抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗及其製作方法

2023-07-28 00:22:51 1

專利名稱：抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗及其製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗及其製作方法。
背景技術：
魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，又稱產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是
動物腸道正常菌群之一，也是引起魏氏梭菌病的原兇。其發病機理是在飼養環境和飼料 突然改變等誘因下，腸道內魏氏梭菌大量繁殖，產生的毒素經消化道吸收，導致動物出 現腸毒血症，壞死性腸炎，綿羊軟腎病，仔豬紅痢、羔羊痢疾、兔出血性下痢，創傷性 氣性壞疽，動物猝死症等。根據菌體分泌外毒素不同，將魏氏梭菌分為五個血清型，即 A、B、C、D、E型(見表1)。外毒素是魏氏梭菌的毒力因子，目前已發現有15種之 多，但致死性因子只有4種，S卩α、β、ε和t，其中最根本、最重要的致病因子—— α毒素(C.perfringens alpha toxin, CPA)是A E型所共有的毒力因子。α毒素具有磷 脂酶C (PhospholipaseC，PLC)和鞘磷脂酶(Sphingomyelinase)活性，能水解卵磷脂和鞘 磷脂使細胞膜破裂，因而具有溶血性、細胞毒性、致死性和皮膚壞死等特性。表1各型魏氏梭菌及其主要分泌毒素
權利要求
1.一種抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗的製作方法，其特徵是該方法包括(1)以含編碼魏氏梭菌α毒素的質粒或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴增獲得 魏氏梭菌α毒素基因，將獲得的魏氏梭菌α毒素基因和Ti質粒分別進行酶切，回收目 的基因和植物表達載體片段，連接並轉化大腸桿菌，對重組Ti進行酶切、PCR和測序鑑 定，用重組質粒轉化根瘤農桿菌，篩選、PCR鑑定獲得陽性重組根瘤農桿菌ρΑ:已於 2010年6月2日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO: Μ 2010130。(2)植物種子經春化、萌發、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的根瘤農桿菌 ρΑ分別侵染外植體，通過篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉化植株，篩選鑑定轉基因陽 性植株，提取轉基因植物基因組或蛋白進行Southern blot、Northern blot或Western blot鑑 定，證明魏氏梭菌毒素在植物中得到表達。
2.根據權利要求1所述的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗的製作方法，其特徵是步 驟(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以採用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和 /或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti質粒也可以採用Ri質粒，同時 所述的根瘤農桿菌採用髮根農桿菌。
3.根據權利要求1或2所述的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗的製作方法，其特徵是 步驟(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或農作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜 蓿，所述的蔬菜包括馬鈴薯，所述的農作物包括玉米，所述的水果包括西紅柿，所述的 模式植物包括菸草。
4.一種利用權利要求1-3的方法製作的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗，其特徵是 所述的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗為直接口服疫苗，或者將植物表達的蛋白抗原經提 取、加工成口服或注射製劑使用。
5.—種抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗的製作方法，其特徵是該方法包括(1)以含黏膜佐劑大腸桿菌熱不穩定腸毒素B亞單位(LT-B)的質粒或病料為模板， 利用PCR或RT-PCR擴增獲得黏膜佐劑LT-B基因，以含編碼魏氏梭菌α毒素的質粒 或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴增獲得魏氏梭菌α毒素基因，將所述的黏膜佐 劑LT-B基因與所述的魏氏梭菌α毒素基因融合獲得融合基因，將獲得融合基因和Ti質 粒分別進行酶切，回收目的基因和植物表達載體片段，連接並轉化大腸桿菌，對重組Ti 質粒進行酶切、PCR和測序鑑定，用重組質粒轉化根瘤農桿菌，篩選、PCR鑑定獲得陽 性重組根瘤農桿菌pLA:已於2010年6月2日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號 為CCTCCNO M 2010131。(2)植物種子經春化、萌發、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的根瘤農桿菌 pLA分別侵染外植體，通過篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉化植株，篩選鑑定轉基因 陽性植株，提取轉基因植物基因組或蛋白進行Southern blot、Northern blot或Western blot 鑑定，證明魏氏梭菌毒素在植物中得到表達。
6.根據權利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗的製作方法，其特徵是步 驟(1)中所述的大腸桿菌熱不穩定腸毒素B亞單位(LT-B)或者採用霍亂毒素B亞基 (CT-B)。
7.根據權利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗的製作方法，其特徵是步 驟(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以採用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和/或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti質粒或者採用Ri質粒，同時所 述的根瘤農桿菌採用髮根農桿菌。
8.根據權利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗的製作方法，其特徵是步 驟(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或農作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜 蓿，所述的蔬菜包括馬鈴薯，所述的農作物包括玉米，所述的水果包括西紅柿，所述的 模式植物包括菸草。
9.一種利用權利要求5-8方法製作的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗，其特徵是所 述的抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗為直接口服，還為將植物表達的蛋白抗原經提取、加 工成口服或注射製劑使用。
全文摘要
抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗及其製作方法。目前免疫接種抗魏氏梭菌病的疫苗保護率較低。本發明包括(1)以含編碼魏氏梭菌毒素的質粒或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴增獲得魏氏梭菌毒素基因，將獲得的魏氏梭菌毒素基因和Ti或Ri質粒分別進行酶切，回收目的基因和植物表達載體片段，連接並轉化大腸桿菌，對重組Ti或Ri質粒進行酶切、PCR和測序鑑定，用重組質粒轉化根瘤農桿菌或髮根農桿菌，篩選、鑑定陽性重組農桿菌；(2)植物種子經春化、萌發、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的農桿菌分別侵染外植體，通過篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉化植株，篩選鑑定轉基因陽性植株。
文檔編號C12N15/82GK102008720SQ20101023114
公開日2011年4月13日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者劉松梅, 朱延明, 李一經, 葛俊偉 申請人:東北農業大學