肌紅蛋白檢測試劑盒的製作方法

2023-07-27 13:55:26 3

專利名稱：肌紅蛋白檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫學免疫學領域，涉及一種免疫檢測試劑，進一步地，本發明涉及一種肌紅蛋白檢測試劑盒。
背景技術：
肌紅蛋白(myoglobin，MB)是骨骼肌和心肌特異性氧結合蛋白，分子量為17. 8kD， 由於分子量較小，當心肌或骨骼肌損傷時，MB會從肌肉組織釋放到循環血中，並且能經腎小球濾過，出現在尿中。因此血液和尿中MB測定可用於某些肌病和心臟病的診斷，如急性心肌梗死(AMI)、急性肌損傷、急慢性腎衰竭、嚴重充血性心力衰竭、長時間休克、肌營養不良、 肌萎縮和多發性肌炎等疾病。AMI是一種嚴重危及人類生命的疾病，目前AMI檢測的主要生化標誌物有肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDL)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌紅蛋白和心肌肌鈣蛋白I (cTnl)等，但CK-MB、LDL、cTnT、cTnl在診斷心肌梗死時的敏感性都不如MB高。MB在 AMI後2 4h內，血中濃度迅速升高，8 IOh後達到最高峰，研究表明MB陰性特別有助於排除AMI，可協助AMI早期診斷。由於MB在血液中的半衰期短，升高後Mh內即恢復至正常水平，因此可作為觀察有無再梗死及梗死有無擴展的指標。另外，MB還可作為AMI溶栓中評價再灌注與否的較敏感指標。現有的MB檢測方法主要有放射性免疫法、酶聯免疫法，化學發光法和酶聯螢光分析法。放射性免疫法使用放射性同位素，會造成環境汙染；酶聯免疫法測定周期長，不適合急診的快速檢測；化學發光法和酶聯螢光分析法價格昂貴，需要專門儀器和專業人員操作， 只適用於中心實驗室使用，不適合中小醫院尤其是沒有中心實驗室的鄉鎮醫院。而膠乳增強免疫比濁法操作簡單，經濟，無汙染，可以在絕大多數醫院的自動生化分析儀上使用，特別是對急診能實現快速定量檢測，其基本原理是將抗體包被在膠乳顆粒上，與相應抗原發生免疫反應後，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物所產生的濁度，即可測出標本中被檢物含量。而抗體包被到膠乳上，一般可採用物理吸附法和化學偶聯法，採用物理吸附法得到的致敏膠乳顆粒穩定性差，抗體容易從膠乳顆粒上脫落下來；而且用物理吸附法得到的膠乳，有可能受到類風溼性因子(RF)和嗜異性抗體的幹擾，從而導致檢測結果假陽性或假性升高。目前，採用的化學偶聯法多為隨機偶聯法，因隨機偶聯的抗體會隨機偶聯到膠乳生物不同部位，將導致抗體損失結合力，增加了抗體用量和生產成本；若將上述方法得到的致敏膠乳顆粒用於檢測試劑盒中，會造成特異性差、準確性低、抗幹擾能力弱或生產成本高的缺陷。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種檢測簡單而快速、靈敏度高、準確性好、抗幹擾能力強及生產成本低的肌紅蛋白檢測試劑盒。
為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為一種肌紅蛋白檢測試劑盒，所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑Rl為適當的緩衝液；所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒、置於適當的緩衝液中。所述的肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在R2中的濃度為0. 08% 0. (即 0. 08 0.沘克 /100ml)。本發明所述的緩衝液包括但不限於PBS緩衝液、Tris緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸-磷酸鹽緩衝液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液、2-嗎啉乙磺酸 (MES)緩衝液、氯化銨緩衝液以及其他具有相似性質的緩衝液中的一種或幾種。本發明上述試劑盒中Rl所用的緩衝液與配製R2所用的緩衝液只要為上面的緩衝液中的一種即可，可以為相同的緩衝液，可以為不同緩衝液。本發明上面所述的聚苯乙烯膠乳顆粒(該聚苯乙烯膠乳顆粒為市售常規產品)， 其平均粒徑在0. 01 1. 5μ m(10 1500nm)之間，粒徑小於0. 01 μ m時，膠乳顆粒聚集產生的光密度變化太小，結果很難達到試驗敏感度要求，在製備試劑的時候，需要花費過多的離心時間，延長了試劑生產的時間，增加了試劑成本且不利於重複性。而粒徑大於1.5μπι 的膠乳顆粒在測量高濃度檢測物時，其聚集產生的光密度變化超過了檢測限，結果很難獲得對應於分析物濃度的光密度變化，而且顆粒太大會加速自聚集，導致分散性降低。膠乳顆粒粒徑隨著試驗方法和設備的改變而改變。所選擇的顆粒粒徑最好是介於0. 05 0. 5μπι(50 500nm)之間。本發明上面所述的抗體包括但不限於多克隆抗體及單克隆抗體。在本發明所述的MB檢測試劑盒中，還包含MB校準。本發明所述的試劑R2是用MB抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置於適當的緩衝液中組成，該試劑R2的製備步驟包括(1)膠乳顆粒的激活在帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒(膠乳)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺(EDAC)，混合反應後加入己二酸二醯胼，繼續混合反應，得到激活的膠乳顆粒；(2)抗體的氧化用高碘酸鈉將抗體非結合活性區域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗體與膠乳顆粒的偶聯將步驟⑴激活的膠乳顆粒和步驟⑵氧化的抗體混合反應，待反應結束後，再加入葡萄糖封閉膠乳微球上未反應的基團，得到偶聯抗體的膠乳微球即肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置於適量的緩衝液中。上述步驟(3)中肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在試劑R2中的濃度為 0. 08 0. 28%即 0. 08 U8 克 /100ml。本發明上述製備方法各個步驟中物料配比為步驟(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺膠乳(原料)=0.5 5 100(重量比)；己二酸二醯胼膠乳=50 250 100(重量比)；步驟O)中高碘酸鈉步驟(1)中的膠乳(原料)=0.5 3 100(重量比)； 高碘酸鈉和抗體的用量比=1 15 10 (重量比)步驟(3)中抗體(氧化後抗體)激活的膠乳顆粒=2 22 100 (重量比)，葡萄糖激活的膠乳顆粒=(25 50) 100(重量比)。本發明所述試劑盒所採用的檢測原理為膠乳增強免疫透射比濁法，其原理是包被
4MB抗體的膠乳顆粒，與標本中MB發生免疫反應後，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物形成所產生的濁度，即可測出標本中MB的含量。本發明的優點和有益效果1.本發明的試劑盒具有檢測簡單而快速、靈敏度高、準確性好、抗幹擾能力強及生產成本低的優點。2.本發明採用的MB檢測方法為膠乳增強免疫比濁法，該方法使得MB的檢測更為經濟、方便和快速，適用於絕大多數醫院的自動生化分析儀，特別是對急診能實現快速定量檢測。3.本發明試劑盒中的試劑R2的製備是採用一種抗原抗體反應試驗方法，特別之處在於，本發明採用定向化學偶聯法將MB抗體包被到膠乳顆粒上；本發明將抗體的非結合活性區域的Fc端定向偶聯到膠乳顆粒上，不易受到類風溼性因子(RF)和嗜異性抗體的幹擾，大大提升了檢測結果的準確性和可信性。而且該方法不會發生抗體結合力損失的情況， 可大大減少抗體用量，降低了生產成本。
具體實施例方式下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限於以下實施例。實施例1MB檢測試劑盒的製備本發明的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下1 · MB抗體多克隆抗體(市售)。2.膠乳本發明僅示例性的採用直徑為150 250nm帶羧基基團的聚苯乙烯膠乳顆粒(市售)進行實驗。本實施例的主要試劑的配製如下試劑Rl 含1. 5% PEG6000(聚乙二醇6000)、95mmol/LNaCl的甘氨酸緩衝液，該試劑為無色透明溶液。試劑R2 用抗人MB抗體致敏粒徑為200nm的聚苯乙烯膠乳顆粒。該試劑為乳白色溶液。具體步驟如下1.取 Iml (100mg/ml)膠乳，用 0. lM(mol/L)，ρΗ5· O 的 MES 溶液(2-嗎啉乙磺酸緩衝液)洗滌3次，超聲分散；2.然後加入0. 22ml用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液新鮮配製的EDAC(配製的溶液中 EDAC的濃度為10mg/ml)混合完全，室溫混和15min ；3.再加入0. 88ml用0. 1M，pH5. O的MES溶液新鮮配製的己二酸二醯胼(配製的溶液中己二酸二醯胼的濃度為83mg/ml)，4°C反應過夜；4.然後用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液洗滌2次，0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸鹽溶液洗滌1次，
超聲分散備用；5.取2ml抗體(2mg/ml)溶液，加入0. 3ml用0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸鹽溶液配製的高碘酸鈉溶液(10mg/ml)，室溫混合15min，6.將步驟5中氧化好的抗體加入到步驟4中已激活的膠乳溶液中，4°C反應過夜；7.然後加入0. 32ml 10% BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4°C混合4h ；8.再加入0.鈿1 10%葡萄糖溶液，4°C混合過夜；
9.然後用0. 15M，pH7. 5的甘氨酸溶液洗滌3次，再加入0. 15M，pH7. 5的甘氨酸溶液(含BSA,0. 2% NaN3的甘氨酸緩衝液)至膠乳(結合抗體以後的膠乳重量)終濃度 % 0. 18% (質量體積比即0. 18克/100ml)。肌紅蛋白校準品在緩衝溶液中加入不同含量肌紅蛋白，除菌過濾，所述的肌紅蛋白校準品中肌紅蛋白含量控制在O 700ug/L之間，這些校準品均為無色透明液體。實施例2 MB的測定檢測工具日立7060型自動分析儀。分析方法兩點終點法；主波長:570nm,副波長:800nm 樣品量:6ul (微升)；Rl 200ul ；R2 :50ul ；反應方向上升；測定溫度37°C ；樣品與Rl混勻後，於第10秒讀取吸光度A1 ；於3 5min時加入R2，於5min後讀取吸光度A2。反應吸光度的計算為A2與A1的差值。計算方法多點定標，根據吸光度與參考血清的值作劑量/響應曲線，樣品含量可根據其吸光度值在劑量/響應曲線上算出。實施例3 MB檢測試劑盒性能評價1.分析靈敏度評估採用5%牛血清白蛋白溶液作為空白樣本，空白樣本應不含被測物。在生化分析儀上連續檢測20次，計算20次結果的均值與標準差SD。以空白均值加兩倍標準差(+2SD) 作為報告方法的檢測限。從表1可見，靈敏度為1. 59ug/L。表 權利要求
1.一種肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑Rl為適當的緩衝液；所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒、置於適當的緩衝液中組成。
2.根據權利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在試劑R2中的濃度為0. 08 0. 28g/100mlo
3.根據權利要求1或2所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒所採用的檢測原理為膠乳增強免疫透射比濁法。
4.根據權利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的緩衝液包括PBS 緩衝液、Tris緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸-磷酸鹽緩衝液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液、2-嗎啉乙磺酸緩衝液、氯化銨緩衝液以及其他具有相似性質的緩衝液中的一種或幾種。
5.根據權利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 01 1. 5 μ m。
6.根據權利要求5所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 05 0. 5 μ m。
7.根據權利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒中還包含肌紅蛋白校準品。
8.根據權利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置於適當的緩衝液中組成，該試劑R2的製備步驟包括(1)膠乳顆粒的激活在帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒即膠乳中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，混合反應後加入己二酸二醯胼，繼續混合反應，得到激活的膠乳顆粒；(2)抗體的氧化用高碘酸鈉將抗體非結合活性區域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗體與膠乳顆粒的偶聯將步驟(1)激活的膠乳顆粒和步驟( 氧化的抗體混合反應，待反應結束後，再加入葡萄糖封閉膠乳微球上未反應的基團，得到偶聯抗體的膠乳微球，置於適量的緩衝液中。
9.根據權利要求8所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於步驟(1)中所述的乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺膠乳的重量比=0.5 5 100，己二酸二醯胼膠乳的重量比=50 250 100 ；步驟⑵中所述的高碘酸鈉步驟(1)中膠乳的重量比=0. 5 3 100，高碘酸鈉抗體的重量比=1 15 10 ；步驟(3)中抗體激活的膠乳顆粒的重量比=2 22 100，葡萄糖激活的膠乳顆粒的重量比=25 50 100。
全文摘要
本發明公開一種肌紅蛋白檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑R1為適當的緩衝液；所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒、置於適當的緩衝液中組成。本發明具有檢測簡單而快速、靈敏度高、準確性好、抗幹擾能力強及生產成本低的優點。
文檔編號G01N33/68GK102565419SQ201110439589
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者夏佳音, 鄒炳德, 鄒繼華 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司