一種生長藏紅花無菌苗的方法
2023-07-27 11:24:11 1
專利名稱：一種生長藏紅花無菌苗的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種應用稀土元素促進藏紅花愈傷組織分化生長無菌的小植株的方法。
背景技術：
藏紅花為鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬多年生草本植物，又名番紅花、西紅花。原產於西班牙、希臘南歐各國以及伊朗等地，經印度傳入我國西藏，目前在我國的浙江、江蘇、山東、北京等地都有栽培(成都中醫學院，中藥學鑑定，1977，271-273；江蘇中醫學院編，中藥大詞典(下冊)19772671)。一方面，藏紅花(saffron，Crocussativus L.)在傳統和現代醫藥上具有很高的藥用價值，研究表明藏紅花可以用於鎮靜、祛痰、刺激、解痙，還可用於胃痛、春藥、調經，以及用於治療痢疾、麻疹、發熱黃疸、肝脾腫大、泌尿道感染、糖尿病，作冒險作流產藥等，在歐洲和亞洲還廣泛使用藏紅花作為婦科良藥。另一方面，藏紅花作為一種珍貴調味劑、香料和染料在歐洲的應用已經有幾百年的悠久歷史(Warburg E F，Endeavour，1957，16，209)，另外藏紅花可用於開發功能性食品、天然色素、保健性化裝品等；還可以把藏紅花作為觀賞植物栽培。更為有意義的是近幾年來，科學家發現藏紅花柱頭中的一些化學物質，如藏紅花素可以從分子水平抑制原癌基因的啟動以及癌細胞DNA和RNA合成，因而藏紅花已成為新型抗癌藥物的研究熱點(Escribano，Cancer Letter，1996，100，1913-1918；Wang C J等，Molecular Carcinogenesis，1996，17，235-240)。
我國儘管擁有豐富的藥用植物資源，但是隨著人類和社會對植物藥的需求與日俱增，藥用植物資源面臨著巨大壓力。一些中藥材資源逐年萎縮，成為稀有瀕危植物，從而影響到中醫臨床用藥及製藥企業的生產。藥用藏紅花的資源就極其有限，我國歷來都是進口供藥用，生產1公斤的藏紅花需要150000～200000朵花，還要經過400個小時以上的人工勞動，致使藏紅花的價格極其昂貴，每公斤達到2000美圓左右(PlessnerD，E.BI等，1989，Israel J Botany，38，1-7)，一直被譽為「植物黃金」。由於種源少、適宜栽培的地區有限、條件苛刻等因素，進行引種栽培僅可以提供少量商品；另外，傳統的藏紅花栽培生產容易發生萎蔫，感染病原微生物，繼而腐爛，造成產量和質量的下降；同時我國藏紅花有性不孕，栽培條件下不能結實，靠球莖繁殖，在栽培過程中球莖越種越小，小球莖開花少而且花小，甚至不開花，從而失去藥用價值，因此若單用傳統的球莖繁殖方法，繁殖速度慢，因此不能滿足市場的需求，出現了供不應求的局面。
通過植物組織和細胞培養來生產次生代謝產物是解決這一問題的一個較好的方法，目前已有報導，通過植物細胞工程的途徑使得紫草、人參根、青蒿、毛地黃等瀕危中草藥植物達到中試和工業化規模(Curtin M E，Biotechnology，1983，1，649-657)。
同樣，國內外的研究者也試圖通過植物細胞工程的各種途徑來解決藏紅花資源短缺的問題，如以藏紅花的芽誘導的愈傷組織接種到添加植物激素6-BA和NAA的MS植物培養基上，可以獲得胚性愈傷組織；胚性愈傷組織在添加植物激素GA的培養基上分化成體胚；將體胚轉移到添加植物激素6-BA，NAA和活性炭的植物培養基上，可以生成無菌苗(Ahuja A等，Indian journal of experiment biology，1994，32，135-140)。但是此方法的愈傷組織產生胚性愈傷組織，形成無菌苗的產生時間長，需要11～15個星期，而且數量少，所以仍不能滿足市場需求。
稀土元素一般是指元素周期表中的鑭系元素和與鑭系元素化學性質相似的鈧、釔等元素的總稱。我國是世界上稀土資源最豐富的國家，約佔世界總儲量的80％，為了充分利用這一資源，我國的科技工作者從1972年起開始稀土農用的研究，並確認稀土元素是植物生長和發育的有益元素。目前稀土元素已經應用於幾十種農作物，並在一些中草藥的種植中得到應用。應用的實踐表明稀土元素能夠對人參、枸杞、杜仲等中草藥有增產、抗病等作用，並能夠提高中草藥有效成分的含量和降低中草藥的殘留農藥(陳浩等，廣東微量元素科學，2001，8(3)，1)。稀土元素對於體外培養動物細胞的研究較為廣泛，稀土元素對於植物細胞的培養的研究報導也逐年增加。這些研究報導表明稀土元素對植物細胞的生長和次生代謝產物的積累有一定的促進作用，如低濃度的Eu3+促進大黃愈傷組織的生長(魯科寬等，北京醫科大學學報，1997，29，289)，La對紅豆杉細胞的生長及紫杉醇的合成有一定的促進作用(元英進等，中國稀土學報，1998，16，56)，稀土元素可以部分或全部代替外源激素對雪蓮細胞生長和黃酮類合成合成的促進作用(Xiaofan Yuan et al，Biotechnology Letters，2002，24，1889)。
發明內容
本發明的目的在於克服已有技術的形成藏紅花無菌苗的產生時間長，而且數量少的缺陷，從而提供一種應用稀土元素促進藏紅花愈傷組織分化生長無菌苗的方法。該方法通過利用稀土元素的植物激素、消除自由基、促進細胞分化等作用，以促進藏紅花愈傷組織分化形成無菌的小植株，從而從根本上解決藏紅花種源短缺並容易感染病原菌的問題。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一種形成藏紅花無菌苗的方法，包括如下步驟1)將藏紅花的愈傷組織接種到含0.005～0.07mM的稀土元素的常規植物細胞培養基上，並添加0.5～10.0mg/g的細胞分裂素和0.5～8mg/g的細胞生長素，於15～30℃下培養15～20天；2)將步驟1)培養的愈傷組織接種到含0.005～0.07mM稀土元素的常規植物細胞培養基，並添加1～10.0mg/g的細胞分裂素和0.05～3mg/g的細胞生長素，於15～30℃下培養25～30天，得到藏紅花的體胚或胚性愈傷組織；3)將步驟2)培養的體胚或胚性愈傷組織接種到含0.005～0.02mM稀土元素的1/2常規植物細胞培養基(即所有培養基成分的含量都為1/2)，於15～30℃下培養35～50天，得到藏紅花無菌苗。
所述步驟1)的藏紅花的愈傷組織為藏紅花的球莖、芽、葉子或花以常規方法處理形成的藏紅花的愈傷組織。
所述步驟1)的稀土元素為Nd、La或Ce，或La2O3、CeO2、Pr6O111Sm2O3組成的混合稀土元素，各組分的摩爾比為La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝100～355∶10～275∶1～30∶1～40。
所述步驟2)的稀土元素為Ce，或La2O3、CeO2、Pr6O11和Sm2O3組成的混合稀土元素，各組分的摩爾比為La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝100～355∶10～275∶1～30∶1～40。
所述步驟3)的稀土元素為La，或La2O3、CeO2、Pr6O11和Sm2O3組成的混合稀土元素，各組分的摩爾比為La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝100～355∶10～275∶1～30∶1～40。
所述步驟1)和步驟2)的細胞分裂素為6-苄氨基嘌呤(以下簡稱6-BA)或激動素(以下簡稱Ki)。
所述步驟1)和步驟2)的細胞生長素為2，4-二氯苯氧乙酸(以下簡稱2，4-D)或萘乙酸(以下簡稱NAA)。
所述步驟1)、步驟2)和步驟3)的常規植物細胞培養基為MS培養基、B5培養基或N6培養基。其中，MS培養基是含鹽量較大的培養基，含有高濃度的硝酸鹽、鉀離子和銨離子，微量元素的種類較全，其組分可參見Murashige T，Skoog，FA，1962，Physiol.Plant 15473-479所述。B5培養基是含硝酸鉀較高的培養基，含鹽量也較高，其組分可參見Gamborg OL，Miller RA，Ojima K 1968，Exp.Cell Res.50151-158所述。N6培養基的組分可參見Nitsch JP，Nitsch C，1969，，Science 16385-87所述。
使用本發明提供的方法的優益之處在於該方法通過利用稀土元素的植物激素、消除自由基、促進細胞分化等作用，促進藏紅花愈傷組織分化生長無菌的小植株，可以在較短時間內獲得較大量的藏紅花，從而從根本上解決藏紅花種源短缺並容易感染病原菌的問題。
具體實施方案實施例1、用自來水洗淨藏紅花球莖表面的泥土，去掉皮膜，若有病斑用解剖刀去掉病斑，再用蒸餾水衝洗2次，經濾紙吸乾，用70wt％酒精浸泡30秒鐘，使用含有2wt％活性氯的次氯酸鈉溶液消毒15分鐘，再用無菌水洗滌5次，最後用無菌濾紙吸乾球莖表面的水分，用解剖刀將洗滌好的球莖切成約1平方釐米的小塊，分別接種於含0.25mg/g 2，4-D和2.0mg/g 6-BA植物激素的MS植物培養基上，放置於21±0.3℃人工氣候箱或27±1℃的培養室內培養14天，可以獲得藏紅花的球莖愈傷組織。
將獲得的球莖愈傷組織接種到含0.007mM La，0.005mM Ce的B5植物細胞培養基上，並添加植物激素2mg/g 2，4-D(即2，4-二氯苯氧乙酸)和0.05mg/g 6-BA(即6-苄氨基嘌呤)，於21℃培養15天；轉接到含0.05mM La，0.05mM Ce 0.05mg/g NAA(即萘乙酸)和2mg/g 6-BA的B5植物細胞培養基上，於21℃培養35天；最後轉接到含0.008mM La的1/2MS植物細胞培養基上，於21℃培養40天，得到藏紅花無菌苗，其數量為每培養瓶29株。
而同樣條件下，只是不加稀土元素作為對照組，得到藏紅花無菌苗的數量為每培養瓶11株。可以看出，使用本發明方法培養藏紅花無菌苗的數量提高164％。
實施例2、將實施例1中誘導的球莖形成的愈傷組織接種到含0.006mM La，0.005mM Ce，2mg/g 2，4-D和0.5mg/g 6-BA的MS培養基上，於15℃培養15天；
轉接到含0.005mM La，0.01mM Ce，0.5mg/g NAA和3mg/g 6-BA的B5培養基上，於15℃培養35天；最後轉接到含0.005mM La的1/2MS培養基上，於15℃培養40天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高200-250％。
實施例3、按實施例1的方法誘導藏紅花的芽形成愈傷組織。
將藏紅花芽形成的愈傷組織接種到含0.007mM La，3mg/g 2，4-D和0.5mg/g 6-BA的MS培養基上，於30℃培養12天；轉接到含0.01mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝255∶175∶3∶1)，0.05mg/g NAA和2.5mg/g 6-BA的MS培養基上，於30℃培養35天；最後轉接到含0.005mM La的1/2MS培養基上，於30℃培養40天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高350-450％。
實施例4、按實施例1的方法誘導藏紅花的花形成愈傷組織。
將藏紅花的花形成的愈傷組織接種到含0.07mM La，2.5mg/g 2，4-D和1mg/g 6-BA的MS培養基上，於22℃培養15天；轉接到含0.07mM La，0.07mM Ce，0.5mg/g NAA和2mg/g 6-BA的B5培養基上，於22℃培養35天；最後轉接到含0.07mM La的1/2MS培養基上，於15～30℃培養40天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高100-150％。
實施例5、按實施例1的方法誘導藏紅花的葉子形成愈傷組織。
將藏紅花葉子形成的愈傷組織接種到含0.005mM La，0.005mM Ce，2mg/g 2，4-D和0.05mg/g 6-BA的培養基上，於25℃培養15天；轉接到含0.005mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝255∶175∶3∶1)，0.5mg/g NAA和3.5mg/g KT(即激動素)的MS培養基上，於25℃培養45天；
最後轉接到含0.005mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝255∶175∶3∶1)的1/2MS培養基上，於15～30℃培養40天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高400-450％。
實施例6、按實施例1的方法誘導藏紅花的葉子形成愈傷組織。
將藏紅花葉子形成的愈傷組織接種到含0.05mM La，1mg/g 2，4-D和0.5mg/g 6-BA的培養基上，於26℃培養15天；轉接到含0.06mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝255∶175∶3∶10)，1.0mg/g NAA和4mg/g 6-BA的MS培養基上，於28℃培養25天；最後轉接到含0.005mmol La的1/2MS培養基上，於25℃培養35天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高280-300％。
實施例7、按實施例1的方法誘導藏紅花的葉子形成愈傷組織。
將藏紅花葉子形成的愈傷組織接種到含0.07mM La，3mg/g 2，4-D和0.5mg/g 6-BA的培養基上，於21℃培養25天；轉接到含0.07mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝255∶275∶3∶10)，1.0mg/g NAA和4mg/g 6-BA的MS培養基上，於21℃培養35天；最後轉接到含0.005mmol La的1/2MS培養基上，於21℃培養50天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高35-40％。
實施例8、按實施例1的方法誘導藏紅花的葉子形成愈傷組織。
將藏紅花葉子形成的愈傷組織接種到含0.07mM La，0.5mg/g 2，4-D和0.5mg/g6-BA的培養基上，於21℃培養25天；轉接到含0.07mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝255∶275∶3∶10)，0.05mg/g NAA和1mg/g 6-BA的MS培養基上，於21℃培養35天；
最後轉接到含0.005mmol La的1/2MS培養基上，於21℃培養50天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高38-40％。
實施例9、按實施例1的方法誘導藏紅花的球莖形成愈傷組織。
將藏紅花葉子形成的愈傷組織接種到含0.06mM La，8mg/g 2，4-D和10mg/g 6-BA的培養基上，於21℃培養21天；轉接到含0.04mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝255∶275∶3∶10)，3mg/g NAA和10mg/g 6-BA的MS培養基上，於21℃培養35天；最後轉接到含0.005mmol La的1/2MS培養基上，於21℃培養50天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高35-40％。
實施例10、按實施例1的方法誘導藏紅花的葉子形成愈傷組織。
將藏紅花葉子形成的愈傷組織接種到含0.07mM La，3mg/g 2，4-D和0.5mg/g 6-BA的培養基上，於21℃培養25天；轉接到含0.07mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝355∶275∶30∶40)，1.0mg/g NAA和4mg/g 6-BA的MS培養基上，於21℃培養35天；最後轉接到含0.005mmol La的1/2MS培養基上，於21℃培養50天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高60-80％。
實施例11、按實施例1的方法誘導藏紅花的花形成愈傷組織。
將藏紅花葉子形成的愈傷組織接種到含0.04mM La，3mg/g 2，4-D和0.5mg/g 6-BA的培養基上，於21℃培養25天；轉接到含0.05mM混合稀土元素(其組成與摩爾比為是La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝100∶10∶1∶1)，2.0mg/g NAA和4mg/g 6-BA的MS培養基上，於21℃培養35天；最後轉接到含0.006mmol La的1/2MS培養基上，於21℃培養50天，得到的藏紅花無菌苗的數量比同樣條件下、不加稀土元素的對照組提高80-100％。
權利要求
1.一種生長藏紅花無菌苗的方法，包括如下步驟1)將藏紅花的愈傷組織接種到含0.005～0.07mM的稀土元素的常規植物細胞培養基上，並添加0.5～10.0mg/g的細胞分裂素和0.5～8mg/g的細胞生長素，於15～30℃下培養15～20天；2)將步驟1)培養的愈傷組織接種到含0.005～0.07mM稀土元素的常規植物細胞培養基，並添加1～10.0mg/g的細胞分裂素和0.05～3mg/g的細胞生長素，於15～30℃下培養25～30天，得到藏紅花的體胚或胚性愈傷組織；3)將步驟2)培養的體胚或胚性愈傷組織接種到含0.005～0.02mM稀土元素的1/2常規植物細胞培養基，於15～30℃下培養35～50天，得到藏紅花無菌苗。
2.如權利要求1所述的生長藏紅花無菌苗的方法，其特徵在於，所述步驟1)的藏紅花的愈傷組織為藏紅花的球莖、芽、葉子或花以常規方法處理形成的藏紅花的愈傷組織。
3.如權利要求1所述的生長藏紅花無菌苗的方法，其特徵在於，所述步驟1)的稀土元素為Nd、La或Ce，或La2O3、CeO2、Pr6O11和Sm2O3組成的混合稀土元素，各組分的摩爾比為La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝100～355∶10～275∶1～30∶1～40。
4.如權利要求1所述的生長藏紅花無菌苗的方法，其特徵在於，所述步驟2)的稀土元素為Ce，或La2O3、CeO2、Pr6O11和Sm2O3組成的混合稀土元素，各組分的摩爾比為La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝100～355∶10～275∶1～30∶1～40。
5.如權利要求1所述的生長藏紅花無菌苗的方法，其特徵在於，所述步驟3)的稀土元素為La，或La2O3、CeO2、Pr6O11和Sm2O3組成的混合稀土元素，各組分的摩爾比為La2O3∶CeO2∶Pr6O11∶Sm2O3＝100～355∶10～275∶1～30∶1～40。
6.如權利要求1所述的生長藏紅花無菌苗的方法，其特徵在於，所述步驟1)和步驟2)的細胞分裂素為6-苄氨基嘌呤或激動素。
7.如權利要求1所述的生長藏紅花無菌苗的方法，其特徵在於，所述步驟1)和步驟2)的細胞生長素為2，4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸。
8.如權利要求1所述的生長藏紅花無菌苗的方法，其特徵在於，所述步驟1)、步驟2)和步驟3)的常規植物細胞培養基為MS培養基、B5培養基或N6培養基。
全文摘要
本發明涉及一種生長藏紅花無菌苗的方法。該方法利用稀土元素對藏紅花細胞生長和分化的影響，將藏紅花的愈傷組織接種到含有稀土元素、細胞分裂素和細胞生長素的植物細胞培養基上培養；將得到的愈傷組織再一次接種到含有稀土元素、細胞分裂素和細胞生長素的植物細胞培養基上培養，得到藏紅花的體胚或胚性愈傷組織；最後將體胚或胚性愈傷組織再一次接種到含有稀土元素的植物細胞培養基上培養，得到藏紅花無菌苗。本方法可在較短的時間內促進藏紅花細胞形成胚性愈傷組織和體胚，並分化成大量的無菌苗，解決了藏紅花種植過程中種源少，易感染病原菌的問題，從而達到解決藏紅花資源短缺的問題。
文檔編號A01H4/00GK1565172SQ03142559
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月11日 優先權日2003年6月11日
發明者王玉春, 陳書安, 趙兵, 王曉東 申請人:中國科學院過程工程研究所