緩分泌蛋白的降解)，純化後產量達到每毫升發酵液10μg/ml或14巴曲酶單位(14BU/ml)，比活性為1400BU/mg。這一產量超過了其它已發表和報導的表達水平，適合規模化生產。
本發明的方法利用上述製備巴曲酶的專用基因，由酵母、CHO細胞產生的糖基化的巴曲酶、突變的巴曲酶，它們具有使含抗凝劑的動物血漿凝結的特性；所說的抗凝劑包括肝素、EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、水蛭肽和水蛭素等；本發明的方法生產的巴曲酶的胺基酸序列(SEQ-1)與Bothrops atrox moojeni毒液中巴曲酶(Batroxobin)胺基酸序列相同或者突變了幾個胺基酸，但其分子的糖基化修飾具有酵母或哺乳動物細胞的特點，且這類修飾是其生物活性所必須的；並且用本發明的方法在酵母中表達該巴曲酶，可以利用酵母的α-信號肽，其中信號肽序列與巴曲酶蛋白之間插入了KEX2蛋白酶識別序列，可以使表達的蛋白經KEX2蛋白酶切後具有與自然的巴曲酶同樣的N端。
本發明的方法製備的巴曲酶和突變的巴曲酶可作為一種止血藥的主要成分，也可以直接作為降纖維藥之用。


圖1為巴曲酶基因表達載體pPIC9-BG0的構建圖2為巴曲酶突變體基因(圖中均用BGm表示BGm1、BGm2、BGm3、BGm4)表達載體pPIC9-BGm1、pPIC9-BGm2、pPIC9-BGm3、pPIC9-BGm4(圖中均用pPIC9-BGm表示)的構建流程3為pPIC9-BG0轉化GS115後菌落PCR鑑定結果圖4為BG0表達的巴曲酶蛋白的不同發酵時間(0-90小時)的SDS-PAGE電泳圖譜圖5為BG0表達的巴曲酶蛋白的疏水層析介質分析圖譜(STREAMLINETMPhenyl)圖6為BG0表達的巴曲酶蛋白的陽離子交換介質分析圖譜(SP SepharoseTMFast Flow)圖7為BG0表達的巴曲酶蛋白的肝素瓊脂糖凝膠FF介質(Heparin Sepharose FF)分析圖譜圖8為BG0表達的巴曲酶蛋白的凝膠過濾層析圖譜(SephacrylS-100)圖9為BG0在酵母中表達的巴曲酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖10為BG0表達的巴曲酶蛋白的分子量質譜11為CH0表達的巴曲酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖12為巴曲酶(2 NIH Units/kg)對小鼠出血時間的影響具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、重組巴曲酶基因BG0的合成及其表達巴曲酶的效果檢測1、重組巴曲酶基因BG0的獲得及表達載體的構建
1)重組巴曲酶基因BG0的獲得根據Genebank中公開的巴曲酶(GENBANK Accession Number為X12747)的胺基酸序列資料，選擇酵母和CHO細胞都能較喜好的遺傳密碼子，人工合成了重組巴曲酶全長基因序列(具有序列表中序列2的核苷酸序列)。為使目的基因能插入pPIC9載體，在巴曲酶基因(Batroxobin Gene，BG)(GENBANK Accession Number為X12747自5′端第1-693位核苷酸)的5′-端添加限制酶XhoI的切點，3′-端添加TAA終止密碼以及EcoRI切點，另在XhoI切點與巴曲酶蛋白N-端第一個胺基酸Val密碼子之間加入KEX2蛋白酶識別序列Lys-Arg對應的密碼子AAA AGA，這就確保目的蛋白在分泌到發酵上清液中時能夠順利地切除a-信號肽序列，使工程菌表達的巴曲酶具有同蛇毒中提取的該蛋白一樣的N-端胺基酸序列。設計重組巴曲酶全長基因的核苷序列與Genebank Accession Number為X12747和黃秀東等合成的巴曲酶基因核苷酸序列(中國專利公告號為CN1534093)分別有18.9％和15.9％的差異。
基因的拼接過程採用遞歸式PCR(Recursive PCR)方法，具體方法為將整個基因分成相臨重疊的12個片段進行合成，具體如下T15′-CTCGAGAAAAGAGTCATTGGAGGTGATGAATGTGACATCAACGAACACCCTTTCCTTGCCTTCATGTACTACTCTCCACG-3′；T25′-CAGTGTGCAGCGGTCAGGACCCATTCCTGGTTGATCAAAGTCATACCACAGAAGTAACGTGGAGAGTAGTACATGAAGGC-3′；T35′-CCTGACCGCTGCACACTGTAACAGAAGATTTATGCGTATCCACCTTGGTAAGCACGCCGGATCTGTCG-3′；T45′-CTTATTAGGACAAATGAACTTCTCCTTTGGGTATCTAACGACCTCATCGTAGTTGGCGACAGATCCGGCGTGC-3′；T55′-GGAGAAGTTCATTTGTCCTAATAAGAAGAAAAACGTCATTACCGACAAGGACATTATGTTGATCAGACTGGACAGACCTG-3′；T65′-CAACACTTGGAGGGTTGGAAGGCAAAGAGAGAGGAGCGATGTGTTCGGAGTTTTTGACAGGTCTGTCCAGTCTGATCAAC-3′；T75′-CCAACCCTCCAAGTGTTGGTTCCGTTTGCCGTATTATGGGATGGGGAGCAATCACAACTTCTGAAGACACTTACCCAG-3′；T85′-GTAAGCCTCACGACAGACAGTATTGTTGAACAGGTTAATGTTAGCACAGTGAGGGACATCTGGGTAAGTGTCTTCAGAAG-3′；T95′-GTCTGTCGTGAGGCTTACAACGGTTTGCCAGCTAAGACCTTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGTATCGATACATGTGG-3′；T105′-CCCCAAGACAAGATTCCCTGGAATTGTCCATTACAGATCAGTGGTCCACCAGAGTCACCACCACATGTATCGATACCTCC-3′；T115′-GGGAATCTTGTCTTGGGGAAGTGATCCATGTGCCGAACCACGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAGGTCTTTGATTACCTTC-3′；
T125′-GAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTGTTTCCAGCAATGATAGACTGAATCCATGGAAGGTAATCAAAGACCTTGG-3′。
以上述合成的12個片段T1-T12為模板，以5′端引物P15′-CAGCTCGAGAAAAGAGTCATTGGAG-3′；3′端引物P25′-CAGGAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTG-3′為引物進行PCR擴增。PCR反應體系12段模板(7.5uM)各0.1μL，P1(15uM)和P2(15uM)各1μL，dNTP(各2.5mM)5μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL，10×KOD buffer 5μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應程序94℃30s，51℃30s，72℃ 1min，25循環。最終獲得PCR產物經測序表明，該片段具有序列序列表中序列2的核苷酸序列，將其命名為BG0。自序列表中序列2的第13-705位核苷酸為巴曲酶編碼序列，編碼具有序列表中序列1的胺基酸殘基序列；自序列表中序列2的第1-12位核苷酸為KEX2蛋白酶識別序列的編碼序列。
2)在酵母中表達BG0的重組載體pPIC9-BG0的構建(構建流程圖如圖1所示)將最終PCR產物BG0回收，經XhoI和EcoRI雙酶切，再1％瓊脂糖凝膠回收BG0片段，插入到pPIC9載體(購自Invetrogen公司)的XhoI和EcoRI酶識別位點之間，獲得的重組質粒用LA(LB+100μg/ml Amp+)平板培養，挑選LA(LB+100μg/ml Amp+)平板上的單克隆，LA培養基液體培養，提取質粒，XhoI和EcoRI雙酶切篩選含有BG0的克隆，用α-factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′測序引物分別從BG0的5′端和3′端進行測序檢測，將檢測表明含有BG0的pPIC9重組載體命名為pPIC9-BG0。pPIC9-BG0中含有表達載體pPIC9可以用來轉化畢赤酵母宿主菌GS115/His-。用質粒提取試劑盒大量製備上述表達質粒載體pPIC9-BG0，供轉化酵母之需。
2、BG0利用宿主菌GS115/His-生產巴曲酶即其活性檢測1)含有pPIC9-BG0重組菌的獲得將pPIC9-BG0用Bgl II線性化，轉化Pichia pastoris宿主菌GS115/His-，塗布組氨酸營養缺陷型培養基MD(1.34％YNB，4×10-5生物素，1％葡萄糖，2g/100mL瓊脂)平板上得到重組GS115。用槍尖挑取少許在MD平板上生長出的酵母菌落，進行菌落PCR驗證，以5′AOX1引物5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物。PCR反應體系重組GS115菌落為模板，5′AOX1(15uM)和3′AOX1(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，rTaq DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10*rTaq buffer 2μL，ddH2O 15μL。PCR反應程序94℃30s，55℃30s，72℃1分鐘，25循環。在重組過程中，如果pPIC9-BG0是插入到野生型GS115自身甲醇氧化酶基因5′AOX1或3′AOX1中，會形成Mut+(甲醇利用正常型)，如果pPIC9-BG0是替代野生型GS115自身甲醇氧化酶基因，會形成Muts(甲醇利用慢型)，所以，2200bp條帶為野生型GS115自身甲醇氧化酶基因的PCR產物，750bp條帶為BG0的PCR產物，即Mut+有兩條帶2200和750bp，Muts有一條帶750bp，Mut+和Muts均是含有pPIC9-BG0的陽性克隆。共篩選了50個含有pPIC9-BG0的陽性克隆。部分鑑定結果如圖3所示，圖3中泳道1，3和4為Mut+(甲醇利用正常型)的菌落PCR結果泳道2和5為Muts(甲醇利用慢型)的菌落PCR結果，泳道GS115為未經轉化的GS115/His-菌落PCR結果，泳道BG0為pPIC9-BG0的PCR結果，泳道marker為分子量標準。
2)巴曲酶的發酵生產巴曲酶的活性測定是利用巴曲酶能酶切纖維蛋白原，使含檸檬酸鈉的人血漿凝結這一方法來進行的。具體方法為將上述PCR驗證含有pPIC9-BG0的陽性克隆菌落分別接入裝有3mL BMG(1L中含有100mM磷酸鉀pH 6.0，1.34％YNB，4×10-5生物素，1％甘油)培養液的試管中，30℃培養24小時，用0.5％甲醇誘導48小時，發酵至OD600＝25，參照從蛇毒中提取的巴曲酶的測活方法，用加入了檸檬酸鈉的人標準血漿對發酵上清液中表達出的酶活性(表達量)進行測定。巴曲酶活性(表達量)是，37℃下，將100μl發酵至OD600＝25酵母的發酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標準血漿中，混勻後，凝結所需的時間。50個含有pPIC9-BG0的克隆，巴曲酶活性(表達量)為10mins-30mins。
畢赤酵母可以在簡單培養基中生長良好和表達有生物活性的重組巴曲酶。但在簡單培養基中分泌的重組蛋白易發生降解，使產物的得率降低。實驗中，在酵母基礎培養基的基礎上分別選取大豆蛋白腖和山梨醇進行了對比研究。具體方法為分別將上述篩出的巴曲酶表達量為10mins含有pPIC9-BG0的菌種(表型為Muts)上罐發酵，分別接種到3個裝有200mLBMG培養基的1L搖瓶中增殖作為種子液，再轉接至裝有3L基礎培養基(40g/L甘油，18g/LK2SO4，15g/L MgSO4.7H2O，4.13g/L KOH，0.9g/L CaSO4.2H2O，13.3mL/L H3PO4)的5L發酵罐中，在30℃，pH 5.0發酵，發酵20小時後，按0.8ml/min加入5％甘油100ml，飢餓30分鐘，在其中兩個發酵罐中，再加入3g大豆蛋白腖，其中一罐不加大豆蛋白腖，調pH至6.9，再在其中一個加入大豆蛋白腖的發酵罐按0.2ml/min加入甲醇(含0.2％體積山梨醇)，其他兩個發酵罐按0.2ml/min加入甲醇，誘導培養發酵，發酵每隔12小時取發酵上清液，用加入了檸檬酸鈉的人標準血漿對發酵上清液中表達出的酶活性(表達量)進行測定。巴曲酶活性(表達量)是，37℃下，將100μl發酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標準血漿中，混勻後，凝結所需的時間。計算人血漿凝結速率(1/凝結所需時間)，實驗的結果如圖4中A所示，結果表明，基礎培養基中加入山梨醇和大豆蛋白腖發酵的蛋白人血漿凝結速率最高，表明，加入山梨醇有利於酵母產生更多的基礎蛋白包括分子伴侶，糖基化酶等，促進了巴曲酶的組裝和正確摺疊，同時大豆蛋白腖延緩了巴曲酶的降解。圖4中A中1為基礎培養基，2為在基礎培養基中加入大豆蛋白腖，3為在基礎培養基中加入山梨醇和大豆蛋白腖。
將上述篩出的巴曲酶表達量為10mins含有pPIC9-BG0的菌種(表型為Muts)上罐發酵，接種到裝有200mL BMG培養基的1L搖瓶中增殖作為種子液，再轉接至裝有3L基礎培養基(40g/L甘油，18g/L K2SO4，15g/L MgSO4.7H2O，4.13g/L KOH，0.9g/L CaSO4.2H2O，13.3mL/LH3PO4)的5L發酵罐中，在30℃，pH 5.0發酵，發酵20小時後，按0.8ml/min加入5％甘油100ml，飢餓30分鐘，再加入3g大豆蛋白腖，調pH至6.9，按0.2ml/min加入甲醇(含0.2％體積山梨醇)誘導培養90小時，此時發酵液的濃度為OD600＝360，按照上述方法測得巴曲酶的表達量(酶活性)為30secs(圖4中B，箭頭示條帶)。
3)發酵獲得巴曲酶的純化及其活性鑑定將上述發酵至濃度為OD600＝360發酵液的發酵上清液加入2M硫酸銨預處理後，先經過預先用10mM PBS(pH6.0)和2M硫酸銨平衡過的裝有疏水層析介質(STREAMLINETMPhenyl，Amersham Biosciences，貨號17-5121-02)的層析柱，用含2M硫酸銨的50mM PBS(pH 6.0)梯度洗脫，收集活性峰，分析圖譜如圖5所示，圖5中「-」標記為活性峰；將收集液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖9中泳道1所所示；將上述收集峰，再經過用10mM PBS(pH6.0)平衡過的裝有陽離子交換介質(SPSepharoseTMFast Flow，Amersham Pharmacia Biotech AB，貨號17-0729-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM PBS(pH 6.0)梯度洗脫，收集活性峰，分析圖譜如圖6所示，圖6中「-」標記為活性峰；將收集液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖9中泳道2所示；將上述陽離子交換介質收集峰，再經過用10mM Tris-HCl(pH7.4)平衡過的裝有肝素瓊脂糖凝膠FF(Heparin Sepharose FF，北京卓冠科技有限公司，貨號CS-A13-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(pH 6.0)梯度洗脫，收集活性峰，分析圖譜如圖7所示，圖7中「-」標記為活性峰；將收集液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖9中泳道3所示；將上述肝素瓊脂糖凝膠FF收集峰，再進行一步用凝膠過濾層析(SephacrylS-100，Pharmacia LKB Biotech AB，貨號17-0612-01)，然後用含0.15M NaCl的10mMTris-HCl(pH7.4)洗脫收集活性峰得到純化的巴曲酶溶液，分析圖譜如圖8所示，圖8中「-」標記為活性峰，結果表明該利用BG0生產巴曲酶的產量為10mg/L發酵液(OD600＝360)，即10mg/1013cfu。
用檸檬酸鈉的人標準血漿進行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標準血漿中，混勻後，觀察凝結所需的時間與相同條件下人凝血酶標準品相比較。一個巴曲酶單位(BU)相當於0.17 NIH凝血酶單位(NIHUnit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內凝結1ml人標準纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。
結果表明，以人標準血漿為底物，巴曲酶活性為每毫升發酵液14巴曲酶單位(14BU/ml)，上述純化後的巴曲酶的比活性為1400BU/mg。
用牛纖維蛋白原進行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發酵上清液加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7.4，含0.15M NaCl)中，混勻後，觀察凝結所需的時間與相同條件下人凝血酶標準品凝結時間相比較。一個巴曲酶單位相當於0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內凝結1ml人標準纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。結果表明，以牛纖維蛋白原為底物巴曲酶的比活性為1800BU/mg(表1)將純化的巴曲酶溶液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖9中泳道4所示。
將純化的重組巴曲酶經去糖基化酶PNGase F(New England BioLabs)水解後，進行SDS-PAGE電泳，結果如圖9中泳道5所示。
上述圖9中泳道M為蛋白低分子量標準；泳道1為STREAMLINETMPhenyl活性峰；泳道2為SP SepharoseTMFF活性峰；泳道3為Heparin Sepharose FF活性峰；泳道4為SephacrylS-100活性峰(純化的巴曲酶蛋白)；泳道5為去糖基化的巴曲酶蛋白。
甲醇酵母表達系統在表達的外源蛋白時，只要蛋白分子一級結構中有N-糖基化的可能位點，一般都會有N-型糖基化現象。巴曲酶胺基酸序列資料計算出該蛋白的分子量為25.5KD，上述純化出的巴曲酶，SDS-PAGE電泳(圖9)得出的表觀分子量在30-33KD之間，巴曲酶蛋白的分子量質譜圖如圖10所示，表明BG0生產巴曲酶的平均分子量為30.55KD。如圖9所示，巴曲酶經去糖基化酶PNGase F水解後蛋白的分子量約25.5KD，說明本發明BG0生產的巴曲酶具有糖基化現象。
對BG0生產巴曲酶蛋白測序，前五個胺基酸的序列為VIDGG，表明分泌表達的巴曲酶蛋白與預期的結果相一致。
3、巴曲酶蛋白的小鼠出血時間檢測試驗鼠為雄性小鼠(20-25g，每個處理10隻)，分別尾靜脈注射上述純化後的畢赤酵母表達的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或天然巴曲酶蛋白(2 NIHUnits/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或按照5ml/kg體重的劑量注射10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)，60分鐘後，距尾尖2-3mm處橫切，固定後浸入37℃生理鹽水中1.5cm，記錄出血時間。結果表明注射上述純化後的畢赤酵母表達的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或天然巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或對照處理小鼠出血時間分別約為55秒、60秒、90秒；結果如圖13中的1、2、3所示，結果表明，巴曲酶蛋白縮短了小鼠的出血時間，促進止血，其止血效果與天然的巴曲酶蛋白相當。圖13中，1∶5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)；2天然巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)；3酵母表達的巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)。
實施例2、含IL-2信號肽基因的巴曲酶基因(IBG0)的合成及其表達巴曲酶的效果檢測。
1、含IL-2信號肽基因的巴曲酶基因(IBG0)的合成、測序以及表達載體的構建利用剪接重疊延伸PCR(SOE-PCR)將巴曲酶基因BG0為模板(序列表中序列2)與IL-2信號肽基因(自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸序列)進行連接，具體方法為以IL-2信號肽基因(自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸序列)為模板，用IL25引物5′-CTGGATCCACGATGTATAGGATGCAACTGCTG-3′和IL23引物5′-AGCGCTGTTGGTGACCAG-3′為引物進行PCR，PCR反應體系IL-2信號肽基因(7.5uM)0.1μL，IL25引物(15uM)和IL23引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10*KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應程序94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，25循環；結果得到70bp的片段；以pPIC9-BG0為模板，以ILB引物5′-CTGGTCACCAACAGCGCTGTCATTGGAGGTGATGAATG-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進行PCR，PCR反應體系和PCR反應程序如上所述；結果得到800bp的片段。以上述IL25引物和IL23引物以及ILB引物和3′AOX1引物擴增得到的兩個片段為模板，以IL25引物和3′AOX1引物為引物進行PCR，將IL-2信號肽基因與重組巴曲酶基因進行連接，得到帶有IL-2信號肽的重組巴曲酶基因(IBGO)，經測序表明，該片段具有序列表中序列4的核苷酸序列，編碼序列表中序列3的胺基酸殘基序列。序列表中序列4的第1-60位核苷酸編碼IL-2信號肽序列，即序列表中序列3的第1-20位胺基酸殘基序列，將IBGO經BamHI和EcoRI雙酶切，再1％瓊脂糖凝膠回收符合800bp的DNA片段，插入到pcDNA3.1載體的多克隆位點BamHI和EcoRI酶切位點之間，然後，用T7引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′和BGH引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′測序引物分別從BG基因的5′-端和3′-端進行測序鑑定，將經測序表明含有IBGO的重組載體命名為pcDNA3.1-IBGO。
2、含IL-2信號肽的巴曲酶基因(IBG0)在CHO細胞中的表達用LiofectamineTM2000的方法轉化CHO細胞，將質粒pcDNA3.1-IBG0和LiofectamineTM2000在無血清DMEM培養基[每升1袋DMEM培養粉(4500mg葡萄糖，4.0mM L-穀氨醯胺，110mg丙酮酸鈉)，2.0g碳酸氫鈉，青黴素和鏈黴素各100mg]中進行混合，並在室溫中孵育20分鐘；將混合物加入到已經鋪好細胞的24孔板中，輕柔混勻，並置於37℃，5％CO2細胞培養箱中培養24小時後，將細胞的培養基更換成含10％DF(Defined FBS，特級胎牛血清)的DMEM培養基繼續培養48小時；換用含750mg/L G418的含10％DF的DMEM培養基進行加壓篩選，每2天換液一次，加壓篩選14天。有限稀釋法挑取單克隆。待加壓後正常生長的細胞鋪滿24孔板時，其密度約106/孔，將其進行消化懸浮後分別用生長培養基分別稀釋至10、20個細胞/ml，200μl/孔接種於96孔培養板，置37℃培養。10天後，即可見單細胞克隆生長，逐孔進行目的蛋白的檢測。共篩選了96個可表達巴曲酶的克隆，表達量從90mins到180mins不等。
將上述表達量為90mins的單細胞克隆在無蛋白、無血清DMEM培養基[每升1袋DMEM培養粉(4500mg葡萄糖，4.0mM L-穀氨醯胺，110mg丙酮酸鈉)，2.0g碳酸氫鈉，青黴素和鏈黴素各100mg]中擴大培養至1010細胞/L培養基，將培養上清液稀釋1倍，按照實施例1的方法經過用10mM Tris-HCl(pH8.4)平衡過的肝素瓊脂糖凝膠FF(HeparinSepharose FF，北京卓冠科技有限公司，貨號CS-A13-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(pH8.4)梯度洗脫，收集活性峰進行SDS-PAGE電泳，結果如圖12中泳道1所示；將上述肝素瓊脂糖凝膠FF收集峰，再經過用10mM Tris-HCl(pH8.4)平衡過的裝有陰離子交換介質(Q SepharoseTMFast Flow，Pharmacia LKB Biotech AB，貨號17-0510-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(pH8.4)梯度洗脫，收集活性峰進行SDS-PAGE電泳，結果如圖12中泳道2所示；
將上述陰離子交換介質收集峰，再進行一步用凝膠過濾層析(SephacrylS-100，Pharmacia LKB Biotech AB，貨號17-0612-01)，然後用含0.15M NaCl的10mMTris-HCl(pH7.4)洗脫，收集活性峰進行SDS-PAGE電泳(即純化的巴曲酶溶液)，結果如圖12中泳道3所示。用檸檬酸鈉的人標準血漿進行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的培養液上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標準血漿中，混勻後，觀察凝結所需的時間。用牛纖維蛋白原進行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的培養液上清液加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7.4，含0.15M NaCl)中，混勻後，觀察凝結所需的時間與相同條件下人凝血酶標準品凝0結時間相比較。一個巴曲酶單位相當於0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內凝結1ml標準纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。結果表明該利用CHO生產巴曲酶的產量為0.1mg/L培養液，即1010細胞/L培養液，其比活力檢測結果如表1所示，表明CHO生產巴曲酶仍具有很高的比活力。
將純化的CHO表達的重組巴曲酶經去糖基化酶PNGase F(New England BioLabs)水解後，進行SDS-PAGE電泳，結果如圖12中泳道4所示。
上述圖12中泳道M為蛋白低分子量標準；泳道1為肝素瓊脂糖凝膠FF活性峰；泳道2為Q SepharoseTMFast Flow活性峰；泳道3為SephacrylS-100活性峰(即純化的巴曲酶蛋白)；泳道4為去糖基化的巴曲酶蛋白。
CHO細胞表達系統在表達的外源蛋白時，只要蛋白分子一級結構中有N-糖基化的可能位點，一般都會有N-型糖基化現象。巴曲酶胺基酸序列資料計算出該蛋白的分子量為25.5KD，上述純化出的巴曲酶，SDS-PAGE電泳(圖12)得出的表觀分子量在32-35KD之間。如圖12所示，巴曲酶經去糖基化酶PNGase F水解後蛋白的分子量約25.5KD，說明本發明CHO細胞生產的巴曲酶具有糖基化現象。
3、CHO(pcDNA3.1-IBG0)表達的巴曲酶蛋白的小鼠出血時間檢測試驗鼠為雄性小鼠(體重20-25g，每個實驗處理組10隻)，分別尾靜脈注射上述純化後的CHO表達的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/LPBS(pH 7.4)(對照)，60分鐘後，距尾尖2-3mm處橫切，固定後浸入37℃生理鹽水中1.5cm，記錄出血時間。結果表明注射上述純化後的CHO表達的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)小鼠出血時間分別約為51秒、90秒；結果如圖13中1、4所示，結果表明，CHO表達的巴曲酶蛋白縮短了小鼠的出血時間，促進止血，其止血效果與酵母表達的巴曲酶蛋白以及天然的巴曲酶蛋白相當。圖13中，1注射5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)，4注射上述純化後的CHO表達的巴曲酶蛋白。
實施例3、對BG0基因表達的巴曲酶蛋白的糖基化研究1、巴曲酶糖基化位點突變基因(BGm1，BGm2)的獲得以及表達載體的構建(圖2)採用定點突變技術對BG0基因分別進行突變將Asn(自序列1的氨基端第146位)突變為Gln(糖基化的motif是Asn-X-Thr)，即將自序列表中序列2的5′端第448-450位核苷酸(AAC)突變為CAA；具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M13引物5′-TTGGAACAGGTTAATGTTAGCACAG-3′(突變密碼子)為引物進行PCR擴增，PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(各2.5mM)和M13引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10*KODbuffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應程序94℃ 30s，53℃30s，72℃1min，25循環；結果得到470bp的片段。用M15引物5′-CTGTGCTAACCTGTTCCAAAATACTGTCTGTCGTGAGG-3′(突變密碼子)和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進行PCR，PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL(0.04ug)，M15引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O35μL。PCR反應程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環；結果得到340bp的片段。將上述得到的兩個片段回收後，作為模板，以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進行PCR，PCR的程序為PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環；結果得到800bp的片段，經測序表明，該片段具有將序列表中序列2的5′端第448-450位核苷酸(AAC)突變為CAA的核苷酸序列(即序列9)，將其命名為BGm1。
將BGml片段用XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶切位點之間，構建成含有BGml的pPIC9重組載體，將該重組載體命名為pPIC9-BGml。
將Asn(自序列1的氨基端第225位)突變為Gln，即將自序列表中序列2的5′端第685-687位核苷酸(AAC)突變為CAA；具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M23引物5′-GGAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTGTTTCCAGCAATG-3′(突變密碼子)為引物進行PCR，PCR的程序為PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和M23引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應程序94℃30s，53℃30s，72℃1min，25循環；結果得到730bp的片段，經測序表明，該片段具有將序列表中序列2的5′端第685-687位核苷酸(AAC)突變為CAA的核苷酸序列(即序列10)，將其命名為BGm2。
將上述PCR獲得的BGm2片段經XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶切位點之間，構建成含有BGm2的pPIC9重組載體，將鑑定正確的重組載體命名為pPIC9-BGm2。
將pPIC9-BGm1和pPIC9-BGm2用Bgl II線性化，按照實施例1步驟2所述的方法，轉化畢赤酵母GS115/His-宿主菌，分別得到含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2重組菌，在30℃，MD平板培養2-3天，PCR鑑定(以PCR 5′AOX1引物和3′AOX1引物進行PCR擴增，反應體系25ul體系，少量重組GS115菌落為模板，5′AOX1引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，rTaq DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×rTaq buffer 2μL，ddH2O 15μL。PCR反應程序94℃30s，55℃30s，72℃1min，25循環。)；鑑定陽性克隆，將PCR鑑定表明含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2的重組菌按照實施例的方法用1BMG培養和甲醇誘導，發酵表達突變去除了一個糖基化位點的巴曲酶，發酵96小時，OD600＝360，將發酵上清液純化，進行活性檢測，檢測方法同實施例1的步驟2。
結果表明含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2重組菌發酵得到的巴曲酶的表達量分別達到10mg/L發酵液(OD600＝360)，即10mg/1013cfu，比活性分別為500BU/mg，170BU/mg(表1)；BG0在酵母GS115表達的巴曲酶分子量為30.55KD，總糖含量16.5％，比活約為1400BU/mg；從腹蛇屬蛇毒液中提取的天然巴曲酶的分子量為34.9 KD，總糖含量27％，比活約為1350BU/mg，這表明不同生物的糖基化巴曲酶對其比活的影響不大。
說明突變去除任意一個BG0表達的巴曲酶蛋白中糖基化位點，巴曲酶的酶活力大大降低；說明BG0表達的巴曲酶蛋白中的這二個糖基化位點的存在及其糖基化對維持酶的活力是極其重要的。
實施例4、胺基酸突變對活性的影響1、Ala(自序列1的氨基端第59位)突變為Arg的巴曲酶及其編碼基因的獲得將Ala(自序列1的氨基端第59位)突變為Arg，即將自序列表中序列2的5′端第187-189位核苷酸(GCC)突變為CGA；具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M33引物5′-TCGGACAGATCCGGCGTGCTTAC-3′(突變密碼子)為引物進行PCR，PCR的程序為PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL，a-Factor引物和M33引物各0.5μL，dNTP 2μL，KOD DNA Polymerase 0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO42μL，ddH2O 35μL；PCR反應程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環；結果得到210bp的片段；用M35引物5′-GCACGCCGGATCTGTCCGAAACTACGATGAGGTCGTTAG-3′(突變密碼子)和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進行PCR，PCR的程序為PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase 0.1μL(5U/μL)，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃1min，25循環；結果得到690bp的片段。將上述PCR獲得的兩個片段回收後作為模板，以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進行PCR，PCR反應體系和PCR反應程序如上所述；結果得到800bp的片段，經過測序檢測，檢測表明該片段具有將自序列表中序列2的5′端第187-189位核苷酸(GCC)突變為CGA的核苷酸序列(即序列表中序列6)，將片段命名為BGm3。BGm3編碼具有序列表中序列5的胺基酸殘基序列。
將BGm3經XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶識別位點中，構建成含有BGm3的pPIC9重組載體，將鑑定正確的重組載體命名為pPIC9-BGm3。
2、Thr(自序列1的氨基端第128位)突變為Arg的巴曲酶及其編碼基因的獲得將Thr(自序列1的氨基端第128位)突變為Arg，即將自序列表中序列2的5′端第394-396位核苷酸(ACT)突變為CGA，具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M43引物5′-TCGTGTGATTGCTCCCCATCC-3′(突變密碼子)為引物進行PCR，PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和M43(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應程序94℃30s，53℃30s，72℃ 1min，25循環；結果得到420bp的片段，用M45引物5′-ATGGGGAGCAATCACACGATCTGAAGACACTTACCCAG-3′(突變密碼子)和3′AOX 1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進行PCR，PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL，M45和3′AOX1引物各0.5μL，dNTP 2μL，KOD DNA Polymerase 0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO42μL，ddH2O 35μL；PCR反應程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環；結果得到380bp的片段。將上述PCR獲得的兩個片段回收後作為模板，以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進行PCR，PCR反應體系pPIC9-BG0質粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環；結果得到800bp的片段，經過測序檢測，檢測表明該片段具有將自序列表中序列2的5′端第394-396位核苷酸(ACT)突變為CGA的核苷酸序列(即序列表中序列8)，將片段命名為BGm4。BGm4編碼具有序列表中序列7的胺基酸殘基序列。
將BGm4經XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶識別位點中，構建成含有BGm4的pPIC9重組載體，將鑑定正確的重組載體命名為pPIC9-BGm4。
3、BGm3和BGm4在畢赤酵母中的表達按照實施例1所述的方法，將pPIC9-BGm3或pPIC9-BGm4轉化GS115/His-，然後進行PCR鑑定，將鑑定正確的陽性克隆進行發酵至OD600＝360，並按照實施例1所述方法檢測活性並純化。用檸檬酸鈉的人標準血漿進行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標準血漿中，混勻後，觀察凝結所需的時間與相同條件下人凝血酶標準品凝結時間相比較。一個巴曲酶單位相當於0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內凝結1ml標準纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。用牛纖維蛋白原進行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發酵上清液加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7.4，含0.15M NaCl)中，混勻後，觀察凝結所需的時間與相同條件下人凝血酶標準品凝結時間相比較。一個巴曲酶單位相當於0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內凝結1ml人標準纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。結果表明其中的BGm4基因表達的將自序列1的氨基端第128位T突變成R巴曲酶的表達量為達到10mg/L發酵液(OD600＝360)，即10mg/1013cfu，比活性為1050BU/mg；另一株的BGm3表達的將自序列1的氨基端第59位A突變成R巴曲酶的表達量為10mg/L發酵液(OD600＝360)，比活性為1330BU/mg。用牛纖維蛋白原為底物檢測其活性和表達量37℃下，將100μl加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(pH7.4，含0.9％NaCl)中，混勻後，記錄凝結時間，結果表明BGm3表達的將自序列1的氨基端第59位A突變成R的巴曲酶改變了巴曲酶蛋白的底物特異性，對牛纖維蛋白原的活性高於BG0表達的巴曲酶，對人血漿的活性低於BG0表達的巴曲酶(表1)。
表1.巴曲酶突變體與BG0表達的巴曲酶比活力對比

4、BGm3和BGm4表達的巴曲酶蛋白的小鼠出血時間檢測試驗鼠為雄性小鼠(20-25g，n＝10)，分別尾靜脈注射上述純化後的畢赤酵母表達的BGm3巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或BGm4巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，11.2μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)，60分鐘後，距尾尖2-3mm處橫切，固定後浸入37℃生理鹽水中1.5cm，記錄出血時間。結果表明注射上述純化後的畢赤酵母表達的BGm3巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或BGm4巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，11.2μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4) (對照)小鼠出血時間分別約為53秒、57秒、90秒；具體結果如圖13中1、5、6所示。圖13中，1注射5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)；5.酵母表達的BG3巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，11.2μg蛋白/kg體重)；6.酵母表達的BG4巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)。
序列表160102101211231212PRT213人工序列220
223
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Gln Gly Ile Leu Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys210 215 220Pro Ala Phe Tyr Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser225 230 235 240Ile Ile Ala Gly Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro245 2502104211755212DNA213人工序列220
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1.一種製備巴曲酶的專用基因，具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列2經替換1-3個鹼基，編碼相同功能蛋白的核苷酸序列；3)在1)所述序列的5′端連接IL-2信號肽基因序列得到的核苷酸序列。4)在高嚴謹條件下可與1)、2)或3)所述序列的DNA序列雜交的核苷酸序列；
2.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於所述IL-2信號肽基因的核苷酸序列為自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸。
3.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於所述編碼基因具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列43)序列表中序列6；4)序列表中序列8。
4.一種製備巴曲酶的方法，是將權利要求1-3任一所述的編碼基因通過真核表達載體導入酵母菌或哺乳動物細胞系中表達，獲得巴曲酶蛋白。
5.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述酵母菌為畢赤酵母，優選為畢赤酵母GS115/His-。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物細胞係為CHO細胞系。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於當所述編碼基因導入酵母菌中時，所述真核表達載體為pPIC9；當所述編碼基因導入哺乳動物細胞系中時，所述真核表達載體為pcDNA3.1。
8.根據權利要求4-7任一所述的方法，其特徵在於所述方法還包括將表達獲得的巴曲酶蛋白進行純化。
9.權利要求4-8任一所述的方法製備的巴曲酶蛋白。
10.根據權利要求9所述的巴曲酶蛋白，其特徵在於所述巴曲酶蛋白的胺基酸殘基序列是1)序列表中序列1；2)序列1的氨基端第59位Ala突變為Arg的胺基酸序列；3)序列1的氨基端第128位Thr突變為Arg的胺基酸序列；4)序列1的氨基端連接IL-2信號肽的胺基酸序列；所述IL-2信號肽的胺基酸序列為自GENBANK號為NP_000577的氨基端第1-20位胺基酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種巴曲酶及其製備方法與專用編碼基因。該巴曲酶的編碼基因，具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列2經突變1－3個核苷酸；3)在1)所述序列的5′端連接IL－2信號肽基因序列得到的核苷酸序列。該製備巴曲酶的方法，是將權利要求1－3任一所述的編碼基因通過真核表達載體導入酵母菌或哺乳動物細胞系中表達，獲得巴曲酶蛋白。本發明的方法，成功地表達出了生物活性高的巴曲酶蛋白，純化後酵母菌產量達到每毫升發酵液10μg/ml或14巴曲酶單位(14BU/ml)，比活性為1400BU/mg。這一產量超過了其它已發表和報導的表達水平，適合規模化生產。
文檔編號C12N1/19GK1986813SQ20061016534
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月18日 優先權日2006年12月18日
發明者李招發, 於學玲, 黃金路, 方宏清, 陳惠鵬 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所