具有抑制癌細胞生長功能的新的人蛋白及其編碼序列的製作方法

2023-07-27 13:44:56 2

專利名稱：具有抑制癌細胞生長功能的新的人蛋白及其編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的編碼具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。
人基因組學研究目前是國際上的熱點，除人染色體DNA大規模測序，表達序列測序(EST)的方法外，還缺少從功能開始的篩選具有功能基因的高通量的方法。
癌症是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預防腫瘤，目前人們已越來越關注腫瘤的基因治療。因此，本領域迫切需要開發研究具有抑癌功能的人蛋白及其激動劑/抑制劑。
本發明的目的是提供一類新的具有抑癌功能的人蛋白多肽以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的具有抑癌功能的蛋白多肽，它包含具有選自下組的胺基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26；或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽是具有選自下組的胺基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:26。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼上述的具有抑癌功能的蛋白多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26。更佳地，該多核苷酸的序列選自下組SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27的編碼區序列或全長序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備具有具有抑癌功能的蛋白活性的多肽的製備方法，該方法包含(a)在適合表達具有抑癌功能的蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有具有抑癌功能的蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的具有抑癌功能的蛋白多肽特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的10-800個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的具有抑癌功能的蛋白多肽以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療癌症以及細胞異常增殖等病症。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
本發明採用大規模cDNA克隆轉染癌細胞，在獲得具有抑癌作用的基礎上，經測序證明為新的基因，進一步得到全長cDNA克隆。DNA轉染試驗證明，本發明的具有抑癌功能的蛋白對癌細胞(肝癌細胞)具有抑制克隆形成的作用，其抑制率在50％或50％以上。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的具有抑癌功能的蛋白或多肽」是指具有抑癌功能的蛋白多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化具有抑癌功能的蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。具有抑癌功能的蛋白多肽的純度能用胺基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括具有抑癌功能的人蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然具有抑癌功能的人蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。以SP82蛋白(在本申請中，蛋白質的命名採用其克隆編號)為例，編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO:3所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質，但與SEQ ID NO:3所示的編碼區序列有差別的核酸序列。以SP192蛋白(在本申請中，蛋白質的命名採用其克隆編號)為例，編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO:6所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ IDNO:5的蛋白質，但與SEQ ID NO:6所示的編碼區序列有差別的核酸序列。對於其他具有抑癌功能的蛋白，可依此類推。對於其他具有抑癌功能的蛋白，可依此類推。
編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ IDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的DNA序列能用幾種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離DNA。這些技術包括但不局限於1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源性核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特徵的克隆的DNA片段。
編碼具有抑癌功能的蛋白的特異DNA片段序列產生也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。當需要的多肽產物的整個胺基酸序列已知時，DNA序列的直接化學合成是經常選用的方法。如果所需的胺基酸的整個序列不清楚時，DNA序列的直接化學合成是不可能的，選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA並進行逆轉錄，形成質粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業途徑獲得(Qiagene)。而構建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。還可得到商業供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產物也能克隆。
可用常規方法從這些cDNA文庫中篩選本發明的基因。這些方法包括(但不限於)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標誌基因的功能出現或喪失；(3)測定具有抑癌功能的蛋白的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2kb之內，較佳地為1kb之內。此處所用的探針通常是在本發明的基因DNA序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，螢光素或酶(如鹼性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測具有抑癌功能的蛋白基因表達的蛋白產物可用免疫學技術如Western印跡法，放射免疫沉澱法，酶聯免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230:1350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發明的基因，或者各種DNA片段等的核苷酸序列的測定可用常規方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)。這類核苷酸序列測定也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反覆進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或具有抑癌功能的蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的具有抑癌功能的蛋白多肽(Science,1984；224:1431)。一般來說有以下步驟(1)．用本發明的編碼具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)．在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3)．從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，具有抑癌功能的人蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含具有抑癌功能的人蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,coldSpring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可包被於細胞內、細胞外或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的具有抑癌功能的人蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)直接做為藥物治療具有抑癌功能的蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用於篩選促進或對抗具有抑癌功能的蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。例如，抗體可用於激活或抑制具有抑癌功能的人蛋白的功能。用表達的重組具有抑癌功能的人蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激具有抑癌功能的人蛋白功能的多肽分子。
本發明也提供了篩選藥物以鑑定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)具有抑癌功能的人蛋白的藥劑的方法。激動劑提高具有抑癌功能的人蛋白刺激細胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關的紊亂如各種癌症。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞或表達具有抑癌功能的人蛋白的膜製劑與標記的具有抑癌功能的人蛋白一起培養。然後測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
具有抑癌功能的人蛋白的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗劑可以與具有抑癌功能的人蛋白結合併消除其功能，或是抑制具有抑癌功能的人蛋白的產生，或是與多肽的活性位點結合使多肽不能發揮生物學功能。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗劑可用於治療用途。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將具有抑癌功能的蛋白加入生物分析測定中，通過測定化合物影響具有抑癌功能的蛋白和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。
本發明的多肽可直接用於疾病治療，例如，各種惡性腫瘤、和細胞異常增殖等。
本發明的多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞可以用來作為抗原以生產抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。多克隆抗體可以通過將此多肽直接注射動物的方法得到。製備單克隆抗體的技術包括雜交瘤技術，三瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術，EBV-雜交瘤技術等。
可以將本發明的多肽和拮抗劑與合適的藥物載體組合後使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩衝液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用於疾病治療。
本發明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由製造、使用或銷售藥品或生物製品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。具有抑癌功能的蛋白以有效地治療和/或預防具體的適應症的量來給藥。施用於患者的具有抑癌功能的蛋白的量和劑量範圍將取決於許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。
具有抑癌功能的人蛋白的多聚核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於具有抑癌功能的蛋白的無表達或異常/無活性的具有抑癌功能的蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的具有抑癌功能的蛋白，以抑制內源性的具有抑癌功能的蛋白活性。例如，一種變異的具有抑癌功能的蛋白可以是縮短的、缺失了信號傳導功能域的具有抑癌功能的蛋白，雖可與下遊的底物結合，但缺乏信號傳導活性。因此重組的基因治療載體可用於治療具有抑癌功能的蛋白表達或活性異常所致的疾病。來源於病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用於將具有抑癌功能的蛋白基因轉移至細胞內。構建攜帶具有抑癌功能的蛋白基因的重組病毒載體的方法可見於已有文獻(Sambrook,et al.)。另外重組具有抑癌功能的人蛋白基因可包裝到脂質體中轉移至細胞內。
抑制具有抑癌功能的人蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的範圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交後進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸醯胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下遊。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，並進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析。
本發明還提供了針對具有抑癌功能的人蛋白抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限於)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。
抗具有抑癌功能的人蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的具有抑癌功能的人蛋白。
與具有抑癌功能的人蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這种放射性標記的抗體可作為一種非創傷性診斷方法用於腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發明中的抗體可用於治療或預防與具有抑癌功能的人蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷具有抑癌功能的人蛋白的產生或活性。
抗體也可用於設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如具有抑癌功能的人蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅具有抑癌功能的人蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用具有抑癌功能的人蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
具有抑癌功能的人蛋白單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生產單鏈抗體的技術(U.S.PatNo.4946778)也可用於生產抗具有抑癌功能的人蛋白的單鏈抗體。
能與具有抑癌功能的人蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的胺基酸結合於固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對具有抑癌功能的人蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測具有抑癌功能的人蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的具有抑癌功能的人蛋白水平，可以用作解釋具有抑癌功能的人蛋白在各種疾病中的重要性和用於診斷具有抑癌功能的蛋白起作用的疾病。
具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用於具有抑癌功能的蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用於檢測具有抑癌功能的蛋白的表達與否或在疾病狀態下具有抑癌功能的蛋白的異常表達。如具有抑癌功能的蛋白DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷具有抑癌功能的蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用具有抑癌功能的蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測具有抑癌功能的蛋白的轉錄產物。
檢測具有抑癌功能的蛋白基因的突變也可用於診斷具有抑癌功能的蛋白相關的疾病。具有抑癌功能的蛋白突變的形式包括與正常野生型具有抑癌功能的蛋白DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且並可以與其雜交。目前，需要鑑定染色體上的各基因的具體位點。現在，只有很少的基於實際序列數據(重複多態性)的染色體標記物可用於標記染色體位置。根據本發明，為了將這些序列與疾病相關基因相關聯，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位於染色體上。
簡而言之，根據cDNA製備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位於染色體上。然後，將這些引物用於PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應於引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發明的的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現亞定位。可用於染色體定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行螢光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術的綜述，參見Verma等，Human Chromosomes:a Manual of BasicTechniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見於例如，V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯機獲得)。然後可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關係。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體水平可見的或用基於cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據目前的物理作圖和基因定位技術的分辨能力，被精確定位至與疾病有關的染色體區域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆鹼基作圖分辨能力和每20kb對應於一個基因)。
本發明的具有抑癌功能的蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
此外，由於本發明的具有抑癌功能的蛋白具有源自人的天然胺基酸序列，因此，與來源於其他物種的同族蛋白相比，預計在施用於人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1cDNA基因的獲得及對癌細胞克隆形成的抑制作用SP82,SP192，來自於GIBCO BRL公司購得肝cDNA文庫(cat,NO.10422-012)PP79,PP1009,PP1045,PP1195,PP1345,PP1744和PP1757是通過用常規方法構建人胎盤cDNA文庫獲得的。取3、6、10月齡的胎盤組織，用Trizol試劑(GIBCO BRL公司)按廠方說明書提取總RNA，用mRNA提純試劑盒(pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文庫構建試劑盒(Stratagene公司)構建上述mRNA的cDNA文庫。其中反轉錄酶改用MMLV-RT-SuperscriptⅡ(GIBCO BRL)，反轉錄反應在42℃進行。轉化XL 10-Gold感受細胞，獲得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文庫。第一輪隨機挑取cDNA克隆，其後以高豐度cDNA克隆和已證明有抑癌細胞生長功能的cDNA克隆為探針，雜交篩選cDNA文庫，挑取弱陽性及陰性克隆。用Qiagen96孔板質粒抽提試劑盒，按廠家說明書進行質粒DNA的提取。質粒DNA和空載體同時轉染肝癌細胞系7721。100ng DNA酒精沉澱乾燥後，加6μl H2O溶解，待轉染。每份DNA樣品中加0.74μl脂質體及9.3μl無血清培液，混勻後，室溫放置10分鐘。每管中加150μl無血清培液，均分加入3孔生長於96孔板的7721細胞中，37℃放置2小時，每孔再加50μl無血清培液，37℃24小時。每孔換100μl全培液，37℃24小時，換含G418的全培液100μl，37℃24～48小時，邊觀察，邊換G418濃度不等的培液。約2～3次後，直到鏡檢細胞有克隆形成，計數。發現上述克隆有抑制細胞克隆形成作用，結果如下表所示。
cDNA克隆轉染細胞(7721)克隆形成情況
對cDNA克隆採用雙脫氧終止法，在ABI377 DNA自動測序儀上測定其一端近500bp的核苷酸序列。分析後，確定為新基因克隆，進行另一端測序，仍未獲得全長cDNA序列，設計引物，再次進行測序，直到獲得全長序列(SEQ ID N0:1、4、7、10、13、16、19、22、25)。
實施例2從胎盤cDNA中PCR獲得全長基因取3、6、10月齡的胎盤組織，用Trizol試劑(GIBCO BRL公司)按廠方說明書提取總RNA，用mRNA提純試劑盒(pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-SuperscriptⅡ(GIBCO BRL)反轉錄酶在42℃進行反轉錄反應，獲得胎盤cDNA。利用各個基因的轉異引物(如下表所示)，按90℃3分鐘1個循環94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共35個循環；72℃10分鐘，1個循環，進行PCR擴增，獲得含有完整開放閱讀框序列的各蛋白基因的擴增產物。擴增產物經測序驗證，與實施例1測得的序列相符，隨後用常規技術將擴增產物轉入宿主細胞，以獲得重組蛋白。
基因特異引物
實施例3cDNA克隆序列分析1．SP82A核苷酸序列(SEQ ID NO:1)長度1918bp1 CCCAGAGCAA GCCGATTCTC TACACACTGC CTTCCCTTCC TGTAAGACTC51 ATCAAAAAGG CACCCCAACC TTGCATGGAT CTGCTGTTGG TATTCCTTGG101 GGTGAAGCCA GAAGTCAGGC TTTCCACAGA GAGACGGGAC TACATGGCCA151 CCTGGGAAGG CTAGGGAGTC AAAGGGCCTG AGGAATGACT ACTTCCCTCC201 ACAAGGGCAT TCCCTGCCCT GCTCTGCTTC CTGGGGGCTT CAGCAAGCCT251 TCCTTCTAGA GCTCCTAGAA CCCTCCCATG GTCAACACAA CAGCAGCCCA301 GACAATGAGA TGCAAGAGGC CTGAGCTCAC AGGCCATTCA GGTCTTCTAG351 ATGCCTTCTT GAGGCTGCTT GTGGCCACCC ACAGACACTT GTAAGGAGGA401 GAGAAGTCAG CCTGGCAGAG AGACTCTGAA ATGAGGGATT AGAGGTGTTC451 AAGGAGCAAG AGCTTCAGCC TGAAGACAAG GGAGCAGTCC CTGAAGACGC501 TTCTACTGAG AGGTCTGCCA TGGCCTCTCT TGGCCTCCAA CTTGTGGGCT551 ACATCCTAGG CCTTCTGGGG CTTTTGGGCA CACTGGTTGC CATGCTGCTC601 CCCAGCTGGA AAACAAGTTC TTATGTCGGT GCCAGCATTG TGACAGCAGT651 TGGCTTCTCC AAGGGCCTCT GGATGGAATG TGCCACACAC AGCACAGGCA701 TCACCCAGTG TGACATCTAT AGCACCCTTC TGGGCCTGCC CGCTGACATC751 CAGGCTGCCC AGGCCATGAT GGTGACATCC AGTGCAATCT CCTCCCTGGC801 CTGCATTATC TCTGTGGTGG 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GGC CTG TGG GCA GAG ACC CTG CTG GCC CTC CTG ACG GCG GCC 286287 CTG ACA CAG AGC CTC GGG CAG CCC AGG GCA AGC TGA GAG ATG GCC AGA 334335 AGG ATG CCG CCC CCA GGG CAG CTG GCA CTG TGA AGG AGC TCT GAG GAC 382383 AGG GTC CTC AGA GCT CCT GGG GGC CGC CCT GCT CCA TCC CAG GAC CTT 430431 AAC CAG CGC TCC CTG GAG CAC TCT GAG GGG CCT GTG GGC AGA GAC CCT 478479 GCT GGC CCT CCT GAC GGC GGC CCT GAC ACA GAG CCT CGG GCA GCC CAG 526527 GGC AAG CTG AGA GAT GGC CAG AAG GAT GCC GCC CCC AGG GCA GCT GGC 574575 ACT GTG AAG GAG CTC CCC AAG GGC CCG GAG CAG GTG CCC GTG CCA GAC 622623 CCC GCC AGG GAA GCC GGG GGC CCA GAG GAG CGC CTC GCA GAG GAA TTC 670671 CCT GGG CAA AGT CAG GAC GTT ACT GGC GGT TCC CAA GAC AGG AAA AAA 718719 CCT GGG AAG GAG GTG GCA GCC ACT GGC ACC AGC ATT CTG AAG GAA GCC 766767 AAC TGG CTC GTG GCA GGG CCA GGA GCA GAG ACG GGG GAC CCT CGC ATG 8141 Met 1815 AAG CCC AAG CAA GTG AGC CGA GAC CTG GGC CTT GCA GCG GAC CTG CCC 8622 Lys Pro Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Gly Leu Ala Ala Asp Leu Pro 17863 GGT GGG GCG GAA GGA GCA GCT GCA CAG CCC CAG GCT GTG TTA CGC CAG 91018 Gly Gly Ala Glu Gly Ala Ala Ala Gln Pro Gln Ala Val Leu Arg Gln 33911 CCG GAA CTG CGG GTC ATC TCT GAT GGC GAG CAG GGT GGA CAG CAG GGC 95834 Pro Glu Leu Arg Val Ile Ser Asp Gly Glu Gln Gly Gly Gln Gln Gly 49959 CAC CGG CTG GAC CAT GGC GGT CAC CTG GAG ATG AGA AAG GCC CGC GGG100650 His Arg Leu Asp His Gly Gly His Leu Glu Met Arg Lys Ala Arg Gly 651007 GGG GAC CAT GTG CCT GTG TCC CAC GAG CAG CCG AGA GGC GGG GAG GAC105466 Gly Asp His Val Pro Val Ser His Glu Gln Pro Arg Gly Gly Glu Asp 811055 GCT GCT GTC CAG GAG CCC AGG CAG AGG CCA GAG CCA GAG CTG GGG CTC110282 Ala Ala Val Gln Glu Pro Arg Gln Arg Pro Glu Pro Glu Leu Gly Leu 971103 AAA CGA GCT GTC CCG GGG GGC CAG AGG CCG GAC AAT GCC AAG CCC AAC115098 Lys Arg Ala Val Pro Gly Gly Gln Arg Pro Asp Asn Ala Lys Pro Asn 1131151 CGG GAC CTG AAA CTG CAG GCT GGC TCC GAC CTC CGG AGG CGA CGG CGG1198114 Arg Asp Leu Lys Leu Gln Ala Gly Ser Asp Leu Arg Arg Arg Arg Arg 1291199 GAC CTT GGC CCT CAT GCA GAG GGT CAG CTG GCC CCG AGG GAT GGG GTC1246130 Asp Leu Gly Pro His Ala Glu Gly Gln Leu Ala Pro Arg Asp Gly Val 1451247 ATT GGC CTT AAC CCC CTG CCT GAT GTC CAG GTG AAC GAC CTC CGT GGC1294146 Ile Gly Leu Asn Pro Leu Pro Asp Val Gln Val Asn Asp Leu Arg Gly 1611295 GCC CTG GAT GCC CAG CTC CGC CAG GCT GCG GGG GGA GCT CTG CAG GTG1342162 Ala Leu Asp Ala Gln Leu Arg Gln Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gln Val 1771343 GTC CAC AGC CGG CAG CTT AGA CAG GCG CCT GGG CCT CCA GAG GAG TCC1390178 Val His Ser Arg Gln Leu Arg Gln Ala Pro Gly Pro Pro Glu Glu Ser 1931391 TAG CAC CTG CTG GCC ATG AGG GCC ACG CCA GCC ACT GCC CTC CTC GGC1438194 *** 1941439 CAG CAG CAG GTC TGT CTC AGC CGC ATC CCA GCC AAA CTC TGG AGG TCA14861487 CAC TCG CCT CTC CCC AGG GTT TCA TGT CTG AGG CCC TCA CCA AGT GTG15341535 AGT GAC AGT ATA AAA GAT TCA CTG TGG CAT CGT TTC CAG AAT GTT CTT15821583 GCT GTC GTT CTG TTG CAG CTC TTA GTC TGA GGT CCT CTG ACC TCT AGA16301631 CTC TGA GCT CAC TCC AGC CTG TGA GGA GAA ACG GCC TCC GCT GCG AGC16781679 TGG CTG GTG CAC TCC CAG GCT CAG GCT GGG GAG CTG CTG CGT CTG TGG17261727 TCA GGC CTC CTG CTC CTG CCA GGG AGC AGG CGT GGT CTT CGG GTT GAG17741775 CTC GCC CGT GCG TGG AGG TGC GCA TGG CTG CTC ATG GTC CCA ACA CAG18221823 GCT ACT GTG AGA GCC AGC ATC CAA CCC CAC GCT TGC AGT GAC TCA GAA18701871 TGA TAA TTA TTA TGA CTG TTT ATC GAT GCT TCC CCC AGT GTG GTA GAA19181919 AGT CTT GAA TAA ACA CTT TTG CCT TCA CCC AAA AAA AAA AAA AAA AAA19661967 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 19969．PP1757A核苷酸序列(SEQ ID NO:25)長度2279bp1 GCATTCTAGT GCGACCTTGT TTACACCTCC CCTGGCTCAG TCACACAGCT51 GTGTGGTAGG CTACTAGAAG TGTTTAGTAG TTGTCACTGG GATCATGCTG101 ATGTGGCCCC ATCCCCGCCT CTCCCTGCCC TGTGATATCG GAGGAAACCT151 GACAGAGCAA ATTGGCCATG GCCAAGAAAA AGGAAAAGAA AGAGTGCCAC201 CAAAAGCAGG GAGCCCTAAG GGAGCAGTTA CAGGTCCTCT TTGGATTCCA251 GCACGACGCA TCAAACCATA CCATGACGTG ACTAGGACCC AACCTAGAAA301 TGAAGGAACT GACCCTACAG GACTCACAAC CCTGGATAAT GCAGTGTCCT351 CGGACGGCAA CAAGCTCTGG ACATTACCTG GGGGATGCTG AAGGCGGCAA401 CTGAGGAGGC TGAATGAATC CTGCTCCAGA CACAGACACC ATTCACTCCA451 GATAATTTGT TGCTTGCTAT GCTCTCTGTT GTACATTGCA ACTCGCATAG501 GGATGCAAAG CCGGAATAAG AGCAATGACC ACCATGCCTG ACAGACCTGT551 TGCTGCGCAC ACCTGTACTC TCCAATGAAC AAGACTGAAT GCAAAAAAAA601 CAGAAAATGG GGAGATTTAG GGGATCAGTC AGTGTGGTTG GAAAATTGTA651 AGATGAAGTT ACAGGATATA GACACAAACC TTCTTGGAAG GCCAGAAGGT701 TTGCATAGCT TCAGTAAAGG ATTTGGCTGA AATCCTTTTT ACCTCTAATC751 CCCTTTACCT TGAGTTGATA GCAATAGAGC AAATAACATG GGAATGTGGG801 GGAGTTTATC TGAATAGCTT GTTTACTCAT GTGGTCCTAA GACCAACCTT851 TGATTATCCG CAGGTGCATG ATTGCTCTCT ACCTGGGGGC AGGGGGAGTT901 AATTACCCAC AGGTGGAGCT GAAGAGCCAG GAGGCTCAGA GTCTGCAGCA951 GCAGCAGGAC CAGTACCTGG GTCATCTGCA GCAGTATGTG GCCACCTATC1001 AGCAGCAGGT GGTCACCTAT CAGCAGCTGA CCTCTGAGGA GGAGGAGCTG1051 CACAACCAGT TACTGCTGCA GACCCAGCTC GTGGACCGGC TGCAGCAGCA1101 GAAAGCTCAA AGCAAAGCTG TGGCCAAGAT GGGCTGCCAA GAGTTGCGGG1151 AGACCCAGGA GCACCTGGAA GCTATCAGCC AGCAGAACCA GCAGCCTCAG1201 GCCCAGTTGA GCCTCATGGC TCTCCCTGGG GAAGGAGATG GACAGTGAGG1251 AGGAGGAGGA GGTGCCTCAG CCCATGCCAA GCATCCCGGA GGATCTAGAG1301 AGCCAGAAGG CCATGGTGGC ATTTTTCAAC TCAGCTGTAG CTAGTGCCGA1351 GGAGGAGCAG GCACGGCTAT GTGGGCAGCT GAAGGAGTGC ACTGCCAGCG1401 CCTGGCTCAT CTGTTGGCCT CGGCCCAGAA GGAACCTGAG GCAGCAGCCC1451 CAGCCCCAAG AACTGGGGGT GATCCCATGT GTGGGGAGAC CCACCAGGCC1501 CTGCAGGGGG CCATGGAGAA GCTGTGGGAG AGTACATCGC ACTGTACCAG1551 AGCCAGAGGG CAGTGCGGAA GGAGGAGGAG TGCATCAGCA GGCTGGCCCA1601 GGACAAGGGA GAGGTGAAGG TGAAGCTGCT GGAGCTGGCG TGGCTTGTGG1651 ACGACTGCAA CAAGTGGCAT AGCAGATTCC TGGCAGCTGC CCAGAACCCT1701 GCTGATGAGC CCACTCCAGG GGCCCCCGCC CCCCAGTAGC TTGGGGCTAC1751 TGACAAGCCA GGGTAGTGAG TAGAGTCCTC AGGCACAGTG GGCACGCAGG1801 AGCAGGGGAG GGCTCCCACA GCACCCTGCC TCCCTCTCTC CAAAGATCTT1851 TGTGAGGTGA GCCTTGCCAG CAGTGGGGAG TCTGCACAAG GAGAGGCGGG1901 GAAGCATTCT CCCTGTGACA ACCCCACTGA GCAGCAGATC ATGCAACTGC1951 TTCATGAGAT GCAGAACCTC CAGGAGCACC CAGGCTTGGG CAGCAGCCCT2001 TGCATTCCTT TTTTGTACCA GACTGATGAG AACAATGAGG TGAAGATCAC2051 CATCATCTAA AAGCCGGCCA CTGTCAGCAA AACCTGGGGA AGTGGGGCTG2101 GAGGCTCTGC CCCTACCATG TCCCTACCAC CCCTTCCCAG TCAACCCTTT2151 ACCCTCACAG TAGCAAGCAT AAGACCCCTG TCTAATGTGG GGAGACAGGT2201 GGAGATGAGG TGAAGATCAC CATAATCTAA AAGGCCACTA AATAAAAAAA2251 TAAAAAATTT TAAAAAAAAA AAAAAAAAAB胺基酸序列(SEQ ID NO:26)長度144個胺基酸1 MDSEEEEEVP QPMPSIPEDL ESQKAMVAFF NSAVASAEEE QARLCGQLKE51 CTASAWLICW PRPRRNLRQQ PQPQELGVIP CVGRPTRPCR GPWRSCGRVH101 RTVPEPEGSA EGGGVHQQAG PGQGRGEGEA AGAGVACGRL QQVAC核苷酸及胺基酸組合序列(SEQ ID NO:27)克隆號和蛋白名稱PP1757起始編碼子1238 ATG終止編碼子1672 TAG蛋白質分子量15481.601G CAT TCT AGT GCG ACC TTG TTT ACA CCT CCC CTG GCT CAG TCA CAC 4647 AGC TGT GTG GTA GGC TAC TAG AAG TGT TTA GTA GTT GTC ACT GGG ATC 9495 ATG CTG ATG TGG CCC CAT CCC CGC CTC TCC CTG CCC TGT GAT ATC GGA 142143 GGA AAC CTG ACA GAG CAA ATT GGC CAT GGC CAA GAA AAA GGA AAA GAA 190191 AGA GTG CCA CCA AAA GCA GGG AGC CCT AAG GGA GCA GTT ACA GGT CCT 238239 CTT TGG ATT CCA GCA CGA CGC ATC AAA CCA TAC CAT GAC GTG ACT AGG 286287 ACC CAA CCT AGA AAT GAA GGA ACT GAC CCT ACA GGA CTC ACA ACC CTG 334335 GAT AAT GCA GTG TCC TCG GAC GGC AAC AAG CTC TGG ACA TTA CCT GGG 382383 GGA TGC TGA AGG CGG CAA CTG AGG AGG CTG AAT GAA TCC TGC TCC AGA 430431 CAC AGA CAC CAT TCA CTC CAG ATA ATT TGT TGC TTG CTA TGC TCT CTG 478479 TTG TAC ATT GCA ACT CGC ATA GGG ATG CAA AGC CGG AAT AAG AGC AAT 526527 GAC CAC CAT GCC TGA CAG ACC TGT TGC TGC GCA CAC CTG TAC TCT CCA 574575 ATG AAC AAG ACT GAA TGC AAA AAA AAC AGA AAA TGG GGA GAT TTA GGG 622623 GAT CAG TCA GTG TGG TTG GAA AAT TGT AAG ATG AAG TTA CAG GAT ATA 67G671 GAC ACA AAC CTT CTT GGA AGG CCA GAA GGT TTG CAT AGC TTC AGT AAA 718719 GGA TTT GGC TGA AAT CCT TTT TAC CTC TAA TCC CCT TTA CCT TGA GTT 766767 GAT AGC AAT AGA GCA AAT AAC ATG GGA ATG TGG GGG AGT TTA TCT GAA 814815 TAG CTT GTT TAC TCA TGT GGT CCT AAG ACC AAC CTT TGA TTA TCC GCA 862863 GGT GCA TGA TTG CTC TCT ACC TGG GGG CAG GGG GAG TTA ATT ACC CAC 910911 AGG TGG AGC TGA AGA GCC AGG AGG CTC AGA GTC TGC AGC AGC AGC AGG 958959 ACC AGT ACC TGG GTC ATC TGC AGC AGT ATG TGG CCA CCT ATC AGC AGC10061007 AGG TGG TCA CCT ATC AGC AGC TGA CCT CTG AGG AGG AGG AGC TGC ACA10541055 ACC AGT TAC TGC TGC AGA CCC AGC TCG TGG ACC GGC TGC AGC AGC AGA11021103 AAG CTC AAA GCA AAG CTG TGG CCA AGA TGG GCT GCC AAG AGT TGC GGG11501151 AGA CCC AGG AGC ACC TGG AAG CTA TCA GCC AGC AGA ACC AGC AGC CTC11981199 AGG CCC AGT TGA GCC TCA TGG CTC TCC CTG GGG AAG GAG ATG GAC AGT12461 Met Asp Ser 31247 GAG GAG GAG GAG GAG GTG CCT CAG CCC ATG CCA AGC ATC CCG GAG GAT12944 Glu Glu Glu Glu Glu Val Pro Gln Pro Met Pro Ser Ile Pro Glu Asp 191295 CTA GAG AGC CAG AAG GCC ATG GTG GCA TTT TTC AAC TCA GCT GTA GCT134220 Leu Glu Ser Gln Lys Ala Met Val Ala Phe Phe Asn Ser Ala Val Ala 351343 AGT GCC GAG GAG GAG CAG GCA CGG CTA TGT GGG CAG CTG AAG GAG TGC139036 Ser Ala Glu Glu Glu Gln Ala Arg Leu Cys Gly Gln Leu Lys Glu Cys 511391 ACT GCC AGC GCC TGG CTC ATC TGT TGG CCT CGG CCC AGA AGG AAC CTG143852 Thr Ala Ser Ala Trp Leu Ile Cys Trp Pro Arg Pro Arg Arg Asn Leu 671439 AGG CAG CAG CCC CAG CCC CAA GAA CTG GGG GTG ATC CCA TGT GTG GGG148668 Arg Gln Gln Pro Gln Pro Gln Glu Leu Gly Val Ile Pro Cys Val Gly 831487 AGA CCC ACC AGG CCC TGC AGG GGG CCA TGG AGA AGC TGT GGG AGA GTA153484 Arg Pro Thr Arg Pro Cys Arg Gly Pro Trp Arg Ser Cys Gly Arg Val 991535 CAT CGC ACT GTA CCA GAG CCA GAG GGC AGT GCG GAA GGA GGA GGA GTG1582100 His Arg Thr Val Pro Glu Pro Glu Gly Ser Ala Glu Gly Gly Gly Val 1151583 CAT CAG CAG GCT GGC CCA GGA CAA GGG AGA GGT GAA GGT GAA GCT GCT 1630116 His Gln Gln Ala Gly Pro Gly Gln Gly Arg Gly G1u Gly Glu Ala Ala1311631 GGA GCT GGC GTG GCT TGT GGA CGA CTG CAA CAA GTG GCA TAG CAG ATT1678132 Gly Ala Gly Val Ala Cys Gly Arg Leu Gln Gln Val Ala *** 1451679 CCT GGC AGC TGC CCA GAA CCC TGC TGA TGA GCC CAC TCC AGG GGC CCC17261727 CGC CCC CCA GTA GCT TGG GGC TAC TGA CAA GCC AGG GTA GTG AGT AGA17741775 GTC CTC AGG CAC AGT GGG CAC GCA GGA GCA GGG GAG GGC TCC CAC AGC18221823ACC CTG CCT CCC TCT CTC CAA AGA TCT TTG TGA GGT GAG CCT TGC CAG 18701871CAG TGG GGA GTC TGC ACA AGG AGA GGC GGG GAA GCA TTC TCC CTG TGA 19181919CAA CCC CAC TGA GCA GCA GAT CAT GCA ACT GCT TCA TGA GAT GCA GAA 19661967CCT CCA GGA GCA CCC AGG CTT GGG CAG CAG CCC TTG CAT TCC TTT TTT 20142015GTA CCA GAC TGA TGA GAA CAA TGA GGT GAA GAT CAC CAT CAT CTA AAA 20622063GCC GGC CAC TGT CAG CAA AAC CTG GGG AAG TGG GGC TGG AGG CTC TGC 21102111CCC TAC CAT GTC CCT ACC ACC CCT TCC CAG TCA ACC CTT TAC CCT CAC 21582159AGT AGC AAG CAT AAG ACC CCT GTC TAA TGT GGG GAG ACA GGT GGA GAT 22062207GAS GTG AAG ATC ACC ATA ATC TAA AAG GCC ACT AAA TAA AAA AAT AAA 22542255AAA TTT TAA AAA AAA AAA AAA AAA A 2279
權利要求
1．一種分離的具有抑癌功能的人蛋白，其特徵在於，它包含具有選自下組的胺基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26；或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2．如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有選自下組的胺基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26。
3．一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4．如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26。
5．如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27的編碼區序列或全長序列。
6．一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7．一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它是選自下組的一種宿主細胞(a)用權利要求6所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求3所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
8．一種具有具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達具有抑癌功能的人蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽。
9．一種能與權利要求1所述的具有抑癌功能的人蛋白特異性結合的抗體。
10．一種核酸分子，它含有權利要求3所述的多核苷酸中連續的10-800個核苷酸。
11.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了一類新的具有抑癌功能的人蛋白,編碼此多肽的多核苷酸和經重組技術產生該多肽的方法。本發明還公開了此多肽用於治療多種疾病如癌症等的方法。本發明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發明還公開了編碼這類新的具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N15/12GK1313315SQ00111989
公開日2001年9月19日 申請日期2000年3月13日 優先權日2000年3月13日
發明者顧健人, 楊勝利 申請人:上海市腫瘤研究所