一種基因打靶用中間載體及其製備方法和用途的製作方法

2023-07-23 19:53:31 1

專利名稱：：一種基因打靶用中間載體及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，具體地涉及一種基因打耙用中間載體及其製備方法和用途。技術背景基因敲除(geneknockout)是利用同源重組(homologousrecombination)技術原理，按照研究者預先設計，在小鼠整體水平上進行的可以時空調控的滅活特定靶基因的理論和技術。其廣泛涉及分子生物學，分子遺傳學，胚胎學，實驗動物學等諸多學科領域，是目前研究基因功能最新最權威的技術平臺。目前基因敲除的工作大致可分為以下幾步1.設計並構建預敲除的基因打靶載體(targetingvector);2.將線性化的打靶載體通過電轉法轉入小鼠胚胎幹細胞(ES細胞)；3.轉染ES細胞的體外培養和篩選；4.將篩選出的中靶陽性克隆顯微注射入小鼠囊胚；5.假孕母鼠接受囊胚移植產生出嵌合體小鼠；6.嵌合體小鼠再與囊胚供體小鼠雜交，即可得到雜合型的基因敲除小鼠。從以上實驗步驟不難看出獲得基因敲除小鼠的關鍵與基礎環節是打耙載體的設計與構建，因其是否成功將直接決定基因敲除工作的進行。打靶載體是用於基因組DNA上特定位點的基因重組和突變的DNA分子構件。其基本組分是載體骨架；以及基因組DNA上打靶位點兩側的同源序列，分別稱為左、右兩個同源臂。考慮到DNA轉染和基因打耙都是小概率事件，往往需在載體中組裝正性選擇標誌(positiveselectionmarker)來選出符合設計要求的打靶產物。正性選擇標誌(如對G418有抗性的Neo基因)可選擇出現概率低於萬分之一的穩定整合了打靶載體的轉染細胞。目前本領域主要採用的是分步法逐步構建基因敲除打靶載體。此類方法步驟繁瑣、周期長，並且在構建過程中極易出錯，導致了很大的人力、物力的消耗。其大致實驗步驟舉例如下第一步採用PCR方法分別得到左右各3-5kb的同源臂，以及要敲除的位於兩個同源臂之間的待錨定基因外顯子，然後通過TA克隆方法分別將PCR產物裝入TA克隆載體從而獲得待敲除目的基因組片段，經過限制性內切酶酶切鑑定和測序最終驗證擴增序列的正確性(參見圖1)。第二步將克隆得到的左右同源臂依次裝入pDNR-lr載體中兩個loxp位點兩側，然後將要敲除的基因或基因外顯子裝入兩個loxp位點之間(如下圖)。由於兩個loxp位點之間含有一個四環素抗性基因，兩個loxp位點外側多克隆位點很少，所以，這一步是該種方法的關鍵，也是最困難的一部分，往往需要花費很長的時間。如果找不到合適的多克隆位點，構建打靶載體以及後面的同源重組將無法實現(參見圖2)。第三步將pk-ll載體中的陽性篩選基因裝入第二步中構建的帶左右同源臂的載體，並最終獲得帶陽性篩選標記，敲除基因外顯子和兩端同源臂的打靶載體(參見圖3)。通過以上介紹，可知因為載體以及載體的多克隆位點的限制加上PCR的不確定性，採用現有方法構建基因敲除打靶載體步驟複雜，耗時長。一般情況下，採用現有方法構建打靶載體需要進行反覆的擴增、TA克隆、限制性內切酶酶切驗證和測序，花費大量的時間和經費。因為構建打靶載體成功與否將直接關係到建立基因敲除小鼠工作的順利進行，為了加快速度，節省更多的人力物力財力，進一步縮短獲得基因敲除老鼠的實驗周期，本領域需要建立能克服現有技術的缺陷的新技術。
發明內容為了使建立基因敲除打靶載體的工作速度更快，成本更低，成功率更高，本發明提供了一種的基因打耙用中間載體。本發明所要解決的第一個技術問題是提供了一種基因打靶用中間載體。該載體含有兩個loxp位點序列和兩端各連接一個frt位點序列的陽性篩選基因。兩端各連接了一個frt位點序列的陽性篩選基因既可以位於兩個loxp位點的上遊，業可以位於其下遊。其中，上述的兩個loxp位點序列之間還有一多克隆位點(MCS)。該多克隆位點可以根據需要打靶的基因序列在現有的多克隆位點中進行選擇。優選的，該多克隆位點具有SEQIDNo.4所示的序列。其中，上述的陽性篩選基因也可以在現有的基因打靶常用的陽性篩選基因中選擇。優選的，上述陽性篩選基因為pgkNEO基因。進一步的，上述的基因打靶用中間載體還含有抗性篩選基因的序列。上述的抗性篩選基因也可以在本領域常用的抗性篩選基因中選擇。優選的，上述抗性篩選基因為AMPr、kan、chl、tet或neo中的至少一種。更進一步的，上述的基因打靶用載體含有SEQIDNo.1所示的序列。SEQIDNo.1所示的序列依次含有由loxp位點序列(SEQIDNo.3)、多克隆位點序列(SEQIDNo.4)、loxp位點序列(SEQIDNo.3)、frt位點序列(SEQIDNo.5)、陽性篩選基因序列(SEQIDNo.6)、frt位點序列(SEQIDNo.5)組成。優選的，上述的基因打靶用載體具有SEQIDNo.2所示的序列。本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種製備上述的基因打耙用中間載體的方法。該方法包括以下步驟a、利用限制性內切酶HindIII和KpnI，分步將一個loxp位點，一個frt位點從pk-11載體上切下並裝入pCDNA3.1(+)載體上，克隆獲得pCDNA3.1-frt-loxp;b、利用限制性內切酶Sail和BstXI，分步將loxp位點從pCDNA3.1-frt-loxp載體上切下並裝入pGEM-Teasy載體上，克隆獲得pGEM-Teasy-loxp;c、利用限制性內切酶Apal，將loxp位點從pGEM-Teasy-loxp載體上切下並裝入pk-11載體上，克隆獲得目標載體。本發明所要解決的第三個技術問題是提供上述基因敲除用中間載體在製備基因打耙載體中的用途。本發明所要解決的第四個技術問題是提供一種製備上述基因打靶載體的方法。該方法包括以下步驟a、擴增得到待敲除基因或外顯子，通過多克隆位點將待敲除基因或外顯子裝入上述任一項所述的基因敲除用中間載體中，酶切驗證並測序。b、擴增含有待敲除基因或外顯子及其兩端同源臂的基因組DNA片段，通過TA克隆方法將其克隆到TA克隆載體中，並測序驗證。c、利用待敲除基因所選定外顯子兩端的限制性內切酶酶切位點，通過PCR擴增，將步驟a所得載體中含雙loxp位點、待敲除基因或外顯子以及陽性篩選基因的片段返裝入含有步驟b所得的TA載體中，獲得打靶載體。通過對現有技術的缺點的分析，本發明首次提出使同時具有雙loxp位點和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因的中間載體，以克服上述缺點。只要使用本發明載體，構建基因敲除打靶載體就可以通過簡單的兩步方法完成，而且速度快，簡易，節約，減少了出錯的可能。本發明基因敲除用中間載體可以在現有的眾多載體(如pk-ll、pdnr-lr)上進行改建或重頭設計，其中的各項拼接操作都可以根據現有的本領域常規技術實現。因打靶用中間載體主要是基因敲除打靶載體本發明基因打靶用中間載體中起重要作用的幾個元件的序列如下loxp位點(SEQIDNo.3):5，-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3，；frt位點(SEQIDNo.4):5，-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3，；多克隆位點(SEQIDNo.5):5'-TCGAGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCCCCTCGA-3，。顯然，根據本發明提出的構建具有雙loxp位點和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因的中間載體的思想，是可以用眾多的現有載體為基礎，進行從頭設計或改建獲得本發明基因打靶用中間載體，根據本領域常識，可以選用不同的陽性篩選基因和抗性篩選基因，載體上也可以再連接其它的功能單元，但是只要基因打靶用中間載體上同時具有了雙loxp位點和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因，那麼都應在本發明的保護範圍之內。本發明的有益效果在於從構建打靶載體的根本出發，在以往實驗方法的基礎上，本發明首次開發出了一種能用於基因打靶載體構建的中間載體。由於pKDL-HZG載體具有普遍、通用的使用價值，可以運用到現階段幾乎所有類型的基因敲除打靶載體構建系統，而且簡化構建打靶載體的實驗路線，易化實驗的操作，減少試驗出錯的機率；節約時間，降低成本，相對於現有技術都有很明顯的優點，使用範圍廣，具有很好的應用市場前景。圖1表示現有技術的第一階段流程。圖2表示現有技術的第二階段流程。圖3表示現有技術的第三階段流程。圖4表示本發明基因打耙中間載體pKDL-HZG的構建示意圖。圖5表示本發明基因打耙中間載體pKDL-HZG的示意圖。圖6表示使用本發明基因打耙中間載體構建基因打耙載體的第一階段流程。圖7表示使用本發明基因打耙中間載體構建基因打耙載體的第二階段流程。以下結合具體實施方式進一步說明但並不限制本發明具體實施方式實施例一、本發明基因打靶用中間載體的製備因為loxp位點全長僅34bp，最好在兩個lo鄧位點之間插入常用的多克隆位點以便於使用。目前，同時具備兩個loxp位點和常用的多克隆位點的片段尚不存在，只有通過拼接或者直接設計合成，如直接合成，則費用高昂且不易抄作，現階段很少有公司能直接合成150bp以上的DNA序列。為了節約資金和減少克隆中帶來的突變，採用拼接的方式，簡要流程參見圖4。現將方法細述如下l.利用限制性內切酶HindIII和KpnI，分步將一個loxp位點，一個frt位點從pk-11載體上切下並裝入pCDNA3.1(+)載體上，克隆獲得pCDNA3.1-frt-loxp。酶切體系如下(限制性內切酶購自fermentas公司)10xKpnlbuffer10ul10xKpnlbuffer5ulKpnl1ulKpnl1ulPlasmid—pk-1189ulPlasmid—pCDNA3.144ullOOul50ul37'C水浴反應12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。採用promega公司膠回收試劑盒進行回收。lOxredbuffer10ullOxredbuffer5ulHindIII1ulHindIII1ulPlasmid—pk-ll89ulPlasmid—pCDNA3.144ullOOul50ul37。C水浴反應12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。採用promega公司膠回收試劑盒進行回收。連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4廳ligasebuffer1ulT4DMligase1ul插入片段(frt-loxp)5ul載體(pCDM3.1)_3ul10ul16'C水浴連接反應2小時，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a，挑取單菌落並酶切用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結果與預期一致，從而獲得pCDNA3.1-frt-loxp克隆。2.利用限制性內切酶SalI和BstXI，分步將loxp位點從pCDNA3.1-frt-loxp載體上切下並裝入pGEM-Teasy載體上，克隆獲得pGEM-Teasy-1oxp。酶切體系如下(限制性內切酶購自fermentas公司)10xorangebuffer10ul10xKpnlbuffer5ulSail1ulSail1ulPlasmid-pCDNA3.l-frt一loxp89ulPlasmid-pGEM-Teasy44ullOOul50ul37'C水浴反應12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。採用promega公司膠回收試劑盒進行回收。10xorangebuffer10ullOxKpnlbuffer5ulBstXI1ulBstXI1ulPlasmid-pCDM3.1-frt-loxp89ulPlasmid-pGEM-Teasy44ullOOul50ul55。C水浴反應6小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。採用promega公司膠回收試劑盒進行回收。連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4DMligasebuffer1ulT4DMligase1ul插入片段(loxp)5ul載體(pGEM-Teasy)_3ul10ul16'C水浴連接反應2小時，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a，挑取單菌落並酶切用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結果與預期一致，從而獲得pGEM-Teasy-loxp克隆。3.利用限制性內切酶ApaI，將loxp位點從pGEM-Teasy-loxp載體上切下並裝入pk-ll載體上，最終克隆獲得pKDL-HZG。酶切體系(限制性內切酶購自fermentas公司)10xbluebuffer10ul10xbluebuffer5ulApal1ulApal1ulPlasmid-pGEM-Teasy-loxp89ulPlasmid-pk-ll44ullOOul~^Tl37。C水洛反應12小時，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100伏；30分鐘。採用promega公司膠回收試劑盒進行回收。連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4DMligasebuffer1ulT4腿ligase1ul插入片段(loxp)5ul載體(pk-11)_^10ul16'C水浴連接反應2小時，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a，挑取單菌落並酶切驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證結果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結果與預期一致，獲得了這一關鍵的基因敲除用中間載體，將其命名為pKDL-HZG(具有SEQIDNo.l所示的序列)，其結構見圖5。該載體具有雙loxp和帶有兩個frt位點的陽性篩選基因pgkNEO，而且在雙loxp位點之間插入了多達15個多克隆位點，這更加簡化了插入敲除外顯子的實驗過程。實施例二、使用本發明基因打靶用中間載體構建打靶載體使用實施例一製備的基因敲除用中間載體構建小鼠PNAS-4(GENEBANK登錄號NC—000067,位置Chrl:180074587-180086143bp，+strand，全長11.3kb)基因敲除載體以用於敲除小鼠PNAS-4基因。1.採用primer5軟體設計擴增長鏈基因組DNA以及待敲除外顯子的引物，並遞交invitrogen(上海)公司合成。2.PCR擴增獲得小鼠PNAS-4基因外顯子2(exon2，序列見SEQIDNo.12)，利用引物兩端設計的酶切位點EcoRI將外顯子2裝入PKDL-HZG載體，酶切所得用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序。獲得片段frt-pgkNE0-frt_1oxp-exon2-1oxp。2.1擴增外顯子2(exon2)片段2.1.1引物上遊弓I物A(SEQIDNo-6):5，-gaattcaagtgatagag"cacctgact-3，下遊弓I物A(SEQIDNo.7):5，-gaattcaccctgggcaaaetaga-3，2.1.2擴增條件94°C2分鐘94°C30秒；52°C30秒；72°C1分鐘；循環30次72°C7分鐘4°C°°2.2TA克隆獲得TA-exon22Xr印idligasebuffer5ulPCR產物2ulTA載體0.5ulT4■ligase1ulMilliqH20_1.5ul10ul2.3酶切與連接酶切體系如下(限制性內切酶購自fennentas公司)10xEcoRIbuffer5ul10xEcoRIbuffer5ulEcoRI1ulEcoRI1ulPlasmid-TA-exon244ulPlasmid-pkd卜HZG44ul50ul50ul連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4薩ligasebuffer1ulT4DNAligase1ul插入片段(exon2)5ul載體(pkdl-HZG)_3ul10ul2.4酶切用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果正確；陽性克隆送到irwitrogen(上海)公司進行測序，結果與預期一致，驗證正確。酶切驗證體系如下(限制性內切酶購自fermentas公司)10xEcoRIbuffer3ulEcoRI1ulPlasmid-pkd卜HZG-exon226ul30ul3.PCR擴增獲得11.3KB的長鏈基因組DNA片段，裝入TA克隆載體，釆用酶切，PCR，測序等手段進行驗證。3.1擴增長鏈基因組DNA片段3.1.1引物上遊引物B(SEQIDNo.8):5，-gcttactgtcttgetcgtcatg-3，下遊引物B(SEQIDNo.9):5，-tcagatggtaggcgttgc-3，3.1.2擴增條件94°C2分鐘94°C30秒；55°C30秒；68°C11分鐘；循環30次72°C7分鐘4°C°°1.4酶切驗證，結果正確。酶切驗證體系如下(限制性內切酶購自fermentas公司)10xEcoRIbuffer3ulEcoRI1ulPlasmid-pkd卜HZG-exon226ul30ul4.利用待敲除外顯子兩端的可以利用的酶切位點BsaBI和SanDI，設計兩端帶BsaBI和SanDI的引物擴增frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段，然後將frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段返裝回TA-長鏈，置換掉長鏈的外顯子2，最終獲得打靶載體。4.1擴增frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp片段4.1.1引物上遊弓I物C(SEQIDNo.10):5，-gatacacatcgaattgccgcggtaccg-3，下遊弓I物C(SEQIDNo.11):5，-tacgtaggagetccaccgeggt-3，4.1.2擴增條件94°C2分鐘94'C30秒；56°C30秒；72°C3分鐘；循環30次72°C7分鐘4。C>4.1.3TA克隆10XligasebufferPCR產物TA載體T4DNAligeiseMilliqH20301ul5ul5ul1ul4ul1.4酶切與連接5ul1ul44ul50ul10xorangebuffer5ulBsaBI1ulPlasmid-TA-長鏈基因組片段_44ul50ul10xyellowbuffer5ulSnaBI1ulPlasmid-TA-frt一pgkNE0-frt-loxp-exon2-loxp44ul50ul酶切體系(限制性內切酶購自fermentas公司)10xorangebufferBsaBIPlasmid—TA—frt—pgkNE0—frt—loxp—exon2—loxp10xyellowbufferSnaBIPlasmid-TA-長鏈基因組片段5ul1ul44ul50ul連接體系如下(連接酶購自fermentas公司)10xT4■ligasebufferT4DMligase插入片段(frt-pgkNEO-frt-loxp-exon2-loxp)載體(TA-長鏈基因組片段)1ul1ul5ul3ul10ul4.1.5驗證10xorangebuffer5ulBsaBI1ulPlasmid-TA-長鏈-frt-pgkNEO-frt-1oxp-exon2-loxp44ul50ul10xyellowbuffer5ulSnaBI1ulPlasmid-TA-長鏈-frt-pgkNEO-frt-1oxp-exon2-loxp44ul50ul所得用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果正確；進一步送到invitrogen(上海)公司進行測序，結果與預期一致，表明得到了預期的打靶載體。由上述實施例可以知道以該載體為基本工具，建立一個新的方法，可將打耙載體的構建縮減為兩個主要步驟進行第一階段擴增獲得待敲除基因的外顯子，將待敲除外顯子裝入實施例一製備的的pKDL-HZG中間載體，酶切驗證並測序。同時擴增含有待敲除基因的外顯子兩端同源臂以及敲除外顯子本身的基因組DNA片段通過TA克隆方法分別將其克隆到TA克隆載體中，並測序驗證(參見圖6)。第二階段然後利用待敲除基因所選定外顯子兩端的限制性內切酶酶切位點(下圖為A，B)，通過PCR擴增，將包含雙loxp位點，待敲除基因或外顯子以及陽性篩選基因的片段返裝入含有左右同源臂的TA載體，最終獲得打靶載體(參見圖7)。以上實驗路線和實施例二的具體說明清楚的反映了運用該本發明中間載體來構建基因打靶載體的簡易性。時間上，運用該載體大致需要15-30天(見表l)，這大大的縮短了整個基因敲除實驗的總時間，使實驗周期大大縮短。表1使用本發明中間載體pKDL-HZG構建打靶載體的時間分析實驗步驟所用時間1.PCR分別擴增待敲除基因的外顯子；待敲除基因的外顯子兩端同源臂以及敲除外顯子本身的基因組DNA片段，通過TA克隆方法將其克隆到TA克隆載體中約l天2.TA克隆酶切驗證約l天3.送陽性克隆至測序公司測序約5-10天4.測序完畢後將敲除外顯子裝入pkdl-HZG約l天5.將包含雙loxp位點，待敲除基因或外顯子以及陽性篩選基因的片段返裝入含有左右同源臂的TA載體，最終獲得打靶載體約2天6.最後將獲得的打耙載體送測序公司測序測序驗證約5-10天同時，由於pKDL-HZG載體具有普遍、通用的使用價值，可以運用到現階段幾乎所有類型的基因敲除打靶載體構建系統，而且在時間，成本，出錯率上相對於現有技術都有很明顯的優點(見表2)。目前，運用這一載體已經成功順利的構建了多個打靶載體。表2使用pKDL-HZG載體與使用現有技術構建打耙載體優劣比較tableseeoriginaldocumentpage14從上述實例可知，在現有技術的基礎上，本發明首次公開了一種能用於基因敲除打靶載體構建的關鍵中間載體。採用本發明中間載體能簡化構建打靶載體的實驗路線，易化實驗的操作，減少試驗出錯的機率；能從根本上縮短實驗周期減少實驗開支，為整個實驗進程的順利進行打下了堅實的基礎；且使用範圍廣，市場前景廣闊。序列表SEQUENCELISTING四川大學華西醫院—種基因打靶用中間載體及其製備方法和用途A07020012Patentlnversion3.412068DNAArtificialArtificialmisc一feature(361)..(361)nisa,c，g,ortmisc—feature(1384)..(1384)nisa，c,g，ortmisc一feature(1445)..(1445)nisa，c,g,ort1ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcgaggtcgacctgcaggcggccgcg60aattcactagtgattatcgaattcccgcggccgccatggcggccgggagcatgcgacgtc120gggcccccctcgaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcgaggtcgacga180agttcctatactttctagag肌taggaacttcctcgacggtatcgataagcttctgatgg240aattagaacttggcaaaacaatactgagaatgaagtgtatgtggaacagaggctgctgat300ctcgttcttcaggctatgaaactgacacatttgga肌ccacagtacttag肌ccacaaag360nggg犯tcaag3g肌a肌caatgatcccacgagagatctatagatctatagatcatgagt420gggaggaatgagctggcccttaatttggttttgcttgtttaaattatgatatccaactat480gaaacattatcat肌agc肌tagt肌agagccttcagtaaagagcaggcatttatctaat540cccaccccacccccacccccgtagctccaatccttccattcaaaatgtaggtactctgtt600ctcacccttctt肌caaagtatgacaggaaaaacttccattttagtggacatctttattg660tttaatagatcatcaatttctgcagacttacagcggatcccctcagaagaactcgtcaag720aaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgta肌gcacgagg肌780gcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtc840ctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccatt900ttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcatcgccgtc960gggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttc1020gtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcg1080atgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcat1140tgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagc肌ggtgggatgacaggagatcctg1200ccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgac肌cgtcgagcac1260agctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcag1320ttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctga1380cagncgg肌cacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaa1440tagcutttccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatggccga1500tcccatattggctgcaggtcg肌aggcccggagatgaggaagaggag肌cagcgcggcag1560acgtgcgcttttgaagcgtgcagaatgccgggcctccggaggaccttcgggcgcccgccc1620cgcccctgagcccgcccctgagcccgcccccggacccaccccttcccagcctctgagccc1680agaaagcgaaggagcaaagctgctattggccgctgccccaaaggcctacccgcttccatt1740gctcagcggtgctgtccatetgcacgagactagtgagacgtgctacttccatttgtcacg1800tcctgcacgacgcgagctgcggggcggggggg肌cttcctgactaggggaggagtagaag1860gtggcgcgaaggggccaccaaagaacggagecggttggcgcctaccggtggatgtggaat1920gtgtgcgaggccagaggccacttgtgtagcgcc肌gtgcccagcggggctgcta肌gcgc1980atgctccagactgccttgggaaaagcgcctcccctacccggtagaattggccgcg肌gtt2040cctatactttctagagaataggaacttc206824967DNAArtificialartificialmisc_feature(1037)..(1037)nisa，c，g，ortmisc_feature(2060)..(2060)nisa,c,g,ortmisc—feature(2121)..(2121)nisa，c，g，ort2ctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggtt狄gcgcagcgtga60ccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcg120ccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgat180ttagtgctttacggcacctcgaccccaa肌肌cttgattagggtgatggttc狄gtagtg240ggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaata300gtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatt360tat肌gggattttgccgatttcggcctattggtta肌aaatgagctgattt肌caa通aat420ttaacgcgaa簡aacaaaatatt肌cgcttacaatttccattcgccattcaggctgcg480caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600t肌aacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcg肌ttgccgcggta660ccgggceecccctcgaat肌cttcgtat肌tgtatgctatacg肌gttattcgaggtega720cctgcaggcggccgcgaattcactagtgattatcgaattcccgcggccgccatggcggcc780gggagcatgcgacgtcgggcccccctcgaataacttcgtataatgtatgctatacgaagt840tattcgaggtcgacgaagttcctatactttctagagaataggaacttcctcgacggtatc900gataagcttctgatggaattagaacttggc肌aacaatactgagaatgaagtgtatgtgg960aacagaggctgctgatctcgttcttcaggctatgaaactgacaca付tggaaaccacagt1020acttagaaccacaaagnggg肌tcaagagaaaaacaatgatcccacgagagatctataga1080tctatagatcatgagtgggaggaatgagctggcccttaatttggttttgcttgt"aaat1140tatgatatcc肌ctatga肌cattatcata肌gc肌tagtaaagagccttcagta肌gag1200caggcatttatctaatcccaccccacccccacccccgtagctccaatccttccattcaaa1260atgtaggtactctgttctcacccttcttaacaaagtatgacaggaaaaacttccatttta1320gtggacatctttattgtttaatagatcatc肌tttctgcagacttacagcggatcccctc1380agaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgatac1440cgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacggg1500tagcc肌cgctatgtcctgatagcggtccgccac狄ccagccggccacagtcgatg肌tc1560cagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacga1620cgagatcatcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcga1680gcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtac1740gtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcg肌tgggcaggtagccggatc肌gcg1800tatgcagccgccgeattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtggg1860atgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtccctteccgcttcag1920tgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcg1980ctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgaca肌aag肌ccg2040ggcgcccctgcgctgacagncggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtg2100cccagtcatagccgaatagcntttccaccc肌gcggccggag肌cctgcgtgc肌tccat2160cttgttcaatggccgatcccatattggctgcaggtcgaaaggcccggagatgaggaagag2220gagaacagcgcggcagacgtgcgcttttgaagcgtgcagaatgccgggcctccggaggac2280cttcgggcgcccgccccgcccctgagcccgcccctgagcccgcccccggacccaccccttcccagcctctgagcccagaaagcg肌ggagc肌agctgctattggccgctgcccc肌agg2400cctacccgcttccattgctcagcggtgctgtccatctgcacgag狄tagtgagacgtgct2460acttccatttgtcacgtcctgcacgacgcgagctgcggggcgggggggaacttcctgact2520aggggaggagtag肌ggtggcgcg肌ggggccaccaaagaacggagccggttggcgccta2580ccggtggatgtgg肌tgtgtgcgaggccagaggccacttgtgtagcgccaagtgcccagc2640ggggctgcta肌gcgcatgctccagactgccttggga肌agcgcctcccctacccggtag2700aattggccgcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggccgccaccgcggtg"60gagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtc2820atagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccgg2880aagcata肌gtgt肌agcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgtt2940gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcgg3000ccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactga3060ctcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagetcaetcaaaggcggtaat3120acggttatccacagaatcaggggataacgcagg汪a級gaacatgtgagcaaaaggcc級gca3180肌aggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctcegcccccc3240tgacgagcatcacaaa級atcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactata3300aagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgcc3360gcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctc3420acgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacga3480accccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaaccc3540ggt肌gacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgag3600gtatgtaggcggtgctacagagttcttg肌gtggtggcct肌ctacggct狄actagaag3660gacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtag3720ctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagca3780gattacgcgcagaa汪aaaagg汪tctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctga3840cgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatt級tc級a級aaggat3900cttcacctagatcctttt肌att肌肌atg肌gtttt肌atcaatcta肌gt由tatga3960gtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctg4020tctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacggga4080gggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctcc4140agatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaac4200tttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgcc4260agtt肌tagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtc4320gtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccc4380catgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagtt4440ggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgcc4500atccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtg4560tatgcggcgaccgagttgctcltgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatag4620cag肌ctttaa肌gtgctcatcattgg肌aacgttc"cggggcg肌肌ctctc肌ggat4680cttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagc4740atcttttactttcaccagcgtttctgggtgagc肌肌acagg肌ggcaaaatgccgc肌a4800aaagggaata汪gggcgacacgg汪a汪tgttga汪tactcatactcttcctttttcaatatta4860ttgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacat汪tttgaatgt汪tttagaa4920aa由肌c肌ataggggttccgcgcacatttccccg肌aagtgccac4967334DNAArtificialartificial3ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat34434DNAArtificialartificial4gaagttcctatactttctagagaataggaacttc34599DNAArtificialartificial5tcgaggtcgacctgcaggcggccgcgaattcactagtgattatcgaattcccgcggccgc60catggcggccgggagcatgcgacgtcgggcccccctcga99627DNAArtificialartificial6gaattcaagtgatagagatcacctgac27723DNAArtificialartificial7gaattcaccctgggcaaactaga822DNAArtificialartificial8gcttactgtcttgctcgtcatg22918DNAArtificialartificial9tcagatggtaggcgttgc181027DNAArtificialartificial10gatacacatcgaattgccgcggtaccg271122DNAArtificialartificial11tacgtaggagctccaccgcggt22121209DNAArtificialartificial12aagtgatagagatcacctgactgaagcaccgggatcaaaggcatgccacatcatgctctg60gggctgtgtgtgtgctgttttgatcactaatggcacttttatgtcaatcttgttatcaac120ctgactgaaatttagatttcgtttcatttacattttatttattatgtgctaaaccctaag180taaaatgaaacctttgtctatacacaggaaagccttccaagttagatgtgggagaatagg240cgaggtaggctgctcttggtagagtgcagcattggaaaggaaaatacc肌gacttggatt300tatacttgtcc付tcctgtagagttaggctataaatgatgatatgctaaagttgtttttt360ctctctttagtactggatgaatgaatacacctcatctattggaattggagUtttcattc420tggaattgaagtatatggcagaggtatgtgtgcacatagcttaaatatgttttctgagga480ttctgccagctttaaaagaaatacagaatcatgatgttaggtctttttgtctcttttctt540ttaagtaacttacatatgttgtagaaagtagaataaaactcccccatttgtttatactgt600ttcaaaaactgtctgtggtagcatacatttgttccattatctttttttctaattactatg660tcttctaaaacattttcttaaccagctctggtggcacacacttaatcccagtattcagga720ggcagaggcagagag汪ttcctgtgagtttgaagcc汪gcctagtatacagagtgagttcca780ggacagccagagctacacagtaagaetctgtcttaaaaacaaa汪acaaagaagccattgt840ttatgaagttatta肌ccatgattgtttttctttactatgtatcagagtttctaagaaac900ttgtacactttgaaaaaactacataacaaaaat肌tcattttagttagtagaagtgtcaa960actttaaataccattttctgagggagtttcagtagaatgttggatttggcaggcctgtga1020gcatcaataaagtctaagacattgctgagaaaatcttgtgttcagtaatatctagcattt1080ttctcagagttatagcgaaatatcattgtg肌ttataagcttgccctttagcaggaggtc1140ctgtacttggtagtctttgaactaggtagtctttgt肌cct肌aatacattatctagttt1200gcccagggt1209權利要求1、一種基因打靶用中間載體，其特徵在於含有兩個loxp位點序列和兩端各連接一個frt位點序列的陽性篩選基因。2、根據權利要求1所述的基因打靶用中間載體，其特徵在於所述的兩個loxp位點序列之間還有一多克隆位點。3、根據權利要求1所述的基因打靶用中間載體，其特徵在於所述的多克隆位點具有SEQIDNo.4所示的序列。4、根據權利要求1所述的基因打靶用中間載體，其特徵在於所述的陽性篩選基因為pgkNEO基因。5、根據權利要求1所述的基因打靶用載體，其特徵在於還含有抗性篩選基因的序列。6、根據權利要求15任一項所述的基因打靶用載體，其特徵在於含有SEQIDNo.l所示的序列。7、根據權利要求16任一項所述的基因打靶用載體，其特徵在於具有SEQIDNo,2所示的序列。8、一種製備權利要求17任一項所述的基因打靶用中間載體的方法，其特徵在於包括以下步驟a、利用限制性內切酶HindIII和KpnI，分步將一個loxp位點，一個frt位點從pk-ll載體上切下並裝入pCDNA3.1(+)載體上，克隆獲得pCDNA3.1-frt-loxp;b、利用限制性內切酶Sail和BstXI，分步將loxp位點從pCDNA3.1-frt-loxp載體上切下並裝入pGEM-Teasy載體上，克隆獲得pGEM-Teasy-loxp;c、利用限制性內切酶Apal，將loxp位點從pGEM-Teasy-loxp載體上切下並裝入pk-ll載體上，克隆獲得目標載體。9、權利要求17任一項所述的基因敲除用中間載體在製備基因打靶載體中的用途。10、一種製備基因打耙載體的方法，其特徵在於包括以下步驟a、擴增得到待敲除基因或外顯子，通過多克隆位點將待敲除基因或外顯子裝入權利要求17任一項所述的基因敲除用中間載體中，酶切驗證並測序；b、擴增含有待敲除基因或外顯子及其兩端同源臂的基因組DNA片段，通過TA克隆方法將其克隆到TA克隆載體中，並測序驗證；c、利用待敲除基因所選定外顯子兩端的限制性內切酶酶切位點，通過PCR擴增，將步驟a所得載體中含雙loxp位點、待敲除基因或外顯子以及陽性篩選基因的片段返裝入含有步驟b所得的TA載體中，獲得打靶載體。全文摘要本發明屬於生物
技術領域：
，具體地涉及一種基因打靶用中間載體及其製備方法和用途。基因打靶用中間載體含有兩個loxp位點序列和兩端各連接一個frt位點序列的陽性篩選基因。本發明從構建打靶載體的根本出發，在以往實驗方法的基礎上，首次開發出了一種能用於基因敲除打靶載體構建的中間載體。由於該載體具有普遍、通用的使用價值，可以運用到現階段幾乎所有類型的基因敲除打靶載體構建系統，而且簡化構建打靶載體的實驗路線，易化實驗的操作，減少試驗出錯的機率；節約時間，降低成本，相對於現有技術都有很明顯的優點，使用範圍廣，具有很好的應用市場前景。文檔編號C12N15/63GK101397570SQ20071005016公開日2009年4月1日申請日期2007年9月29日優先權日2007年9月29日發明者呂小巖,欽周,錚張,胡忠國,魏於全申請人:四川大學華西醫院