一種用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統的製作方法

2023-07-23 22:10:06 2

一種用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統的製作方法
【專利摘要】本發明屬生物【技術領域】，涉及一種用於腦膠質瘤聯合治療的介孔矽-石墨烯納米片遞藥系統。本發明利用石墨烯納米片在近紅外的強吸收性質進行光熱治療，利用石墨烯納米片表面所包被介孔矽的吸附作用以及石墨烯納米片的π-π相互作用負載DOX進行化療，能實現對腦膠質瘤的聯合治療。與現有技術構建的遞藥系統比較，本發明製備的遞藥系統集合多種優勢於一身，通過單一遞藥系統實現腦膠質瘤化療和光熱治療的聯合靶向治療，降低全身毒副作用，優良的藥物釋放特性可避免重複繁瑣給藥，提高患者順應性。
【專利說明】一種用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統

【技術領域】
[0001] 本發明屬生物【技術領域】，涉及一種用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統，具體涉及 一種用於聯合治療腦膠質瘤的介孔矽-石墨烯納米片遞藥系統

【背景技術】
[0002] 據報導，腦膠質瘤是已成為最常見的顱內惡性腫瘤，且是腦部疾病引起死亡的主 要病因之一。目前臨床的標準治療是手術切除後聯合化療和放療，但效果不理想，預後差， 平均生存時間不超過2年。其主要原因可能是目前的化療尚缺乏靶向性，在腫瘤部位藥量 不足，全身毒副作用大，患者順應性差。研究顯示，光熱治療是一種創傷性低的方法，可提高 化療敏感性，有望協同化療提高抗腫瘤效果。因此，化療聯合光熱治療的腦膠質瘤靶向治療 是一種值得嘗試的手段。
[0003] 為了避免重複繁瑣給藥，提高患者順應性，臨床實踐中需要單一的給藥系統能同 時擁有化療和光熱治療的功能。石墨烯納米片因其生物相容性好、結構均一、價格低等優 勢，受到業內廣泛關注。研究顯示，石墨烯納米片是一種良好的藥物載體，可有效攜帶難溶 性抗腫瘤藥物、蛋白、基因藥物和生物成像劑等進入細胞。更為重要的是，石墨烯納米片是 一種具有高近紅外吸收的光敏劑，可用於腫瘤光熱治療。但是，石墨烯納米片主要通過非共 價結合如η-η相互作用吸附難溶性藥物分子，載藥量較低，且表面較難進行功能化修飾， 限制了其在生物醫藥領域的應用。近期有研究報導了一種新材料--介孔矽包封的石墨烯 納米片（GS)。目前該材料主要應用於吸附分離和傳感器領域。
[0004] 受體介導的主動靶向技術是提高腫瘤蓄積、降低全身毒副作用的主要手段之 一。白細胞介素13(interleukin-13,簡稱IL-13)可與受體鏈IL-13Ra 2高度親和，且 IL-13Ra 2在多種惡性腫瘤如腦膠質瘤、頭頸癌、卵巢癌、惡性腎細胞癌等高度表達，而在對 應的正常組織表達非常低甚至檢測不到。特別是在腦膠質瘤，IL-13作為IL-13R a 2的自 然配體，已用於構建腦膠質瘤靶向的遞藥系統。但是，IL-13是一種蛋白，分子量較大，容易 變性，且操作比較困難，作為靶向配體需要進一步改善。有研究通過噬菌體展示技術獲得一 種源於IL-13的多肽（IL-13derived p印tide，簡稱IP)，同樣可與IL_13Ra2高度特異性 結合。IP末端含有半胱氨酸殘基易於進行修飾，可化學合成，穩定性好，可作為靶向腦膠質 瘤的多肽配體。
[0005] 本發明的 申請人:，擬利用介孔矽球自身是一種難溶性化療藥物的載體的特點，將 介孔矽垂直包被於石墨烯納米片表面，以期改善石墨烯納米片的界面性質，整合石墨烯納 米片和介孔矽作為遞藥載體的優勢：（1)增大比表面積，提高載藥量；（2)提高石墨烯納米 片的親水性，生理介質中更易於分散；（3)使材料表面更易於功能化，且功能化修飾更均 勻，有望成為一種優良的遞藥載體。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系 統，具體涉及一種用於聯合治療腦膠質瘤的介孔矽-石墨烯納米片遞藥系統，該遞藥系統 尤其用於化療和光熱聯合治療腦膠質瘤。
[0007] 本發明的遞藥系統由源於白細胞介素13的多肽（IP)修飾的遞藥載體和化療藥物 構成。
[0008] 本發明採用源於白細胞介素13的多肽IP為靶向配體，介孔矽-石墨烯納米片（簡 稱GS)為基礎載體，通過親水性聚合物聚乙二醇（簡稱PEG)連接IP構建遞藥載體；所獲得 的遞藥載體與難溶性小分子化療藥物阿黴素（簡稱D0X)形成50?200納米大小的遞藥系 統，得本發明用於腦膠質瘤聯合治療的介孔矽-石墨烯納米片-聚乙二醇-IP/阿黴素遞藥 系統（簡稱 GS-PEG-IP/D0X)。
[0009] 本發明製得的介孔矽-石墨烯納米片-聚乙二醇-IP/阿黴素遞藥系統（簡稱 GS-PEG-IP/D0X)，可用於腦膠質瘤聯合治療（化療和光熱治療聯合），能顯著提高腦膠質瘤 細胞的死亡率。
[0010] 本發明的目的通過以下技術方案實現：
[0011] 本發明遞藥載體以GS、PEG和IP為組分，三者以共價方式連接製備IP修飾的遞藥 載體（簡稱GS-PEG-IP)。其中，PEG與GS的投料比是1. 5?3. 5 : 1，IP與GS的投料比是 0· 1 ?1 : 1 ;
[0012] 本發明按下述方法製備遞藥載體：
[0013] 通過表面活性劑自組裝法在石墨烯納米片表面包被介孔矽，所得GS和PEG以 1 : 1.5?3. 5的投料比溶於pH值為8.0磷酸鹽緩衝液中，室溫攪拌反應2小時，兩種分 子中含有的基團發生特異性反應，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換為pH值為 7. 0磷酸鹽緩衝液。之後，IP以0. 1?1 : 1的投料比與GS-PEG(以GS的質量計算）室溫 攪拌反應24小時後生成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0014] 本發明按下述方法製備遞藥系統：
[0015] 將D0X的甲醇儲備液（lmg/ml)加入上述製備的GS-PEG-IP遞藥載體中，D0X和 載體（以GS的質量計算）的投料比為2 : 1，室溫攪拌反應24小時，離心法除去未載入的 D0X，氮氣吹乾，即得。
[0016] 本發明的基礎遞藥載體GS，所包被介孔矽佔 GS的含量是30 %?40 %，介孔孔徑為 2?4納米。
[0017] 本發明採用紅外光譜技術對所製備的遞藥載體及其製備過程的中間產物進行結 構鑑定，結果顯示，在GS成功製備的同時，氧化石墨烯表面的C = 0振動（1725(31^1)和C-0 振動（1382cm-1)減弱或消失，說明GS中石墨烯是還原型的。同時，在2921cm- 1和2853CHT1 處產生C-H的反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動，以及在1083CHT1和791CHT1處產生Si-0-Si 的反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動，說明氨基化介孔矽的形成。C-H鍵的反對稱和對稱伸 縮振動的加強（2921cm-1和2853CHT 1)以及不飽和C-H鍵的伸縮振動（3050-330001^),苯環 C-C鍵伸縮振動（1540cm-1)、C-H鍵（1452cm-1)以及羧基的0-H鍵（1380cm- 1)彎曲振動等的 出現，都說明PEG和IP成功修飾到GS上，即GS-PEG和GS-PEG-IP合成成功。
[0018] 本發明採用透射電鏡觀察遞藥載體的表面形態，結果顯示，單純的氧化石墨烯納 米片在50?250納米左右。還原、細化並在表面覆蓋介孔矽後，大部分GS納米片的尺寸在 50?150納米左右，納米片上介孔清晰可見，孔徑約為2. 5納米，並且其孔道垂直於石墨烯 納米片表面，孔道深度在25納米左右。
[0019] 本發明採用紫外-可見分光光度法測定氧化石墨烯、GS、GS-PEG和GS-PEG-IP的 吸收光譜，結果顯示，GS-PEG-IP在800?820納米的近紅外窗具有最高的吸收。
[0020] 本發明採用808納米的雷射器和精密熱電偶測定GS-PEG-IP的光熱效應，結果顯 示固定溶液濃度時，溶液溫度隨著能量強度增加而增加，固定能量強度時，溶液溫度隨著溶 液濃度增加而增加。
[0021] 本發明採用抗腫瘤化療藥物D0X為模型藥物，構建GS-PEG-IP包載D0X的遞藥系 統（簡稱GS-PEG-IP/D0X)，採用螢光光譜法檢測GS-PEG-IP/D0X的載藥量和包封率。結 果顯示，以GS的質量計算，GS-PEG-IP的載藥量為1. 27±0. 11 μ g DOX/μ g GS，包封率為 58. 03±9. 11%。
[0022] 本發明考察不同pH條件和是否近紅外光照時遞藥系統中D0X的累積釋放情況，結 果顯示，GS-PEG-IP/D0X中D0X的釋放呈pH敏感性。pH降低，D0X的釋放增加，近紅外光照 可明顯提高同等條件下GS-PEG-IP/D0X中D0X的累積釋放量，在pH5. 0時，近紅外光照組24 小時的D0X累積釋放量（17% )約是無光照組（5. 9% )的3倍左右，表明近紅外光照可顯 著提高遞藥系統中D0X的釋放，從而增加化療的敏感性。另外，從結果可知，D0X的釋放緩 慢，具有顯著好的緩釋效果。
[0023] 本發明所製備的遞藥載體或遞藥系統與腦膠質瘤U251細胞孵育30分鐘，共聚焦 顯微鏡定性觀察結果顯示，在濃度為50 μ g/ml (以GS質量計算）時，化療和光熱治療聯 合治療組（GS-PEG-IP/DOX+NIR組）的腫瘤細胞死亡明顯高於單純的化療組（GS-PEG-IP/ D0X組）或單純的光熱治療組（GS-PEG-IP+NIR組），提示聯合治療的良好效果。另外，單純 GS-PEG-IP未經任何處理組未觀察到明顯細胞毒性。
[0024] 本發明所製備的遞藥載體或遞藥系統配製成系列濃度，與腦膠質瘤U251細胞孵 育2小時，通過CCK-8檢測法定量考察細胞毒性，結果顯示IC50值分別為：單純GS-PEG-IP 未經任何處理組（1. 139e+030 μ g/ml，以GS質量計算）、單純的化療組（398. 15 μ g/ml，以 D0X質量計算）、單純的光熱治療組（78. 78 μ g/ml，以GS質量計算）以及化療和光熱治療聯 合治療組（37. 45 μ g/ml，以D0X質量計算，和29. 49 μ g/ml，以GS質量計算），由此計算得到 聯合指數值CI為0. 504,證明化療和光熱治療具有協同作用。
[0025] 本發明所製備的遞藥系統分別與腦膠質瘤U251細胞和正常星形膠質細胞1800細 胞孵育30分鐘，共聚焦顯微鏡結果顯示，在濃度為50 μ g/ml (以GS質量計算）時，GS-PEG/ D0X在腦膠質瘤細胞和正常細胞的攝取無明顯變化，GS-PEG-IP/D0X在腦膠質瘤細胞的攝 取明顯高於正常細胞，即IP的修飾幾乎不影響遞藥系統在正常細胞的攝取，可顯著提高其 在腦膠質瘤細胞的攝取，表明IP具有靶向腦膠質瘤的功能。
[0026] 本發明所製備的遞藥系統分別與腦膠質瘤U251細胞和正常星形膠質細胞1800細 胞孵育6小時，通過CCK-8檢測法定量測定細胞毒性。與共聚焦顯微鏡結果相對應，在濃度 為50 μ g/ml (以GS質量計算）時，GS-PEG/D0X在腦膠質瘤細胞和正常細胞的細胞存活率 分別為79. 92±2. 19%和88. 19±6. 19%，GS-PEG-IP/D0X在腦膠質瘤細胞和正常細胞的細 胞存活率分別為47. 30 ± 2. 57 %和85. 75 ± 3. 48 %，進一步說明GS-PEG-IP/D0X對腦膠質瘤 細胞具有選擇性的殺傷作用。
[0027] 本發明的突出優點及特徵在於，設計了多功能的藥物遞釋系統GS-PEG-IP/D0X，通 過單一的遞藥系統實現腦膠質瘤化療和光熱治療的聯合靶向治療，顯著提高遞藥系統對腦 膠質瘤細胞的殺傷作用。該遞藥系統具有下述特徵：（1)對DOX的載藥量和包封率高，有利 於化療；（2)近紅外吸收強，熱轉換效率高，有利於光熱治療；（3) IP的修飾賦予遞藥系統主 動靶向腦膠質瘤的性質；(4)優良的藥物釋放特性，包括熱觸發釋放、pH敏感釋放和緩釋作 用，有利於腦膠質瘤長期、低傷害性的治療。與現有技術構建的遞藥系統比較，本發明製備 的遞藥系統集合多種優勢於一身，使用單一遞藥系統可實現腦膠質瘤化療和光熱治療的聯 合靶向治療，降低全身毒副作用，優良的藥物釋放特性可避免重複繁瑣給藥，提高患者順應 性。
[0028] 本發明所製備的介孔矽-石墨烯納米片遞藥系統還可用於頭頸癌、卵巢癌、惡性 腎細胞癌等高度表達IL-13Ra 2的腫瘤的化療和光熱治療聯合靶向治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1GS的表徵結果，
[0030] 其中，A :小角X射線衍射圖，
[0031] B :N2吸附脫附等溫線（插入圖：孔徑分布曲線），
[0032] C，D和E:透射電鏡圖。
[0033] 圖2GS-PEG-IP的熱效應結果。
[0034] 其中，A :固定能量強度為6W/cm2,不同濃度GS-PEG-IP的熱效應曲線，
[0035] B :固定GS-PEG-IP濃度為50 μ g/ml (以GS的質量計算），不同能量強度下的熱效 應曲線。
[0036] 圖3GS-PEG-IP/D0X在不同pH條件下的熱觸發累積釋放曲線，固定能量強度為6W/ cm2。
[0037] 圖4共聚焦顯微鏡觀察U251細胞經不同處理後的死亡情況，
[0038] 其中，以GS的質量計算，遞藥系統的濃度為50 μ g/ml，Bar = 75 μ m，
[0039] BF:明場細胞圖，
[0040] Live :綠色表示活細胞，
[0041] Dead :紅色表示死細胞，
[0042] Merge:紅綠疊加圖，
[0043] A ：GS-PEG-IP,
[0044] B：GS-PEG-IP+NIR,
[0045] C：GS-PEG-IP/D0X,
[0046] D:GS-PEG_IP/DOX+NIR。
[0047] 圖5CCK-8法定量測定不同處理對U251細胞的毒性曲線。
[0048] 圖6CCK-8法定量測定藥物遞釋系統經IP修飾前後對U251細胞和1800細胞的毒 性，
[0049] 其中，a :GS-PEG/D0X
[0050] b :GS-PEG-IP/D0X。

【具體實施方式】
[0051] 實施例1·
[0052] 將十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、硼酸鈉溶液（lmg/ml)和氧化石墨烯納米片 G0(0. 2mg/ml)混合，80°C攪拌30分鐘，然後加入氫氧化鈉溶液（0. 2M)混合，繼續攪拌15分 鍾，水熱處理24小時，超聲1小時，攪拌條件下緩慢滴入正矽酸乙酯（TE0S)和3-氨丙基三 乙氧基矽烷（APTES)的混合液，在100°C繼續攪拌24小時後，通過離心分離得到固體產品， 進一步使用硝酸銨的甲醇溶液回流去除表面活性劑CTAB，得到氨基化介孔矽-石墨烯納米 片（GS-NH 2)。
[0053] 實施例2.
[0054] GS_NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 1.5溶於pH8. 0的磷酸鹽緩衝液 (簡稱PBS)中，室溫攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液 為ρΗ7· 0的PBS。之後，IP與GS-PEG按照0· 1 : 1 (以GS的質量計算）投料比混合，室溫 攪拌反應24小時後生成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0055] 實施例3.
[0056] GS_NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 1. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照0. 5 : 1 (以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後 生成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0057] 實施例4.
[0058] GS-NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 1. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照1 : 1(以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後生 成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0059] 實施例5.
[0060] GS-NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 2. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照0. 1 : 1 (以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後 生成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0061] 實施例6.
[0062] GS-NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 2. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照0. 5 : 1 (以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後 生成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0063] 實施例7.
[0064] GS-NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 2. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照1 : 1(以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後生 成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0065] 實施例8.
[0066] GS-NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 3. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照0. 1 : 1 (以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後 生成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0067] 實施例9.
[0068] GS-NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 3. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照0. 5 : 1 (以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後 生成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0069] 實施例10.
[0070] GS_NH2和含有雙功能基團的PEG按照投料比1 : 3. 5溶於pH8. 0的PBS中，室溫 攪拌反應2小時，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換緩衝液為pH7. 0的PBS。之 後，IP與GS-PEG按照1 : 1(以GS的質量計算）投料比混合，室溫攪拌反應24小時後生 成GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得。
[0071] 實施例11.
[0072] 將DOX的甲醇儲備液（lmg/ml)加入實施例2合成的GS-PEG或GS-PEG-IP遞藥載 體中，DOX和載體（以GS的質量計算）的投料比為2 : 1，室溫攪拌反應24小時，離心法除 去未載入的DOX，氮氣吹乾，即得GS-PEG/DOX或GS-PEG-IP/DOX遞藥系統。
[0073] 實施例12.
[0074] 將DOX的甲醇儲備液（lmg/ml)加入實施例6合成的GS-PEG或GS-PEG-IP遞藥載 體中，DOX和載體（以GS的質量計算）的投料比為2 : 1，室溫攪拌反應24小時，離心法除 去未載入的DOX，氮氣吹乾，即得GS-PEG/DOX或GS-PEG-IP/DOX遞藥系統。
[0075] 實施例13.
[0076] 將D0X的甲醇儲備液（lmg/ml)加入實施例10合成的GS-PEG或GS-PEG-IP遞藥 載體中，D0X和載體（以GS的質量計算）的投料比為2 : 1，室溫攪拌反應24小時，離心法 除去未載入的D0X，氮氣吹乾，即得GS-PEG/DOX或GS-PEG-IP/DOX遞藥系統。
[0077] 實施例14.
[0078] 將實施例1製備的GS_NH2，使用銅鈀的Rigaku D/MAX-RB小角X射線衍射儀表徵， 說明成功合成GS-NH2，石墨烯納米片表面覆蓋具有六方有序排列的介孔（如圖1A所示）。
[0079] 實施例15.
[0080] 將實施例1製備的GS_NH2，通過N2吸附脫附等溫線表徵，進一步說明成功合成 GS-NH2，其BET表面積為1252m2/g(如圖1B所示）。
[0081] 實施例16.
[0082] 將實施例1製備的GS_NH2，通過孔徑分布曲線表徵，說明所合成GS_NH 2的介孔孔 徑均一，約2. 5納米（如圖1B所示）。
[0083] 實施例17.
[0084] 將實施例1製備的GS-NH2於JEOL JEM-2010透射電鏡下觀察，進一步證明石墨烯 納米片表面包被介孔，且介孔垂直於石墨烯納米片，介孔深度約25納米，橫向粒徑為50? 150納米（如圖1C-E所示）。
[0085] 實施例18.
[0086] 將實施例6合成的GS-PEG-IP溶於ρΗ7· 4的PBS溶液，使濃度分別為1、10、50和 100 μ g/ml (以GS的質量計算），以氧化石墨烯納米片和pH7. 4的PBS溶液為對照，使用808 納米的近紅外雷射器照射6分鐘，固定能量強度為6W/cm2,記錄不同時間點的溶液溫度。結 果顯示，在同一載體濃度時，隨著時間延長，溶液溫度呈上升趨勢，到6分鐘左右進入平臺 期，在同一時間點，隨著遞藥載體濃度增加，溶液溫度升高（如圖2A所示）。
[0087] 實施例19.
[0088] 將實施例6合成的GS-PEG-IP溶於ρΗ7· 4的PBS溶液，使濃度為50 μ g/ml (以GS 的質量計算），使用808納米的近紅外雷射器照射6分鐘，能量強度分別為3、6和9W/cm2， 記錄不同時間點的溶液溫度。結果顯示，在同一能量強度時，隨著時間延長，溶液溫度呈上 升趨勢，到6分鐘左右進入平臺期，在同一時間點，隨著能量強度增加，溶液溫度升高（如圖 2B所示）。
[0089] 實施例20.
[0090] 將實施例12製備的GS-PEG-IP/D0X遞藥系統溶於不同ρΗ(5· 0、6· 0和L 4)的PBS 溶液，使濃度為50 μ g/ml (以GS的質量計算），將0. 5ml遞藥系統置於相應pH值的PBS溶 液中，於不同時間點取樣〇. 5ml，同時補充相應溶劑0. 5ml，使用808納米的近紅外雷射器照 射5分鐘，固定能量強度為6W/cm2,之後立即取樣0. 5ml，同時補充相應溶劑0. 5ml，使用熒 光光譜儀（激發波長488納米，發射波長600納米）測定樣品中D0X的量，計算遞藥系統中 D0X的累積釋放量。結果顯示，D0X的釋放呈pH敏感性，隨著pH降低，釋放量增加，具有熱 觸發的釋放性質（如圖3所示）。
[0091] 實施例21.
[0092] 將實施例6合成的GS-PEG-IP遞藥載體溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度為50 μ g/ ml (以GS的質量計算），與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C02培養箱中孵育30分鐘，更換 新鮮培養液後繼續培養12小時，LIVE-DEAD試劑盒染色，使用Leica TCs SP5共聚焦顯微 鏡觀察細胞死亡情況，結果顯示，U251細胞幾乎沒有死亡，（如圖4A所示）。
[0093] 實施例22.
[0094] 將實施例6合成的GS-PEG-IP遞藥載體溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度為50 μ g/ ml (以GS的質量計算），與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C02培養箱中孵育30分鐘，使用 808納米的近紅外雷射器照射5分鐘，固定能量強度為6W/cm 2,更換新鮮培養液後繼續培養 12小時，LIVE-DEAD試劑盒染色，使用Leica TCs SP5共聚焦顯微鏡觀察細胞死亡情況，結 果顯示，U251細胞部分死亡（如圖4B所示）。
[0095] 實施例23.
[0096] 將實施例12製備的GS-PEG-IP/D0X遞藥系統溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度為 50 μ g/ml (以GS的質量計算），與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C02培養箱中孵育30分 鍾，更換新鮮培養液後繼續培養12小時，LIVE-DEAD試劑盒染色，使用Leica TCs SP5共聚 焦顯微鏡觀察細胞死亡情況，結果顯示，U251細胞部分死亡（如圖4C)。
[0097] 實施例24.
[0098] 將實施例12製備的GS-PEG-IP/D0X遞藥系統溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度為 50 μ g/ml (以GS的質量計算），與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C02培養箱中孵育30分 鍾，使用808納米的近紅外雷射器照射5分鐘，固定能量強度為6W/cm 2,更換新鮮培養液後 繼續培養12小時，LIVE-DEAD試劑盒染色，使用Leica TCs SP5共聚焦顯微鏡觀察細胞死 亡情況，結果顯示，U251細胞嚴重死亡（如圖4D。
[0099] 實施例25.
[0100] 將實施例6合成的GS-PEG-IP遞藥載體溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度分別為0. 1、 1、10、50、100和500 μ g/ml (以GS的質量計算），與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C02培 養箱中孵育2小時，更換新鮮培養液後繼續培養12小時，CCK-8試劑盒測定細胞死亡率。結 果顯示，U251細胞幾乎沒有死亡，半數致死量IC50為1. 139 X 103° μ g/ml (以GS的質量計 算）（如圖5所示）。
[0101] 實施例26.
[0102] 將實施例6合成的GS-PEG-IP遞藥載體溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度分別為0. 1、 1、10、50、100和50(^8/1111(以65的質量計算），與腦膠質瘤似51細胞於371：、5%0) 2培 養箱中孵育2小時，使用808納米的近紅外雷射器照射5分鐘，固定能量強度為6W/cm2,更 換新鮮培養液後繼續培養12小時，CCK-8試劑盒測定細胞死亡率。結果顯示，U251細胞部 分死亡，半數致死量IC 5(I為78. 78 μ g/ml (以GS的質量計算）（如圖5所示）。
[0103] 實施例27.
[0104] 將實施例12製備的GS-PEG-IP/D0X遞藥系統溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度分別 為0· 1、1、10、50、100和500μ g/ml (以GS的質量計算），與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C〇2培養箱中孵育2小時，更換新鮮培養液後繼續培養12小時，CCK-8試劑盒測定細胞死亡 率。結果顯示，U251細胞部分死亡，半數致死量IC 5(I為398. 15118/1111(以0(?的質量計算） (如圖5所示）。
[0105] 實施例28.
[0106] 將實施例12製備的GS-PEG-IP/D0X遞藥系統溶於pH7. 4的PBS溶液，使濃度分別 為0· 1、1、10、50、100和500μ g/ml (以GS的質量計算），與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C〇2培養箱中孵育2小時，使用808納米的近紅外雷射器照射5分鐘，固定能量強度為6W/ cm2,更換新鮮培養液後繼續培養12小時，CCK-8試劑盒測定細胞死亡率。結果顯示，U251 細胞嚴重死亡，半數致死量IC50為29. 49 μ g/ml (以GS的質量計算）和37. 45 μ g/ml (以 D0X的質量計算）（如圖5所示）。
[0107] 實施例29.
[0108] 將實施例12製備的GS-PEG/D0X或GS-PEG-IP/D0X遞藥系統溶於ρΗ7· 4的PBS溶 液，使濃度為50 μ g/ml (以GS的質量計算），分別與腦膠質瘤U251細胞於37°C、5% C02培 養箱中孵育30分鐘，使用Leica TCs SP5共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取情況。結果顯示，經 IP修飾後，遞藥系統在U251細胞的攝取明顯增加，表明IP具有腦膠質瘤細胞靶向性（如圖 6所示）。
[0109] 實施例30.
[0110] 將實施例12製備的GS-PEG/D0X或GS-PEG-IP/D0X遞藥系統溶於ρΗ7· 4的PBS溶 液，使濃度為50 μ g/ml (以GS的質量計算），分別與正常星形膠質細胞1800細胞於37°C、 5% C02培養箱中孵育30分鐘，使用Leica TCs SP5共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取情況。結 果顯示，經IP修飾前後，遞藥系統在1800細胞的攝取無明顯差異（如圖6所示）。
[0111] 本發明上述實驗中採用的雙功能PEG購自北京鍵凱科技有限公司，化療藥物D0X
【權利要求】
1. 一種用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統，其特徵在於，由源於白細胞介素13的多肽 (IP)修飾的遞藥載體和化療藥物構成；其中，多肽IP為靶向配體，介孔矽-石墨烯納米片 (GS)為基礎載體，通過親水性聚合物聚乙二醇（PEG)連接IP構建遞藥載體；獲得的遞藥載 體與難溶性小分子化療藥物阿黴素（DOX)形成遞藥系統，製得介孔矽-石墨烯納米片-聚 乙二醇-IP/阿黴素遞藥系統（GS-PEG-IP/DOX)。
2. 按權利要求1所述的用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統，其特徵在於，所述的IP修 飾的遞藥載體由GS、PEG和IP通過共價方式連接，其中PEG與GS的投料比是1.5?3.5 : 1， IP與GS的投料比是0. 1?1 : 1。
3. 按權利要求1所述的用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統，其特徵在於，所述的IP修 飾的遞藥載體與化療藥物DOX形成50?200納米大小的遞藥系統。
4. 按權利要求1所述的用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統，其特徵在於，所述的遞藥 載體按下述方法製備：通過表面活性劑自組裝法在石墨烯納米片表面包被介孔矽，所得GS 和PEG以1 : 1.5?3. 5的投料比溶於pH值為8.0磷酸鹽緩衝液中，室溫攪拌反應2小 時，兩種分子中的基團特異性反應，生成GS-PEG，離心法除去未反應的PEG並更換為pH值 為7.0磷酸鹽緩衝液；IP以0.1?1 : 1的投料比與GS-PEG室溫攪拌反應24小時後生成 GS-PEG-IP，離心法除去未反應的IP，即得所述的遞藥載體。
5. 按權利要求1所述的用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統，其特徵在於，所述的基礎 遞藥載體GS，所包被介孔矽佔 GS的含量是30 %?40%，介孔孔徑為2?4納米。
6. 按權利要求1所述的用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統，其特徵在於，所述的遞藥 系統按下述方法製備： 將DOX的甲醇儲備液加入製備的GS-PEG-IP遞藥載體中，DOX和載體的投料比為2 : 1， 室溫攪拌反應24小時，離心法除去未載入的DOX，氮氣吹乾，即得所述的遞藥系統。
7. 權利要求1的用於腦膠質瘤聯合治療的遞藥系統在製備聯合化療和光熱治療腦膠 質瘤的遞藥系統中的用途。
8. 按權利要求6的用途，其特徵在於，所述的遞藥系統中，GS表面覆蓋介孔矽的石墨烯 納米片，所述GS在近紅外的強吸收性質進行光熱治療。
9. 按權利要求6的用途，其特徵在於，所述的遞藥系統中，GS表面介孔矽的吸附作用以 及石墨烯納米片的π-π相互作用高效負載DOX，進行化療。
【文檔編號】A61P35/00GK104056269SQ201310097238
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月22日 優先權日:2013年3月22日
【發明者】黃容琴, 王 義 申請人:復旦大學