一種單寧酶高產菌株及其製備方法

2023-07-28 02:49:11

一種單寧酶高產菌株及其製備方法
【專利摘要】本發明提供一種單寧酶高產菌株及其製備方法。在以單寧酸為唯一碳源的培養基中對接入的五倍子中的微生物進行篩選，共分離到15株產單寧酶的純種菌株，經搖瓶培養，最終確定一株產單寧酶活力最高的菌株N5，酶活力為45.56U/mL。經菌種鑑定，確定菌株N5為黑麴黴( Aspergilluse niger )。該菌株保藏號為CCTCC NO：M2014051。CCTCC NO:M20140512014.02.28
【專利說明】一種單寧酶高產菌株及其製備方法
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發明涉及微生物【技術領域】，具體涉及微生物篩選、菌種鑑定及發酵產酶相關領 域，特別是提供了一種單寧酶高產菌株及其製備方法。

【背景技術】
[0003] 單寧酶（Tannase，E.C. 3. 1. 1.20)，是一種廣泛存在於微生物及植物中的誘導 酶，尤其是在絲狀真菌中，以單寧酸、五倍子等作為誘導物時可大量產生，屬於細胞膜結合 酶，可分泌到胞外。單寧酶可專一性水解水解型單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸、 葡萄糖及相應的醇類等物質。
[0004] 單寧酶目前已應用於飲料、釀酒、食品、醫藥、化工、製革及化妝品等多個領域，尤 其在製備沒食子酸、沒食子酸丙酯及處理茶汁"冷後渾"和啤酒沉澱等方面應用廣泛。但目 前單寧酶生產效率不高，且市場價格非常昂貴，這阻礙了單寧酶的進一步應用。
[0005] 經文獻查新得知，目前生產單寧酶的主要方法還是通過微生物發酵製備，尤其對 麴黴屬、青黴屬、根黴屬的真菌及乳桿菌等細菌發酵生產單寧酶的報導較多。但目前存在著 這些微生物大多產酶不高，尤其是國內對單寧酶高產菌株缺乏自主智慧財產權等問題。


【發明內容】

[0006] 本發明目的是針對以上存在的問題，提供一種單寧酶高產菌株及其製備方法，從 而提高單寧酶發酵產量，解決當前單寧酶生產效率不高的問題。
[0007] 本發明篩選出的一株單寧酶高產菌株命名為N5,經菌種鑑定為黑麴黴 /?i職r)，保藏號：CCTCCNO:M2014051，保藏時間：2014年2月28日，保藏 單位：中國典型培養物保藏中心（CCTCC)。
[0008] 本發明菌株的製備方法包括以下步驟： (1) 用10mL無菌水衝洗5g五倍子，將衝洗液加入到含90mL無菌水的錐形瓶中，搖 勻，即為KT1的菌溶液，梯度稀釋至KTltl,各梯度於篩選培養基上塗平板3個，30 °C培養48 h，挑取平板上菌落及水解圈較大的單菌落（共15個，編號N1-N15)分別接於PDA(馬鈴薯 瓊脂培養基）斜面活化72h。所述篩選培養基由以下組份配製而成：磷酸二氫鉀4.38g， 硫酸銨8.76g，硫酸鎂0.88g，氯化鈣0.088g，氯化錳0.018g，鑰酸鈉0.0088g，硫酸鐵 0. 12g，瓊脂30g，單寧酸10g，用蒸餾水水溶解後定容至IL; (2) 活化72h後的PDA(馬鈴薯瓊脂培養基）斜面上的孢子，用蒸餾水配製成IO6個/ mL的孢子懸浮液，然後接種ImL於30mL發酵培養基中，30 °C，120r/min振蕩培養72h， 提取單寧酶並測其活力，通過酶活力比較確定最優產酶菌株。結果表明，菌株N5產單寧酶 活力最高，為45.56U/mL。所述發酵培養基由以下組份配製而成：單寧酸20g，蔗糖1(^，硝 酸鈉3g，磷酸氫二鉀Ig,氯化鉀0. 5g，硫酸鐵0.Olg,硫酸鎂0. 5g，用蒸饋水溶解後定容至1 L〇
[0009]步驟（2)中，所述單寧酶提取酶活力測定方法，包括以下步驟： a、發酵懸浮液經抽濾後得到菌絲體，蒸餾水洗至pH值中性，於冰箱中4°C預冷，將菌 絲體、石英砂、檸檬酸緩衝液按體積比1:1:4混合，在冰浴下研磨成漿，4 °C下10000r/min 離心30min，取上清液，用檸檬酸緩衝液定容至10mL，即得單寧酶酶液。
[0010] 所述檸檬酸緩衝液配製方法為：準確稱取檸檬酸21.01g，加水定容至1000mL，作 為A液；準確稱取檸檬酸鈉29. 41g，定容至1000mL，作為B液，將A液與B液按1:2比例混 合，再用A液和B液調混合液的pH值至5. 0,即得檸檬酸緩衝液。
[0011] b、準備1支對照管、1支空白管和3支平行測定管，先在每支試管中各加入ImL單 寧酶酶液，45 °C水浴預熱10min，然後在測定管中各加入ImL沒食子酸丙酯溶液，在空白 管中加入ImL檸檬酸緩衝液，在對照管中加入0.6mL乙醇，反應20min後，分別在測定管 和空白管中加入4mL乙醇終止反應，在對照管中加入ImL沒食子酸丙酯溶液。待反應液 冷卻後，用檸檬酸緩衝液稀釋9倍，測定270nm下吸光值。
[0012] 所述沒食子酸丙酯溶液配製方法為：準確稱取0. 2122g沒食子酸丙酯，先加3滴 無水乙醇促溶,再用檸檬酸緩衝液定容至500mL。
[0013] C、用檸檬酸緩衝液分別配製20、40、60、80、100μ--οΙ/L的沒食子酸丙酯溶液，測 定其270nm下的吸光值，繪製回歸曲線，根據該曲線的回歸方程，對照管沒食子酸丙酯濃度 應為93. 343As-l. 6626,測定管沒食子酸丙酯濃度則為93. 343AM -1. 6626,按下列公式計 算酶活力：

【權利要求】
1. 一種單寧酶高產菌株，命名為N5,經菌種鑑定為黑麴黴，保藏號：CCTCC NO:M 2014051，保藏時間：2014年2月28日，保藏單位：中國典型培養物保藏中心。
2. -種單寧酶高產菌株的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 用10 mL無菌水衝洗5 g五倍子，將衝洗液加入到含90 mL無菌水的錐形瓶中，搖 勻，即為KT1的菌溶液，梯度稀釋至KTltl,各梯度於篩選培養基上塗平板3個，30 °C培養48 h，挑取平板上菌落及水解圈較大的單菌落，分別接於馬鈴薯瓊脂培養基斜面活化72 h，所 述篩選培養基由以下組份配製而成：磷酸二氫鉀4.38 g，硫酸銨8.76 g，硫酸鎂0.88 g，氯 化鈣0.088 g，氯化錳0.018g，鑰酸鈉0.0088 g，硫酸鐵0.12 g，瓊脂30 g和單寧酸10 g， 用蒸饋水水溶解後定容至I L ; (2) 活化72 h後的馬鈴薯瓊脂培養基斜面上的孢子，用蒸餾水配製成IO6個/mL的孢 子懸浮液，然後接種I mL於30 mL發酵培養基中，30 °C，120 r/min振蕩培養72 h，提取單 寧酶並測其活力，通過酶活力比較確定最優產酶菌株，所述發酵培養基由以下組份配製而 成：單寧酸20g，蔗糖10g，硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀lg，氯化鉀0. 5g，硫酸鐵0. Olg和硫酸鎂 〇. 5g，用蒸餾水溶解後定容至I L。
3. 根據權利要求2所述的單寧酶高產菌株的製備方法，其特徵在於，步驟（2)中，所述 單寧酶提取酶活力測定方法，包括以下步驟： a、 發酵懸浮液經抽濾後得到菌絲體，蒸餾水洗至pH值中性，於冰箱中4 °C預冷，將菌 絲體、石英砂、檸檬酸緩衝液按體積比1:1:4混合，在冰浴下研磨成漿，4 °C下10000 r/min 離心30 min，取上清液，用檸檬酸緩衝液定容至10 mL，即得單寧酶酶液； b、 準備1支對照管、1支空白管和3支平行測定管，先在每支試管中各加入I mL單寧 酶酶液，45 °C水浴預熱10 min，然後在測定管中各加入I mL沒食子酸丙酯溶液，在空白管 中加入I mL檸檬酸緩衝液，在對照管中加入0.6 mL乙醇，反應20 min後，分別在測定管和 空白管中加入4 mL乙醇終止反應，在對照管中加入I mL沒食子酸丙酯溶液，待反應液冷卻 後，用檸檬酸緩衝液稀釋9倍，測定270 nm下吸光值； c、 用檸檬酸緩衝液分別配製20、40、60、80、100 μπιοΙ/L的沒食子酸丙酯溶液，測定其
270 nm下的吸光值，繪製回歸曲線，根據該曲線回歸方程，對照管沒食子酸丙酯濃度應為 93. 343六#-1_陽州J丨丨簾替沿含罕釀而釀濃麼抓丨為H 描：下功KA=Ff計算酶 活力： 註：式中，4?和七《分別表示酶活力測定時對照管和測定管溶液的吸光度值。
4. 根據權利要求3所述的單寧酶高產菌株的製備方法，其特徵在於，步驟a中，所述檸 檬酸緩衝液配製方法為：準確稱取檸檬酸21. 01 g，加水定容至1000 mL，作為A液；準確稱 取檸檬酸鈉29. 41g，定容至1000 mL，作為B液，將A液與B液按1:2比例混合，再用A液和 B液調混合液的pH值至5. 0,即得檸檬酸緩衝液。
5. 根據權利要求3所述的單寧酶高產菌株的製備方法，其特徵在於，步驟b中，所述沒 食子酸丙酯溶液配製方法為：準確稱取0.2122 g沒食子酸丙酯，先加3滴無水乙醇促溶，再 用檸檬酸緩衝液定容至500 mL。
【文檔編號】C12N9/18GK104263650SQ201410121620
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年3月28日 優先權日:2013年4月28日
【發明者】曹庸, 張帥, 林健輝, 朱華偉, 農嘉儀 申請人:曹庸