一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法
2023-07-27 15:45:51 2
一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法
【專利摘要】本發明涉及一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法。此層析介質由烏司他丁親和配體和普通層析介質連接而成。其親和配體為聚賴氨酸3000，普通層析介質是sephadex，親和配體和層析介質通過親水間隔臂進行連接。然後利用上述的親和層析介質對烏司他丁進行純化生產。通過調整各種溶液的濃度、pH值，洗滌、洗脫的流速等工藝，從原料中快速分離純化分子量為37-43kDa的烏司他丁。整個過程只需要經過一步親和層析，純化得到的烏司他丁純品，其收率大於80%，比活大於5000IU/mg.pr。整個純化步驟消耗時間短，活性回收率及比活較高，適於大規模推廣應用。
【專利說明】一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種製備烏司他丁的方法，具體涉及一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法。
【背景技術】
[0002]烏司他丁是一種Kunitz型的廣譜蛋白酶抑制劑，能夠有效的抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、乳糖酶、脂肪酶、透明質酸酶和其他胰腺酶的活性。此外，其具有穩定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子(MDF)產生，清除氧自由基及抑制炎症介質釋放的作用。烏司他丁還可改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術刺激引起的對內臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環狀態等。[0003]其在臨床醫療中有廣泛的應用，適用症包括急性胰腺炎(包括外傷性、術後及內窺鏡逆行性胰膽管造影術後的急性胰腺炎)、慢性復發性胰腺炎的急性惡化期，急性循環衰竭(出血性休克、細菌性休克、外傷性休克、燒傷性休克)；也廣泛用於胸外科手術、消化系統手術、腫瘤手術、器官移植、器官切除手術及CPB手術；還用於治療與預防腫瘤化療產生的腎功能障礙。
[0004]目前，日本的Mochida Pharmaceutical (Tokyo, Japan)公司有較成熟的產品，分子量為67 kDa，國內按中國藥典2013版規定，分子量要求為37~43kDa。然而烏司他丁的分離純化步驟通常包括了多步的硫酸銨沉澱，表面活化劑處理，熱處理，離子交換層析，分子篩層析等。而過多的純化步驟，導致了純化時間較長，蛋白和活性回收率較低的結果。
[0005]為了大規模生產烏司他丁，必須減少分離純化的步驟。因此，需要提供快速高效的烏司他丁分離方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種可克服上述現有技術中的缺點的烏司他丁製備方法，該方法利用了烏司他丁親和層析介質，使純化烏司他丁可以大規模的快速製備。
[0007]本發明的技術方案為:
第一方面，一種烏司他丁親和層析介質的合成方法，其合成方法如下:
(1)活化:取親和層析介質sephadex,先用10_12倍純水洗漆,過濾抽乾。再加入活化緩衝液A，在40-45°C下攪拌2.5-3.5h，然後過濾，再用純化水洗滌後過濾抽乾；
(2)親水間隔臂的連接:活化後的親和層析介質sephadex加含5%_10%的1,3-二氨基-2-羥基丙烷的水溶液，而後在加熱至60-70°C後攪拌，再用純化水洗滌後過濾抽乾；
(3)疏水間隔臂的連接:加三聚氯嗪的水-丙酮溶液，通過氫氧化鈉調pH值至
7.5-8.5，冷卻至4-8 °C攪拌，再用純化水洗滌，過濾抽乾；
(4)連接上親和配體:加聚賴氨酸水溶液,攪拌,調pH值至9-10，用純化水洗滌，過濾抽乾即可；
所述親和層析介質sephadex為sephadex G75。[0008]所述親和配體聚賴氨酸的分子大小為聚賴氨酸3000。
所述緩衝液A為0.5 M NaOH, 10% 二甲亞碸，6%環氧氯丙烷。
[0009]第二方面，製備純化的烏司他丁，其製備方法如下:
(I)取烏司他丁親和層析介質，裝柱，用PH值為7.0-8.0的磷酸鹽緩衝液衝洗平衡親和層析介質。
[0010](2)將含有烏司他丁粗品，加入2-3倍的水溶液進行解析，然後過濾、將溶液濃縮至3.5-4.5L，取濃縮液；
(3)將上述(2)的濃縮液通過烏司他丁親和介質進行吸附，然後採用pH值為7.0-8.0洗脫緩衝液B衝洗親和介質，用以洗滌雜質；
(4)最後用PH值為7.5-9.5的洗脫緩衝液C洗脫親和介質上吸附的烏司他丁，收集純化後的烏司他丁溶液，濃縮、冷凍乾燥即得。
[0011]所述緩衝液B為磷酸鹽溶液。
[0012]所述緩衝液C為甘氨酸溶液。
[0013]本發明通過烏司他丁親和層析介質生產純品烏司他丁，可以大規模快速分離分子量為37-43的純化烏司他丁，可在僅用一步親和層析的情況下，得到烏司他丁純品，整個純化步驟消耗時間短，活性回收率可大於80%，同時比活比活大於5000 IU/mg.pr，符合中國藥典要求，適於大規模推 廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
圖1為聚賴氨酸3000的分子結構圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例1:1烏司他丁親和層析介質合成:
(I)取sephadex G75 2000 g,用10倍體積的純化水洗漆,過濾,然後抽乾成溼餅狀；加2000 ml活化緩衝液(0.5 M NaOH, 10% 二甲亞碸，6%環氧氯丙烷)，40 °C攪拌2.5 h，然後倒入漏鬥中，用10倍體積純化水洗滌，過濾，然後抽乾成溼餅狀。
[0015](2)活化的sephadex G75介質加2000 ml含5% I, 3_ 二氨基_2_羥基丙烷的水溶液，60 °C攪拌20 h，用10倍體積純化水清洗，抽乾成溼餅狀。
[0016](3)加2000 ml 0.1M/L三聚氯嗪的水-丙酮溶液，用0.1M氫氧化鈉調體系PH為
7.5，4°C冰浴攪拌lh，用10倍體積純化水清洗，抽乾成溼餅狀。
[0017](4)加 2000 ml 0.15mol 聚賴氨酸 3000 水溶液，40 °C攪拌 12 h，PH 維持 9-10,用純化水清洗，抽乾成餅狀即可。
[0018]2烏司他丁親和層析介質純化烏司他丁:
(I)取烏司他丁親和層析介質2000ml，裝柱，用IOL 0.02M PH值為7.0的磷酸鹽緩衝液衝洗平衡親和層析介質。
[0019](2)取115.2百萬單位烏司他丁粗品，經2倍水溶液溶解，然後過濾、將溶液濃縮至
3.5L，取濃縮液；(何種溶液溶解、怎樣的過濾方式、用哪些設備、是否有溫度控制要求)
(3)將上述(2)的濃縮液過上述(I)經過平衡的烏司他丁親和層析介質吸附，然後用IOL 0.02M PH7.0磷酸鹽洗脫緩衝液洗滌乾淨。(是否有溫度等要求)
(4)再用0.05MGLY-Na0H甘氨酸溶液(PH9.0)洗脫，收集洗脫流出蛋白高峰段，檢測效價為97.7百萬單位，收率為84.8%，比活為5321.8 IU/mg.pr，分子量為40，符合中國藥典要求。
[0020]實施例2:
I烏司他丁親和層析介質合成:
(I)取sephadex G75 3000 g,用12倍體積的純化水洗漆,過濾,然後抽乾成溼餅狀；加3000 ml活化緩衝液(0.5 M NaOH, 10% 二甲亞碸，6%環氧氯丙烷)，45 °C攪拌3.5 h，然後倒入漏鬥中，用12倍體積純化水洗滌，過濾，然後抽乾成溼餅狀。
[0021](2)活化的s印hadex G75介質加2000 ml含10% 1,3- 二氨基_2_羥基丙烷的水溶液，70 °C攪拌20 h，用12倍體積純化水清洗，抽乾成溼餅狀。
[0022](3)加3000 ml 0.1M/L三聚氯嗪的水-丙酮溶液，用0.1M氫氧化鈉調體系PH為
8.5，8°C冰浴攪拌lh，用12倍體積純化水清洗，抽乾成溼餅狀。
[0023](4)加 3000 ml 0.15mol 聚賴氨酸 3000 水溶液，40 °C攪拌 12 h，PH 維持 9-10,用純化水清洗，抽乾成餅狀即可。
[0024]2烏司他丁親和層析介質純化烏司他丁:
(I)取烏司他丁親和層析介質3000ml，裝柱，用IOL 0.02M PH值為8.0的磷酸鹽緩衝液衝洗平衡親和層析介質。
[0025](2)取115.2百萬單位烏司他丁粗品，經3倍水溶液溶解，然後過濾、將溶液濃縮至
4.5L，取濃縮液；(何種溶液溶解、怎樣的過濾方式、用哪些設備、是否有溫度控制要求)
(3)將上述(2)的濃縮液過上述(I)經過平衡的烏司他丁親和層析介質吸附，然後用15L 0.02M PH8.0磷酸鹽洗脫緩衝液洗滌乾淨。(是否有溫度等要求)
(4)再用0.05MGLY-Na0H甘氨酸溶液(PH9.5)洗脫，收集洗脫流出蛋白高峰段，檢測效價為96.2單位，收率為82.8%，比活為5215.8 IU/mg.pr，分子量為42，符合中國藥典要求。
【權利要求】
1.一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法，其特徵在於:所述製備方法包括以下步驟: 第一方面，一種烏司他丁親和層析介質的合成方法，其合成方法如下: (O活化:取親和層析介質sephadex,先用10_12倍純水洗漆,過濾抽乾； 再加入活化緩衝液A，在40-45°C下攪拌2.5-3.5h，然後過濾，再用純化水洗滌後過濾抽乾； (2)親水間隔臂的連接:活化後的親和層析介質sephadex加含5%_10%的1,3-二氨基-2-羥基丙烷的水溶液，而後在加熱至60-70°C後攪拌，再用純化水洗滌後過濾抽乾； (3)疏水間隔臂的連接:加三聚氯嗪的水-丙酮溶液，通過氫氧化鈉調pH值至7.5-8.5，冷卻至4-8 °C攪拌，再用純化水洗滌，過濾抽乾； (4)連接上親和配體:加聚賴氨酸水溶液,攪拌,調pH值至9-10，用純化水洗滌，過濾抽乾即可； 第二方面，製備純化的烏司他丁，其製備方法如下: (1)取烏司他丁親和層析介質，裝柱，用PH值為7.0-8.0的磷酸鹽緩衝液衝洗平衡親和層析介質； (2)將含有烏司他丁粗品，加入2-3倍的水溶液進行解析，然後過濾、將溶液濃縮至 3.5-4.5L，取濃縮液; (3)將上述(2)的濃縮液通過烏司他丁親和介質進行吸附，然後採用pH值為7.0-8.0洗脫緩衝液B衝洗親和介質，用以洗滌雜質； (4)最後用PH值為7.5-9.5的洗脫緩衝液C洗脫親和介質上吸附的烏司他丁，收集純化後的烏司他丁溶液，濃縮、冷凍乾燥即得。
2.根據權利要求1所述的一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法，其特徵在於:所述親和層析介質sephadex為sephadex G75。
3.根據權利要求1所述的一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法，其特徵在於:所述親和配體聚賴氨酸的分子大小為聚賴氨酸3000。
4.根據權利要求1所述的一種通過烏司他丁親和層析介質製備純品烏司他丁的方法，其特徵在於:所述緩衝液A為0.5 M NaOH, 10% 二甲亞碸，6%環氧氯丙烷，所述緩衝液B為磷酸鹽溶液，所述緩衝液C為甘氨酸溶液。
【文檔編號】C07K1/22GK103880951SQ201410123449
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月31日 優先權日:2014年3月31日
【發明者】陳備戰, 辛瑜, 熊蔚, 劉蘭花 申請人:南昌市萬華生化製品有限公司