凝血酶原時間測定試劑盒及其製備方法
2023-07-27 08:45:21
專利名稱：凝血酶原時間測定試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種臨床實驗室用體外診斷試劑盒及其製備，它用於人血漿標本凝血酶原時間的測定。更具體地說它是一種採用兔腦組織因子和重組人組織因子聯合製備凝血酶原時間測定試劑盒及其其製備方法。
背景技術：
醫院臨床實驗室常規凝血實驗，即凝血常規四項包括凝血酶原時間測定(PT)、部分活化凝血活酶時間測定(APTT)、凝血酶時間測定(TT)、纖維蛋白原濃度測定(FIB)，主要用於出血性疾病的篩查與診斷、血栓性疾病與血栓前狀態檢查、各種抗凝治療監測以及手術前檢查。其中，PT為反應機體外源性凝血途徑的主要檢測指標，常用於1血液凝固異常可疑包括凝血酶原複合物多個因子(II、VII、X)，因子V，纖維蛋白原及去纖維蛋白原血症的篩選實驗；2監測及調整維生素K拮抗劑，香豆素誘導劑的治療；3監測維生素K缺乏及肝臟疾病；4術前篩選可能的止血異常疾病。目前PT的臨床檢測多採用Quick法，其原理為在缺乏血小板的血漿內加入組織促凝血酶原激酶(組織因子)和Ca2+後凝血酶原轉變為凝血酶，通過產生的凝血酶使纖維蛋白原轉變為纖維蛋白。PT測定結果報告方式有三種 秒值、根據標準曲線計算的百分活度，國際標準化比率(international normalized ratio INR)。PT測定結果受眾多因素的影響，其中凝血酶原試劑為最重要的影響因素。商品化的組織因子在敏感性上與WHO推薦的有所不同，因此生產商需要對每批試劑確定一個敏感因子，此即國際敏感指數ISI(international sensitivity index),它用來表示試劑中組織凝血活酶相對活性的指數。不同來源的組織凝血活酶對凝血因子的敏感性不同，為了使不同敏感性的組織凝血活酶在PT檢測中得到同樣的結果，必須要制定一個共同遵循的敏感指標。WHO先後製備或發出了凝血活酶的多種國際參考品(IRP)，用已知ISI值的國際參考試劑與待測組織活酶試劑檢測同一標本，對結果進行比較分析，就可得出試劑的ISI數值。 目前用於生產和出售的組織凝血活酶試劑必須標有ISI數值[I] WT測定影響因素很多，其中最關鍵的是凝血酶原試劑，由於所用凝血酶原試劑的敏感度不同，即使在相同條件下對同一標本測得的結果也不同，而我國醫生常用的凝血酶原百分活動度則因為標準血漿不統一而相差更大，甚至達到難以比較的程度。因此WHO於1981年提出PT標準化報告方式為 INR, INR = (PTR) ISI，其中ISI為國際敏感度指數，PTR為PT測定秒值(s)與PT標準對照秒值(s)的比值。經上述公式換算成INR值後，能克服試劑之間敏感度差異的影響，使INR 值報告方式具有可比性和可信度[2]。國內多數文獻報告人工心臟瓣膜置換術後採用國際正常標準化比值對口服抗凝藥物治療的監測，結果穩定、可靠，具有可比性[3 5]。在口服抗凝藥治療中，華法林類藥物是非常有效的抗凝藥物，它在不同病人體內的新陳代謝率不同，因而它的劑量必須仔細監測，否則就會因超劑量而造成出血或因為劑量不足導致疾病復發，血栓形成。由此可見在凝血酶原時間的測定中，準確的INR結果對臨床抗凝治療藥物的監測非常重要。但是不同ISI值的PT試劑測得的INR結果差異非常顯著，而且當標本的INR值越高時，測定結果差異越顯著。理論上，ISI值越接近1.0，表明試劑越敏感[I]。根據衛生部臨床檢驗中心凝血試驗的室間質控中INR的成績也可以看出ISI值越接近I. O 的PT試劑，測得的結果越準確。所以，在日常工作為了確保口服抗凝藥物治療有效性和安全性，為了檢驗結果的準確性很多實驗室都建議使用接近ISI值I. O的凝血酶原試劑。目前，醫院臨床實驗室檢測PT多用凝血分析儀進行檢測。從方法學上講，凝血分析儀可分為三大類光學法(代表廠家為Sysmex)、磁珠法(代表廠家為Stago)和光學磁珠法(代表廠家為Brink Electronik)。有別於傳統的手工法，不同儀器的方法差異使各類儀器的敏感度指數不一樣，這為PT試劑的最終檢測靈敏度引入了新的影響因素。因此，為不同機型調配出ISI值趨近於I. O的試劑將有助於統一不同機型的檢測結果，有利於PT檢查項目的標準化。參考文獻[I]叢玉隆，血液學體液學檢驗與臨床釋疑[M]，北京人民軍醫出版社，2004:173。[2] 丁煥民，門小平，蔡淑清，服用抗凝藥時INR值的最佳選擇[J]，長春中醫學院學報，1999，12 (15) :40。[3]董力，石應康，鄧承祺等，應用國際標準化比值監測心臟機械瓣膜替換術後抗凝治療[J]，中華胸心血管外科雜誌，1999，15 (4) ;167。[4]魏文寧，王林林，方峻等，機械瓣膜替換術後抗凝中血漿蛋白C含量改變的意義[J]，上海醫學檢驗雜誌， 2001,16(1) :15。[5]高輝，楊舒，朱雯梅等，人工心臟瓣膜替換術後342例患者應用國際正常標準化比率對口服抗凝藥物的監測[J]，上海醫學檢驗雜誌，2002，17 (3) :159。
發明內容
本發明的目的在於克服上述現有背景技術的不足之處，而提供一種凝血酶原時間測定試劑盒及其製備方法。本發明的目的是通過如下措施來達到的凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，其特徵在於所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為2500-3000U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為 8500-9500U/L。在上述技術方案中，所述每升緩衝液體系包括30-50mM的Tris-HCl，佔緩衝液體系重量3 10%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量I 5%的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量O. 6 I. 3%的氯化鈉，6. 8 8. 4mM的氯化鈣，佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3，其餘為水，緩衝液體系的PH值為6. 0-8. O。在上述技術方案中，所述重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為3000U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為9000U/L。在上述技術方案中，所述凝血活酶還包括兔腦磷脂O. 5-1. 5g/L。為了乳化凝血活酶，並提供催化表面。製備上述凝血酶原時間測定試劑盒的方法，其特徵在於它包括如下步驟首先將重組人組織因子、兔腦組織因子和緩衝液體系採用不同的機型進行調試，調試所用的質控血漿為德靈INR標準血漿，通過此血漿測定出在在各種凝血分析儀上的ISI值即分析靈敏度；其次，將在不同的機型上的ISI值為I的重組人組織因子、兔腦組織因子和緩衝液體系的配比固定並分裝，並分別真空冷凍乾燥，即配成為不同機型的凝血酶原時間測定試劑盒。本發明的設計一種PT測定試劑的新的製備技術。在此技術下，可以製備出一系列 PT體外診斷試劑盒，各試劑盒可用於不同方法學原理的凝血分析儀，而其ISI值均可趨近於I. O或等於I。本發明將高靈敏的人重組凝血活酶與低靈敏度的兔腦粉提取凝血活酶結合起來，通過一定的配比製備出能夠滿足不同方法學血凝儀的PT試劑，使其ISI值均能接近 I. O。
圖I為本發明凝血酶原時間測定試劑製備方法的流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖詳細說明本發明的實施情況，但它們並不構成對本發明的限定，僅作舉例而已。同時通過說明本發明的優點將變得更加清楚和容易理解。本發明的目的是通過如下措施來達到的凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為2500-3000U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為 8500-9500U/L。所述每升緩衝液體系包括30_50mM的Tris-HCl，佔緩衝液體系重量3 10%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量I 5%的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量O. 6
I.3%的氯化鈉，6. 8 8. 4mM的氯化鈣，佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3,其餘為水，緩衝液體系的PH值為6. 0-8.0。凝血活酶還包括兔腦磷脂O. 5-1. 5g/L。製備上述凝血酶原時間測定試劑盒的方法(如圖I所示)，它包括如下步驟首先將重組人組織因子、兔腦組織因子和緩衝液體系採用不同的機型進行調試，調試所用的質控血漿為德靈INR標準血漿，通過此血漿測定出在在各種凝血分析儀上的ISI值即分析靈敏度；其次，將在不同的機型上的ISI值為I的重組人組織因子、兔腦組織因子和緩衝液體系的配比固定並分裝，並分別真空冷凍乾燥，即配成為不同機型的凝血酶原時間測定試劑盒。實施例I凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為2500U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為8500U/L，所述每升緩衝液體系包括30mM的Tris-HCl， 佔緩衝液體系重量3%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量I %的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量O. 6%的氯化鈉，6. 8mM的氯化鈣，佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3，其餘為水，緩衝液體系的PH值為6.0。製備凝血酶原時間測定試劑盒的方法，它包括如下步驟首先將重組人組織因子、 兔腦組織因子和緩衝液體系採用不同的機型進行調試，調試所用的質控血漿為德靈INR標準血漿，通過此血漿測定出在在各種凝血分析儀上的ISI值即分析靈敏度；其次，將在不同的機型上的ISI值為I的重組人組織因子、兔腦組織因子和緩衝液體系的配比固定並分裝， 並分別真空冷凍乾燥，即配成為不同機型的凝血酶原時間測定試劑盒。實施例2凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為3000U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為9500U/L。所述每升緩衝液體系包括50mM的Tris-HCl， 佔緩衝液體系重量10%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量5%的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量I. O %的氯化鈉，8. 4mM的氯化鈣，佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3，其餘為水，緩衝液體系的PH值為8.0。製備方法同實施例I。實施例3凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為2800U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為9000U/L。所述每升緩衝液體系包括40mM的Tris-HCl， 佔緩衝液體系重量7%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量3%的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量I. 3%的氯化鈉，7. 6mM的氯化鈣，佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3，兔腦磷脂O. 5g/L， 其餘為水，緩衝液體系的PH值為8. O。製備方法同實施例I。實施例4凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為2750U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為9200U/L。所述每升緩衝液體系包括43mM的Tris-HCl， 佔緩衝液體系重量8%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量4%的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量I. I %的氯化鈉，7. 2mM的氯化鈣，佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3,兔腦磷脂I. 5g/L， 其餘為水，緩衝液體系的PH值為8. O。製備方法同實施例I。實施例5凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為2700U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為9300U/L。所述每升緩衝液體系包括45mM的Tris-HCl， 佔緩衝液體系重量9%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量5%的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量I. 2%的氯化鈉，7. 5mM的氯化鈣，佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3，兔腦磷脂I. Og/L， 其餘為水，緩衝液體系的PH值為8. O。製備方法同實施例I。實驗I :試劑的檢測靈敏度實驗以BE compactX為測試機型，將不同配比的重組人組織因子和兔腦粉提取物組織因子製成PT凍幹試劑。在測試前，用一定體積的蒸餾水復溶。重組人組織因子與兔腦粉提取物組織因子不同配比的靈敏度見表一。ISI值的校準用德靈公司INR標準血漿。表一重組人組織因子與兔腦粉提取物組織因子不同配比的靈敏度(BE CompactX)
權利要求
1.凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，其特徵在於所述的凝血活酶包括兔腦組織因子和重組人組織因子，重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為 2500-3000U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為8500-9500U/L。
2.根據權利要求I所述的凝血酶原時間測定試劑盒，其特徵在於所述每升緩衝液體系包括30-50mM的Tris-HCl，佔緩衝液體系重量3 10%的甘氨酸，佔緩衝液體系重量I 5%的小牛血清白蛋白，佔緩衝液體系重量O. 6 I. 3%的氯化鈉，6. 8 8. 4mM的氯化鈣， 佔緩衝液體系重量O. 5%的NaN3，其餘為水，緩衝液體系的PH值為6. 0-8. O。
3.根據權利要求I或2所述的凝血酶原時間測定試劑盒，其特徵在於所述重組人組織因子在緩衝液體系中的用量為3000U/L，兔腦組織因子在緩衝液體系中的用量為9000U/L。
4.根據權利要求3所述的凝血酶原時間測定試劑盒，其特徵在於所述凝血活酶還包括兔腦磷脂O. 5-1. 5g/L。
5.製備上述任一權利要求所述凝血酶原時間測定試劑盒的方法，其特徵在於它包括如下步驟首先將重組人組織因子、兔腦組織因子和緩衝液體系採用不同的機型進行調試，調試所用的質控血漿為德靈INR標準血漿，通過此血漿測定出在在各種凝血分析儀上的ISI 值即分析靈敏度；其次，將在不同的機型上的ISI值為I的重組人組織因子、兔腦組織因子和緩衝液體系的配比固定並分裝，並分別真空冷凍乾燥，即配成為不同機型的凝血酶原時間測定試劑盒。
全文摘要
凝血酶原時間測定試劑盒，它由凝血活酶、緩衝液體系構成，凝血活酶為兔腦組織因子和重組人組織因子。緩衝液體系包括30-50mMTris-HCl；甘氨酸3～10％；小牛血清白蛋白1～5％；氯化鈉0.6～1.3％；氯化鈣6.8～8.4mM；NaN30.5％；緩衝液體系的pH值為6.0-8.0。所述凝血活酶還包括兔腦磷脂。它克服了不同儀器的方法差異使各類儀器的敏感度指數不一樣的缺點，本發明將高靈敏的人重組凝血活酶與低靈敏度的兔腦粉提取凝血活酶結合起來，通過一定的配比製備出能夠滿足不同方法學血凝儀的PT試劑，使其ISI值均能接近1.0。本發明還同時公開了凝血酶原時間測定試劑盒的製備方法。
文檔編號G01N33/86GK102608337SQ20121003258
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月14日 優先權日2011年4月22日
發明者劉介, 田樹偉, 魯翌 申請人:武漢塞力斯生物科技有限公司