C型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙的製作方法
2023-07-28 00:28:21 1
專利名稱：C型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙的製作方法
技術領域：
本實用新型是涉及生物應用技術領域，特別是涉及一種以膠體金免疫 層析法快速檢測C型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙。
背景技術：
HCV是1989年由美國Choo等從受感染的黑猩猩血液標本中最初發現， 主要由血液、體液傳播，佔輸血後肝炎的70%。據世界衛生組織統計，全球 估計約1. 7億人感染HCV。C型肝炎慢性化率為50%—85%，其中又有20% 可發展為肝纖維化，危害十分嚴重。我國HCV抗體攜帶者達4千萬左右。 到目前為止C型肝炎既無有效疫苗，亦無有效的治療方法，預防感染是唯 一有效的方法。HCV抗體檢査和B肝表面抗原(HBsAg)、人類免疫缺陷病毒 (HIV)抗體及梅毒(TP)抗體檢查是我國法定的四個血源性篩查項目，意義十 分重要。
目前HCV抗體檢測試劑主要檢測HCV IgG。 IgM檢測只有為數不多的研 究報導，集中於用酶聯免疫吸附分析法(ELISA)進行檢測。對IgG檢測不能 說明患者是現症感染或既往感染，雖然IgM的檢出率為IgG的50%—80%， 但IgM檢測陽性基本說明患者是現症感染。除此之外，IgM抗體和體內病毒 複製即HCV RNA檢出率相關；和體內體內肝炎發展程度、肝細胞壞死相關； 在對HCV病人治療過程中，IgM的變化亦提示治療效果的好壞；另外IgM的 出現和HCV的不同亞型感染相關，因而對HCV IgM檢測具有積極的參考意 義。
運用免疫層析膠體金技術檢測HCV IgM尚無報導。免疫層析膠體金技 術是新型的診斷技術，已得到較為廣泛運用，基本原理如下利用膠體金 標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應的配對抗原或抗體，檢測 時當樣品中含相應的特異性抗體或抗原時，膠體金標記顆粒和樣品中配體 相結合形成複合物，然後在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成 肉眼可見的檢測(T)線，通過檢測線的有無實現對結果的判定。具有操作簡 便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。
發明內容
本實用新型的目的是提供一種HCVIgM抗體快速檢測試紙，具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等 優點。
本實用新型提供一種HCV IgM抗體快速檢測試紙。包括上樣墊(l)、緊 密連接於上樣墊一端的含有標記HCV混合抗原的膠體金墊(2)、與膠體金墊 的另一端緊密連接的硝酸纖維素(NC)膜(3)和緊密連接於NC膜另一端的吸 樣墊(4)， NC膜包被有相互分離的檢測(T)線(5)和質控(C)線(6)，上樣墊、 膠體金墊、NC膜和吸樣墊粘貼到塑料支撐板(7)上形成試紙條，試紙條亦可 以裝入塑料卡中形成卡式包裝，其特徵在於T線為包被在NC膜上的抗人IgM 抗體，膠體金墊為標記的HCV混合抗原構成。
所述的HCV IgM抗體快速檢測試紙，其特徵在於所述的HCV混合抗原 為重組表達HCV的核心抗原(Core)和非結構蛋白(NS)3抗原，亦可選擇性再 加入HCV的NS4、 NS5、 E1和E2區抗原。
所述的HCV IgM抗體快速檢測試紙，其特徵在於所述的上樣墊為玻璃 纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成。
所述的HCV IgM抗體快速檢測試紙，其特徵在於，所述的抗原的包被 方法為以0. 01M pH 7. 2磷酸鹽緩衝液(PBS)將抗人IgM抗體配製成lmg/ml 的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數進行劃線，包被T線，同 時在NC膜上部包被抗HCV抗體作為C線。劃線後將NC膜在乾燥間(溫度 20-25。C，溼度小於30%)乾燥8-IO小時。
所述的HCV IgM抗體快速檢測試紙，其特徵在於，所述的混合抗原標 記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法製備直徑為30 — 50nm 的膠體金溶液，製備完成後取100ml膠體金液放在燒杯內，用0.2M K2C03 調至pH8. 0，按100ml膠體金溶液加入lmg HCV重組混合抗原，室溫攪拌2 小時，加入1%牛血清白蛋白(BSA) ， 0. 1%聚乙二醇(PEG)20000封閉20min， 12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復溶至100ml，按lml溶 液鋪22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置乾燥間(溫度 20-25。C，溼度小於30%)乾燥2-4小時，製成膠體金墊。
所述的HCV IgM抗體快速檢測試紙，其特徵在於所述的試紙的裝配方 法為在乾燥室內(溫度20-25。C，溼度小於30%)，取塑料支撐板板，將 已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接膠體 金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體金墊另一側搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10); 最後用裁剪機將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可 以再裝入塑料卡內，形成檢測卡。
所述的HCV IgM抗體快速檢測試紙，其特徵在於，檢測方法為將被 檢血清或血漿平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入50 — 100ul被檢樣品，樣品溶解膠體金並在NC膜上層析，然後用肉眼直接觀察 在30分鐘內C、 T線的出現情況，並判定檢測結果
本實用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術檢測HCV IgM的新型試紙。採用膠體金標記HCV抗原，包被抗人IgM實現對樣品中 HCVIgM的檢測。具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現 場檢測和經濟實用等優點。
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圖l HCV抗體快速檢測試紙結構示意圖。 附圖符號說明
1:上樣墊 2:膠體金墊
3: NC膜 4:吸樣墊
5:檢測(T)線 6:質控(C)線
7:塑料支撐板具體實施方式
實施例製備HCV IgM抗體快速檢測試紙
1主要材料
1.1 HCV的CORE、 NS3融合抗原:美國Biotech Atlantic Inc(BAI.)產品, 用於膠體金標記；鼠抗人IgM，抗HCV抗體軍事醫學科學院產品，用於 NC膜包被；氯金酸Sigma公司產品；硝酸纖維素(NC)膜Millipore公 司產品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇(PEG)20000，水解酪蛋白Sigma 產品。其它常用試劑均為分析純試劑。
1.2臨床血清由公司在相關醫院或血站獲得，HCV IgG抗體陽性血清80 份，HCV抗體陰性血清300份。
1.3 HCV IgM抗體檢測ELISA試劑盒，美國Abbott產品。 2方法
2.1 HCV重組抗原的膠體金標記氯金酸一檸檬酸三鈉還原法製備直徑
為40nm的膠體金溶液，製備完成後取三份膠體金，分別用0.2M 1(20)3將溶 液調到pH7.0、 pH8.0和pH9.0。然後將溶液置於磁力攪拌器上緩慢攪拌， 按每100ml溶液加入0. 5mg、 lmg、 1. 5mg將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠 體金溶液中，繼續攪拌2小時，再滴加入到終濃度為0. 1%的PEG2000和1% 的BSA進行封閉20min，標記結束後以12000 r/m離心，棄上清，沉澱按原 體積復溶至不同配比的膠體金工作液(硼酸鹽緩衝液，pH8.0，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性劑)中。然後將標記膠體金溶液按lml溶液鋪22cm'2的 比例加樣於無紡布上，在溫度20-25°C，相對溼度在<30%的乾燥間乾燥2-4 小時，製成膠體金墊。
2. 2 鼠抗人IgM的包被用0. 01M pH7. 2 PBS將鼠抗人IgM分別稀釋成 0. 5mg/ml、 lmg/ml、 2mg/ml，然後用噴膜儀在NC膜下部按lul/cm進行劃 線包被，同時在NC膜上部包被抗HCV抗體，用於產品的質控，包被完成後 將NC膜在在溫度20_25°C ，相對溼度在<30%的乾燥間乾燥8-10小時。 2.3 HCV IgM抗體快速檢測試紙的組裝在乾燥室內(溫度20-25°C，相 對溼度<30%)取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部 粘貼，在NC膜T線一側搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體 金墊另一側搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側搭接 吸樣墊(搭吸樣墊的1/10);然後用裁剪機將貼好塑料板切成3mm或4mm 寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內，形成HCV IgM抗體檢測 試劑卡。
2.4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將製備好的試紙條或試劑 卡平放，在上樣墊上加入50 — 100ul被檢樣品，若樣品中含抗HCV IgM抗 體，則和樣品墊上的標記HCV抗原的膠體金結合，形成複合物，並擴散到 NC膜上進一步層析，當遇到包被在NC膜上T線處的鼠抗人IgM時，複合物 則又和包被抗IgM抗體結合，被捕獲在包被處，當被捕獲的膠體金複合物 達到一定數量時，則形成一條肉眼可見的T線；若血清中不含特異性抗體， 則不能形成免疫複合物，亦不能形成T線，C線作為試劑的質控標準，陽性 和陰性樣品檢測時均會出現。用肉眼直接觀察在15、 20、 30和45分鐘內C、 T線的出現情況，並判定檢測結果。
2.5試紙工藝參數調試將濃度不同標記、包被的試劑進行組合配對，製備小樣，利用質控血清對試劑進行測試，發現最佳組合。
2.6臨床血清檢測用本試劑按檢測方法對所有HCV IgG陽性血清、陰性血清進行檢測，陽性血清同時用Abbott IgM抗體檢測ELISA試劑進行對照檢測。3結果
3.1試紙參數確定根據小樣的檢測結果，確定了試紙的最佳標記pH值為8.0;重組混合抗原的最佳標記量為lmg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為lOmM硼酸酸鹽緩衝液，pH8. 0，含0. 5%BSA、 10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20;最佳包鼠抗人IgM包被濃度為lmg/ml。檢測結果的最佳判定時間為5-30分鐘。
3.2臨床血清檢測以ELISA試劑為對照，80份HCV IgG陽性血清中ELISA檢測出IgM陽性血清54份，本試劑檢測出陽性為52份，靈敏度=52/54=96.3%;本試劑對300份陰性血清檢出假陽性5份，特異性=295/300=98. 3%。分析試劑性能和ELISA試劑相比無顯著性差異。
權利要求1、一種C型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，包括上樣墊(1)、緊密連接於上樣墊一端的含有標記HCV混合抗原的膠體金墊(2)、與膠體金墊的另一端緊密連接的硝酸纖維素(NC)膜(3)和緊密連接於NC膜另一端的吸樣墊(4)，NC膜包被有相互分離的檢測(T)線(5)和質控(C)線(6)，上樣墊、膠體金墊、NC膜和吸樣墊粘貼到塑料支撐板(7)上形成試紙條，試紙條亦可以裝入塑料卡中形成卡式包裝，其特徵在於T線為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，C線為包被在NC膜上的HCV混合抗原構成。
2、 根據權利要求l所述的C型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特 徵在於所述的HCV混合抗原為重組表達HCV的核心抗原(Core)和非結構蛋 白(NS) 3抗原，亦可選擇性再加入HCV的NS4、 NS5、 El和E2區抗原。
3、 根據權利要求l所述的C型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特 徵在於所述的上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成。
專利摘要本實用新型是涉及生物應用技術領域，特別涉及一種C型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙。包括上樣墊(1)、緊密連接於上樣墊一端的含有標記HCV混合抗原的膠體金墊(2)、與膠體金墊的另一端緊密連接的硝酸纖維素(NC)膜(3)和緊密連接於NC膜另一端的吸樣墊(4)。NC膜包被有相互分離的檢測(T)線(5)和質控(C)線(6)，T線為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，C線為包被在NC膜上的抗HCV抗體。檢測時將被檢樣品加在試紙條(卡)上樣墊上，然後直接觀察免疫反應結果，完成檢測。具有操作簡便、反應快速、靈敏度高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。
文檔編號G01N33/532GK201331529SQ20082007459
公開日2009年10月21日 申請日期2008年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者洲 李, 楊發青 申請人:天津中新科炬生物製藥有限公司