檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯免疫試劑盒的製作方法

2023-07-28 03:07:36

專利名稱：檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯免疫試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯免疫試劑盒。
背景技術：
豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)屬於絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的Bowman-Birk類型的雙頭蛋白酶抑制劑，即一個抑制劑分子可以抑劑兩個胰蛋白酶分子的催化活性。自上世紀80年代，CpTI基因作為一種抗蟲基因成為轉基因植物的備選基因，並在表達後與非轉基因植物相比表現出優良的抗蟲特性，目前已成為我國眾多轉基因棉花品種中所攜帶的基因。準確評價CpTI轉基因作物的生態和食品安全性、進行轉基因產品的強制標識，檢驗和監測轉基因作物種子的純度等，必須建立起一套具有自主智慧財產權的快速、準確的外源基因表達蛋白的檢測方法。目前檢驗CpTI轉基因植物常用的方法是基因層面的分子檢測方法。由於酶聯免疫測定技術具有高通量、快速及靈敏度高等特點，在轉基因植物鑑定等方面已經獲得了廣泛的應用，但CpTI的雙抗夾心酶免疫檢測方法還未見報導，所以建立一種精確的CpTI免疫檢測方法具有非常重要的意義。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體。本發明所提供的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細胞株CpTI 3D6分泌產生的。本發明的另一個目的是提供保藏編號為CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細胞株CpTI 3D6。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體在製備檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯免疫試劑盒中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的又一個目的是提供一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯免疫試劑盒。本發明所提供的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯免疫試劑盒，含有所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑的多克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品； 所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品為豇豆胰蛋白酶抑制劑。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品的濃度為100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/ mL、6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 禾口 0. 39ng/mL。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品按照包括如下步驟的方法製備得到的(1)將豇豆種子粉浸泡於質量百分比為0. 3%的氯化鈉水溶液中，得到浸泡後的混合物；將所述浸泡後的混合物離心，取上清液，即得到提取液；將所述提取液用飽和硫酸銨溶液進行鹽析粗純化，取30% -60%鹽溶度間的蛋白溶液，即得到粗純化的豇豆胰蛋白酶抑制劑溶液；所述浸泡的溫度為4°C和浸泡時間為16h ；所述粗純化的溫度為4°C和粗純化時間為4h ；(2)將步驟⑴得到的粗純化的豇豆胰蛋白酶抑制劑溶液在以下條件下進行凝膠過濾葡聚糖G-50填料，16mmxl00cm層析柱，0. IM pH7. OPBS緩衝液洗脫，流速0. 3ml/h, 1. 5mL/管進行分步收集，取活性高部分濃縮，得到濃縮液；(3)將步驟( 得到的濃縮液在以下條件下進行親和層析CNBr-Sepher0Se4B 填料，以豬胰蛋白酶作為配基，上樣緩衝液為0. IM pH7. OPBS緩衝液，洗脫液為0. 1ΜρΗ3. 0 甘氨酸-HCL緩衝液，流速lmL/min，每ImL進行分步收集，取濃度高收集液合併，0. IM PH7. OPBS緩衝液透析凍幹，用體積比為1 1的水甘油混合液進行溶解，即豇豆胰蛋白酶抑制劑。所述試劑盒中含有用於標記所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的標記酶。所述試劑盒中包括包被緩衝液、洗滌液、底物緩衝液、終止緩衝液和封閉液；所述包被緩衝液由Na2C03、NaHCO3和水組成；以上各成分在包被緩衝液中的濃度分別為=Na2CO3O. OlM和NaHCO3O. 04M ；所述洗滌液由Nei2HPO4、KH2PO4、NaCl、吐溫-20和水組成；以上各成分在洗滌液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和吐溫-20的體積百分比濃度為0. ；所述底物緩衝液由檸檬酸三鈉、Na2HPO4和水組成；以上各成分在底物緩衝液中的濃度分別為檸檬酸三鈉0. OlM和Na2HPO4O. 03M。所述終止緩衝液由硫酸和水組成；所述硫酸在所述終止緩衝液中的濃度為2M ；所述封閉液由Na2HPCV KH2PO4、NaCl、脫脂牛奶和水組成；以上各成分在封閉液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和脫脂牛奶的質量百分比濃度為3%。所述標記酶為辣根過氧化物酶。本發明的又一個目的是提供一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。本發明所提供的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法，包括如下步驟將待測樣品進行前處理，得到樣品檢測液；再用所述試劑盒對樣品檢測液進行檢測；所述前處理的方法包括如下步驟將所述待測樣品研磨後，用PBS緩衝液進行浸泡，得到浸泡後的混合物；將所述混合物進行離心，取上清，即得到樣品檢測液；所述浸泡的時間為12小時；所述離心的轉速為8000r/min和離心的溫度為4°C ；所述PBS緩衝液由Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl和水組成；以上各成分在PBS緩衝液中濃度分別為Νει2ΗΡ04 0 . 02Μ、KH2PO4 0. 0015Μ和NaCl 0. 14Μ。所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、所述試劑盒或所述方法在鑑別轉CpTI基因植物中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的又一個目的是提供一種輔助鑑別轉CpTI基因植物的方法。本發明所提供的輔助鑑別轉CpTI基因植物的方法，包括如下步驟用所述試劑盒對待測植物進行檢測，以已知的非轉基因植物作為對照，若對待測植物進行檢測時檢測孔的吸光值大於所述對照的3倍，則確認所述待測植物為候選的轉CpTI基因植物。本發明應用抗CpTI多克隆抗體及酶標記抗CpTI單克隆抗體，採用雙抗夾心ELISA 方法進行試劑盒製備，並應用製備的試劑盒鑑定轉基因作物真偽，具有快速、靈敏的優點。本發明所提供的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯免疫試劑盒將有廣闊的應用前景。


圖1為酶聯免疫試劑盒檢測CpTI蛋白濃度的標準曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、製備檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯免疫試劑盒一、試劑盒的製備 (一)CpTI免疫原和CpTI標準品的製備CpTI免疫原和CpTI標準品經由豇豆蛋白提取、鹽析、凝膠過濾和親和層析步驟獲得，具體方法如下(I)CpTI蛋白提取和粗純化以高鹽溶液進行豇豆總蛋白提取，具體方法為取80克黑梅一號豇豆種子(購白益農蔬菜種子商行)研磨成粉用400ml 0. 3%氯化鈉水溶液進行浸泡，浸泡條件為溫度為 4°C，時間為16h，期間進行搖動，離心，取上清液，即得到提取液。將得到的提取液以飽和硫酸銨溶液進行鹽析粗純化，粗純化條件為溫度為4°C， 時間為4h，靜置，取30% -60%鹽溶度間的蛋白溶液，即得到粗純化CpTI蛋白溶液。(2)凝膠過濾取步驟(1)所得粗純化的CpTI蛋白溶液進行凝膠過濾，凝膠過濾的條件為葡聚糖 G-50填料，16mmxl00cm層析柱，0. IM pH7. OPBS緩衝液洗脫，流速0. 3ml/h, 1. 5mL/管進行分部收集，監測各管收集液蛋白濃度及抑制活性，取活性高部分濃縮，得到濃縮液。(3)親和層析取步驟( 得到的濃縮液進行親和層析，此步驟的條件為CNBr-Sepher0Se4B填料，以豬胰蛋白酶(購自Sigma公司，產品目錄號為9002-07-7)作為其配基，上樣緩衝液為 0. IM pH7. OPBS緩衝液，洗脫液為0. IM ρΗ3· 0甘氨酸-HCL緩衝液，流速lmL/min,每ImL進行分部收集，檢測各管蛋白濃度及抑制活性，取濃度高收集液合併，0. IM PH7. OPBS緩衝液透析凍幹，得到CpTI蛋白，-20°C保存。以超純水溶解得到的CpTI蛋白，使其終濃度為Img/ mL，作為CpTI免疫原溶液；以水甘油(1 1)溶解得到的CpTI蛋白，使其終濃度為Img/ mL，作為CpTI蛋白標準品溶液。上述步驟⑵和步驟(3)中所述蛋白抑制活性實驗的具體方法為以N-苯甲醯-DL-精氨酸對硝基苯醯胺鹽酸鹽BAPNA為底物，取待測液0. Iml加入IOml試管中，加 50mg/L的豬胰蛋白酶0. 5mL。最後體積均用pH8. 0,0. 05mol/L的Tris-HCl緩衝液補至lmL， 37°C保溫 5min，加 ΒΑΡΝΑ 溶液 2. 5mL(l X lO^nol/L)，37°C反應 5min，立即加入 0. 4ml 60% 醋酸溶液終止反應，以不加待測液的試樣做對照，410nm處測定OD值。計算各分部收集液抑制活性，即對照吸光值與收集液吸光值的差值，再與對照吸光值的比值。該比值越高說明抑制活性越強，反之則弱。當分部收集液的抑制活性出現快速持續增長時，合併收集液，直至抑制活性下降至平緩水平。(二)抗CpTI的多克隆抗體的製備CpTI多克隆抗體為免疫原免疫家兔，經過血清提取及抗體純化步驟得到，具體方法如下(1)取3月兔齡的紐西蘭大耳白兔(購自軍事醫學科學院實驗動物中心)，體重 ^gW上，作為實驗動物。(2)基礎免疫將實驗(一)得到的CpTI免疫原溶液(lmg/mL)經無菌過濾器過濾後加入等體積弗氏完全佐劑(購自Sigma公司，商品目錄號為F5881)，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散。用乳化好的免疫原採用後腳趾間隙注射白兔，注射劑量為 Img抗原/只。(3)加強免疫基礎免疫一個月後，取ImL實驗(一)得到的CpTI免疫原溶液，加入ImL弗氏不完全佐劑(購自Sigma公司，商品目錄號為F5506)，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散。將乳化好的免疫原採用後腿股淋巴結或背部、頸部皮下多點注射白兔，每隻白兔的注射劑量為lmg。加強免疫每隔20天免疫一次，第五次免疫後第7天，在頸動脈採全血，置4°C冰箱過夜，以3000r/min離心，分離血清，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的血清進行純化，得到多克隆抗體，_20°C保存。(三)抗CpTI的單克隆抗體的製備CpTI單克隆抗體為免疫原免疫小鼠經過細胞融合、篩選、亞克隆、腹水製備及抗體純化步驟得到。免疫方法(1)取8-10周齡的Bal b/C小白鼠(購自軍事醫學科學院實驗動物中心)作為實驗動物。(2)基礎免疫將實驗(一)得到的CpTI免疫原溶液(lmg/mL)經無菌過濾器過濾後加入等體積弗氏完全佐劑，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散。用乳化好的免疫原採用腹腔及背部皮下多點注射Bal b/C小鼠，注射劑量為0. Img抗原/只。(3)加強免疫基礎免疫2周後，取ImL實驗(一)得到的CpTI免疫原溶液，加入 ImL弗氏不完全佐劑，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散。將乳化好的免疫原採用腹腔及背部皮下多點注射Bal b/C小鼠，每隻小鼠的注射劑量為0. Img0加強免疫每隔10天免疫一次，從第三次加強免疫開始，每次免疫後第7天，從小鼠眼眶採血，測定抗體效價，效價的定義為OD值為1時的血清稀釋倍數。待效價大於1 8000 後，選擇血清效價最佳的小鼠(效價為1 40000)進行細胞融合篩選單克隆抗體。有限稀釋法篩選分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；採取間接非競爭ELISA方法篩選分泌抗體效價高的單克隆細胞株。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 1(數量配比)比例與 SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩定分泌抗CpTI的單克隆抗體的單克隆雜交瘤細胞株。 將此細胞株命名為CpTI 3D6，分類命名為雜交瘤細胞，該細胞株已於2011年03月01日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4617。
間接非競爭ELISA方法步驟如下包被在96孔酶標板中每孔加入IOOmL實驗(一)得到的CpTI免疫原溶液，37°C 包被3小時，用PBS緩衝液洗滌4次。封閉封閉液150 μ L/孔，在37°C溼盒中封閉lh，棄封閉液，洗滌3次。加抗體將不同稀釋倍數的增量培養法得到的單抗加至酶標板中，置溼盒中37°C 條件下30min，洗板4次。加酶標二抗將羊抗鼠酶標二抗IgG-HRP(購自Jackson公司，商品目錄號為 79556) (0. lmg/mL)稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置溼盒中37°C條件下30min，洗板4次。顯色取20mg0PD溶於IOmL底物稀釋液中，加4 μ L 30% H2O2，將底物溶液加入酶標板中，每孔100 μ L。避光顯色15min。終止每孔加入50 μ L終止液，用酶標儀490nm處測定各孔的OD值。單克隆抗體的製備與純化增量培養法將雜交瘤細胞CpTI 3D6置於細胞培養基中，在37°C條件下於二氧化碳培養箱中進行培養，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，-20°C保存。所述細胞培養基為向DMEM培養基中添加小牛血清(購自GIBC0BRL，產品目錄號為 26170-043)和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養基中的終濃度為20% (質量百分含量)， 使碳酸氫鈉在細胞培養基中的終濃度為0.2% (質量百分含量)；所述細胞培養基的PH為 7. 4。(四)酶標抗體的製備(I)HRP的活化將IOmg辣根過氧化物酶(HRP)(購自Sigma公司，產品目錄號為 P6782)溶於ImL水中，加入0. 2mL IOOmM NaIO4水溶液，25°C攪拌反應20min，將得到的溶液記作溶液I ；HRP與NaIO4的投料配比為IOmgHRP :0. 02molNaI04 ；此步驟的目的是使HRP 糖基上的鄰二羥基被氧化成活性醛基，生成的醛基與抗體蛋白的氨基共價鍵結合，避免了因酶分子上的氨基或羧基參與偶聯反應而使酶的活性產生較大損失。(2)向所述溶液I中加入20μ 1的IM的乙二醇水溶液，25°C攪拌反應lOmin，將反應溶液置於透析袋中與PH7. 5的PBS緩衝液中4°C透析4小時。將得到的溶液記作溶液II ； 乙二醇與NaIO4的投料摩爾比為1 1。加入乙二醇的目的是使其與過量的NaIO4反應，終止NaIO4氧化反應並去除其對後續實驗的幹擾。(3)將7mg上述實驗(三)得到的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體溶於ImL PH值為9. 5的碳酸鹽緩衝液中，再加入所述溶液II，調節PH值至8. 0，25 V反應2小時，將得到的溶液記作溶液III ;HRP與單克隆抗體的投料摩爾比為2 1。(4)向所述溶液III中加入0. ImL濃度為0. IM的NaBH4水溶液，4°C攪拌反應2小時，得到溶液IV。此步驟的目的是還原過碘酸鈉氧化法產生的不穩定的醛基與氨基形成的 C = N雙鍵(C = N雙鍵指酶與抗體蛋白之間的連接鍵)。(5)將步驟(4)的得到的溶液IV置於PBS中透析完全，得到抗體蛋白與HRP的偶聯物，即得到辣根過氧化物酶標記的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體。二、檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯免疫試劑盒1、包被原上述實驗(二)製備得到的抗CpTI的兔多克隆抗體。
2、酶標抗體上述實驗(四)製備得到的辣根過氧化物酶標記的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體。3、包被緩衝液由Na2C03、NaHCO3和水緩衝液組成；以上各成分在包被緩衝液中的濃度分別為=Na2CO3O. OlM和NaHCO3O. 04M ；所述包被緩衝液的pH值為9. 6。4、洗滌液由 Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl、吐溫-20 和水組成；以上各成分在洗滌液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和吐溫-20的體積百分比濃度為0. ；所述洗滌液的pH值為7. 5。5、標準品溶液用PBS緩衝液將上述實驗(一)製備得到的CpTI蛋白標準品溶液 (lmg/mL)稀釋至以下濃度標準品溶液中CpTI 蛋白濃度分別為 100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、 6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 禾口 0. 39ng/mL。所述PBS緩衝液由Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl和水組成；以上各成分在PBS緩衝液中濃度分別為Νει2ΗΡ040· 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ和NaCl 0. 14Μ。6、底物緩衝液所述底物緩衝液由檸檬酸三鈉、Na2HPO4和水組成；以上各成分在底物緩衝液中的濃度分別為檸檬酸三鈉0. OlM和Na2HPO4O. 03Μ ；所述底物緩衝液的PH值為5.5。7、終止緩衝液2. OM的硫酸水溶液。8、封閉液由Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl、脫脂牛奶和水組成；以上各成分在封閉液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和脫脂牛奶的質量百分比濃度為3%。9、樣品稀釋液與洗滌液的成分相同。實施例2、試劑盒的應用一、製作標準曲線(1)多克隆抗體的包被將lmg/mL抗CpTI的兔多克隆抗體用包被緩衝液進行稀釋，按照抗CpTI的兔多克隆抗體與包被緩衝液的體積比為1 1000的比例稀釋後加入到酶標板中，每孔ΙΟΟμ 1，37°C溫育3小時；倒去酶標板中的溶液，用PBS緩衝液洗板4次，甩幹。(2)在步驟(1)的酶標板中分別加入不同濃度的CpTI蛋白標準品溶液(實驗孔)， 每孔100 μ 1，對照孔中不添加標準品溶液而加入100 μ 1 PBS緩衝液；37°C溫育30min ；倒掉酶標板中的溶液，用PBS緩衝液洗板4次，甩幹；所述不同濃度的CpTI蛋白標準品溶液中CpTI蛋白濃度分別為100ng/mL、50ng/ mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 禾口 0. 39ng/mL。(3)將lmg/mL的辣根過氧化物酶標記的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體(酶標記抗體)用PBS緩衝液進行稀釋，按照酶標記抗體與PBS緩衝液的體積比為1 500稀釋後， 分別向上述步驟O)的酶標板中加入100 μ 1稀釋後的酶標記抗體；37°C溫育30min ；倒掉酶標板中的溶液，用PBS緩衝液洗板4次，甩幹。
(4)向步驟(3)的酶標板中分別加入100 μ 1底物緩衝液，室溫反應15min後，再向每孔中加入50 μ 1 2. OM的硫酸水溶液終止反應。(5)在492nm下測定吸光值。(6)繪製標準曲線以不同濃度的CpTI蛋白標準品溶液濃度(ng/mL)的對數值作為X軸，以吸光度值B作為Y軸，運用0rigin7. 0繪製標準曲線。實驗設3次重複，取三次實驗結果的平均值，得到的標準曲線圖如圖1所示。標準曲線方程為 y = 0. 2875x+0. 165 (R2 = 0. 9932)。二、轉基因作物真偽的鑑定(1)將轉基因棉花SGK321(公眾可從中國農業大學獲得，記載過該材料的非專利文獻是眭書祥，趙國忠，李愛國等.轉Bt+CpTI基因抗蟲棉品種SGK321性狀分析和種質利用.科技導報.2008,26(9) 42 45)的葉片於研缽中研磨，用PBS緩衝液於4°C浸泡12 小時，8000r/min 4°C離心取上清，得到轉基因作物樣本溶液。用同樣的方法得到非轉基因棉花石遠321(公眾可從中國農業大學獲得，記載過該材料的非專利文獻是眭書祥，趙國忠，李愛國等.轉Bt+CpTI基因抗蟲棉品種SGK321性狀分析和種質利用.科技導報.2008， 26(9) 42 45)葉片的樣本溶液。所述PBS緩衝液由Na2HPO4, KH2PO4, NaCl和水組成；以上各成分在PBS緩衝液中濃度分別為Νει2ΗΡ040 . 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ和NaCl 0. 14Μ。(2)多克隆抗體的包被與上述實驗一(即製作標準曲線的實驗)中步驟(1)相同。(3)除將CpTI蛋白標準品溶液替換為上述步驟(2)得到樣本溶液以外，其餘方法均與上述實驗一(即製作標準曲線的實驗)中步驟(2)相同。(4)與上述實驗一(即製作標準曲線的實驗)中步驟⑶相同。(5)與上述實驗一(即製作標準曲線的實驗)中步驟⑷相同。(6)與上述實驗一(即製作標準曲線的實驗)中步驟(5)相同。(7)含有轉基因樣品提取液的孔與含有非轉基因樣品提取液的孔顏色有明顯不同，含有轉基因樣品提取液的孔顏色深，含有非轉基因樣品提取液的孔顏色淺。以非轉基因樣品為對照，待肉眼觀測到鑑定樣品的顏色明顯深於非轉基因樣品時，認為其為轉基因樣品，顏色沒有差別時，認為所鑑定樣品為非轉基因樣品。由此可初步鑑定轉基因作物的真偽。同時，以步驟(6)所得到吸光值鑑別轉基因作物真偽，即所鑑定樣品吸光值大於對照樣品吸光值三倍時，認為所鑑定樣品為轉基因樣品，否則為非轉基因樣品。實驗設三次重複，結果取平均值。在本實驗中，轉基因棉花SGK321樣品測得的吸光值為0. 355，非轉基因棉花石遠 321樣品測得吸光值為0. 113，轉基因棉花SGK321樣品的吸光值大於非轉基因棉花石遠321 樣品吸光值三倍，說明該方法準確、可靠。對轉基因樣品進行半定量檢測將所得鑑定樣品的OD值代入上述實驗一得到標準曲線方程，即可得到鑑定樣品溶液中CpTI的蛋白含量。由該方法得到的轉基因棉花 SGK321樣品溶液中CpTI的蛋白含量為1. 939ng/mL。
權利要求
1.一種豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細胞株CpTI 3D6分泌產生的。
2.保藏編號為CGMCCNo. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細胞株CpTI3D6。
3.權利要求1中所述的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體在製備檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯免疫試劑盒中的應用。
4.一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯免疫試劑盒，含有權利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑的多克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品；所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品為豇豆胰蛋白酶抑制劑。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品的濃度為 100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 和 0.39ng/mL。
6.根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中含有用於標記所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的標記酶。
7.根據權利要求4-6中任一所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中包括包被緩衝液、洗滌液、底物緩衝液、終止緩衝液和封閉液；所述包被緩衝液由Na2C03、NaHCO3和水組成；以上各成分在包被緩衝液中的濃度分別為=Na2CO3O. OlM和NaHCO3O. 04M ；所述洗滌液由Na2HP04、KH2PO4, NaCl、吐溫-20和水組成；以上各成分在洗滌液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M和吐溫-20的體積百分比濃度為0. ；所述底物緩衝液由檸檬酸三鈉、Na2HPO4和水組成；以上各成分在底物緩衝液中的濃度分別為檸檬酸三鈉0. OlM和Na2HPO4O. 03M。所述終止緩衝液由硫酸和水組成；所述硫酸在所述終止緩衝液中的濃度為2M ；所述封閉液由Na2HPCV KH2P04、NaCl、脫脂牛奶和水組成；以上各成分在封閉液中的濃度分別為Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M和脫脂牛奶的質量百分比濃度為3%。所述標記酶為辣根過氧化物酶。
8.—種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法，包括如下步驟將待測樣品進行前處理，得到樣品檢測液；再用權利要求4-7中任一所述的試劑盒對樣品檢測液進行檢測；所述前處理的方法包括如下步驟將所述待測樣品研磨後，用PBS緩衝液進行浸泡，得到浸泡後的混合物；將所述混合物進行離心，取上清，即得到樣品檢測液；所述浸泡的時間為12小時；所述離心的轉速為8000r/min和離心的溫度為4°C。
9.權利要求1中所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、權利要求4-7中任一所述試劑盒或權利要求8所述方法在鑑別轉CpTI基因植物中的應用。
10.一種輔助鑑別轉CpTI基因植物的方法，包括如下步驟用權利要求4-7中任一所述試劑盒對待測植物進行檢測，以已知的非轉基因植物作為對照，若對待測植物進行檢測時檢測孔的吸光值大於所述對照的3倍，則確認所述待測植物為候選的轉CpTI基因植物。
全文摘要
本發明公開了檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯免疫試劑盒。本發明所提供的酶聯免疫試劑盒含有豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體；所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細胞株CpTI 3D6分泌產生的。本發明應用抗CpTI多克隆抗體及酶標記抗CpTI單克隆抗體，採用雙抗夾心ELISA方法進行試劑盒製備，並應用製備的試劑盒鑑定轉基因作物真偽，具有快速、靈敏的優點。
文檔編號G01N21/31GK102199211SQ201110090869
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者南鐵貴, 孫碩, 曹振, 李召虎, 王保民, 王敏, 譚桂玉, 趙洪偉, 高巍 申請人:中國農業大學