一種辣椒dn突變體在菸草抗青枯病基因工程中的應用的製作方法
2023-07-16 06:58:36
專利名稱：一種辣椒dn突變體在菸草抗青枯病基因工程中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種辣椒DN-CaROPl突變體及其超表達載體的構建及其在基因工程中的應用，更具體地涉及到了該辣椒基因在茄科植物菸草抗青枯病基因工程中的應用，屬於植物基因工程技術領域。
背景技術：
植物生長、發育和對環境應答是其特定的遺傳系統和所處的環境條件相互作用下通過複雜的生理生化過程實現的，總是受到較為嚴密的調控以使其產生足夠的光合產物併合理的分配和使用這些光合產物，最終使植物在特定的環境下獲得最大的生存和傳衍的機會。由鈣信使系統、植物內源激素、磷酸激酶系統、轉錄因子等組成的信號傳導是植物生長、 發育和適應環境調控的重要環節，植物細胞可感知外界環境各種信息並進行信號的整合、 傳遞，最終將信號傳遞進入細胞核調節相關基因的表達，使植物產生有利於其生存和傳衍的生理生化反應。辣椒(Capsicum annuum L.)是典型的茄科植物，也是具有重要經濟價值的蔬菜。 辣椒的生產長期受到病害及其它各種逆境的困擾，對農藥和化肥等的過分依賴導致的環境、健康方面的隱患促使人們從遺傳改良上或從栽培管理上採取更加可持續的、切實可行的對策，需要從分子水平上對辣椒等茄科植物的抗逆分子機製作更深入的剖析和了解。從應答逆境的信號傳遞入手是剖析辣椒抗逆分子機制的重要途徑，因此，辣椒抗逆信號傳遞分子機制研究已經引起了人們的高度重視，並在膜定位相關受體蛋白(An et al.,2008), 鈣信使相關蛋白(Oioi et al. , 2009)、激酶(Chung et al.，2004)、轉錄因子(Lee at al.)等多個信號傳遞聯結開展了大量的研究，但人們的對辣椒抗逆及其與生長發育之間的關係及其分子機制的認識還相當有限。鑑於ROP位於調控植物生長發育和抗逆信號傳遞途徑的上遊，在植物生長發育及對環境逆境脅迫應答中發揮重要調節作用，從辣椒的ROP分離和功能鑑定入手可能是揭示辣椒等茄科植物抗逆分子機制的重要契入點。自在植物體內發現ROP以來，已有越來越多研究發現ROP在植物體內多種信號途徑中起關鍵作用，每一成員可能作用於不同的途徑，幾種不同的途徑可能融合於同一個ROP (Jones et al.，2005 ；Yalovsky et al.，2008)，同時在植物中也存在ROP的功能冗餘，導致缺少某一種ROP時很少有明顯的表型變化，所以在研究ROP時很少只單獨採用基因功能敲除法進行研究。研究ROP功能的重要手段之一就是構建DN (dominant negative)和 CA (constitutive active)突變體，前者是使ROP鎖定在⑶P結合態形成失活型突變體， 後者是將ROP鎖定於GTP束縛態形成激活型突變體(Kost et al.，1999 ；Li et al.，1999 ； Lemichez et al. , 2001 ；Li et al.，2001)，這種突變體蛋白的表達打亂了內源ROP蛋白的激活態和失活態之間的平衡，有助於ROP蛋白的功能分析(Yang，2002)。目前尚未有利用DN 突變體研究植物抗青枯病的文獻報導。
發明內容
本發現提供了一種辣椒DN突變體在菸草抗青枯病基因工程中的應用，將大力促進菸草抗青枯病基因工程的發展與應用。本發明的辣椒DN突變體為DN-CaROPl突變體，該突變體基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。構建方法如下
將辣椒DN-CaROPl突變體與CaMV35S啟動子核心序列融合，構建成DN-CaROPl的超表達載體。所述的CaMV35S啟動子核心序列為
CGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。所述辣椒 DN-CaROP 1 是從UV-B輻射辣椒葉片的cDNA文庫中分離獲得的CaROPl基因的DN突變體。構建的超表達載體在茄科植物菸草抗青枯病基因工程中的應用。將所述超表達載體轉化EHA105農桿菌，採用葉盤遺傳轉化法侵染菸草得到轉基因菸草，可提高轉基因菸草對辣椒青枯病病原菌的侵染的抗性。本發明的顯著優點
本發明的辣椒DN-CaROPl突變體在菸草中的超表達與野生型菸草相比顯著提高轉基因菸草的抗青枯病能力，該突變體在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應用價值。
圖1為CaROPl中的保守功能域；
圖2為CaROPl與其它ROP家族成員的系統發育樹； 圖3為CaROPl定點突變圖； 圖4為入門載體pD0NR207 ； 圖5為超表達載體PK7WG2 ；
圖6為DN-CaROPl轉基因植株與野生型植株對青枯菌抗性的比較。
具體實施例方式1載體構建過程 1. 1材料
辣椒品種為江西省蓮花縣的地方辣椒品種120#，由福建農林大學生命科學學院實驗室保存；烤菸品種品種由福建農林大學病毒所惠贈；UV -B處理的辣椒葉片的cDNA文庫(UV-B紫外線處理將植株置於離紫外燈(UV — B)下25cm處分別照射2h、6h、12h、Mh 和48h，所有不同處理時間段處理的植物用液氮進行速凍處理後放入一 80°C冰箱保存)為福建農林大學生命科學學院實驗室構建(根據^vitrogen公司試劑盒上的說明操作)，滴度高達 IX IO7; CloneMiner cDNA Library Construction Kit 和 Gateway 載體構建試劑盒均購自美國^vitrogen公司。B型質粒小量快速提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，PCR相關dNTP、Taq酶、PCR buffer購自大連TaKaRa公司產品，反轉錄及 Real-Time PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。慶大黴素、卡那黴素、利福平、羧卞青黴素等為Sigma公司產品。其它化學試劑均為國產化學純。1.2 方法1. 2. 1辣椒CaROPl獲選基因的分離
首先以擬南芥ROP的胺基酸序列(NP_190698)作為探針序列，對GenBank中的辣椒EST資料庫進行同源性比較，對獲得的辣椒EST用DNAMAN進行重疊群分析並確定ROP保守域共有序列，根據共有序列，進行特異性引物設計與合成，引物序列為Pl 5，AGGCAACAACCTATTCAACAGCAG-3，；P2 :GTTCCAACAAGCACTATTGGGA
C-3』。然後採用基於PCR技術的96孔板法從cDNA文庫中篩選cDNA陽性克隆，測序結果表明，該cDNA陽性克隆的長度為1149 bp，含有1個長度為197個胺基酸的開放讀碼框 (SEQ. NO. 2 所示)(DQ257288)。Blastp搜索結果表明，該cDNA陽性克隆的推定胺基酸序列中含有所有保守的ROP 功能域(Li et al.，2001)，與其它植物中所鑑定的小G蛋白的同源性高達70%以上(圖1)， 將該cDNA陽性克隆暫命名為CaROPl。進一步序列分析發現CaROPl的C端與其擬南芥等其它植物中分離鑑定的ROP基因家族成員之間有比較大的多樣性。而以擬南芥ROP家族為參照的系統發育樹分析雖可將CaROPl歸為類IV組(Winge et al.,2000; Zheng ang Yang, 2000b; Christensen et al.，2003)，但在系統發育樹的分枝中CaROPl與同組的其它成員之間的距離明顯較遠(圖2)，這些區別意味著CaROPl在功能及其分子機制上既存在與其它同源基因相似之處，又可能具有自身特定的功能(Nibau et al.，2006)。1. 2. 2辣椒DN-CaROPl突變體的構建
為了排除功能冗餘給研究ROP功能帶來的影響，本發明構建了 CaROPl的DN(dominant negative)突變體。在構建突變體時，首先參考(Liet al.，1999; Valster et al. , 2000;Zheng and Yang, 2000)等的方法分別設計定點突變引物DN_F、DN-R,結合CaROPl基因內側特異引物 (見 1. 2. 1 引物序列 Pl 和 P2)進行 PCR 擴增(94°C，5 min;94°C，30s, 55°C，30s, 68°C，Imi n, 35cycles ； 68°C，7min)產生T20N位點突變的PCR產物(這裡的PCR產物即為DN突變體 DN-CaROPl )，T20N位點突變使ROP始終處於GDP結合態即得到DN突變體DN-CaROPl。定點突變引物序列如下
DN-F 5' -CAATAAACAATTCTTGCCAAC-3『 DN-R 5， -gttggcaagaAttgtttattg-3『 定點突變擴增方案如圖3。1. 2. 3辣椒DN-CaROPl基因超表達載體構建
本發明採用gateway技術(Walhout et al.，2000)，構建雙子葉植物轉基因用超表達載體。首先根據gateway載體構建技術設計併合成內側特異引物ROPF 5』- AAAA AGCAGGCTTTATGAGTGCTTCCAGGTT -3， ；ROPR 5』 -AGAAAGCTGGGTATCACAATATCGA GCAGGC-3， (第一輪)和外側接頭引物 aiiBl 5，-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T -3，； attm 5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT _3，(第二輪)。然後根據添加aiiB 接頭的兩輪PCR擴增程序，在DN-CaROPl基因兩側添加attB接頭，兩輪PCR擴增程序程序如下
第一輪為了充分得到添加^iB接頭的PCR產物，在50μ1 PCR反應體系中內側特異引物每種最多只能添加10 pmoles，擴增參數為I性火伸 ■變退延
2min 95° C 1 cycle 15 s 94° C 30s 55° C 1 min 68° C 10 cycles 第二輪轉移第一輪PCR產物10 μ 1至含有40pmoles aiiBl和aiiB2外側接頭引物的40ylPCR混合液中，連續使用先低溫度退火再高溫特異退火的兩套擴增參數為
預變性Imin 變性 15 s 退火 30 s 延伸 1 min
變性 15 s 退火 30 s 延伸 1 min
95° C 1 cycle 94° C 45° C
68° C 5 cycles
94° C 55° C
68° C 15-20 cycles 瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶質量並膠回收純化aiiB-PCR產物。然後通過BP反應體系將目的基因克隆到入門載體pD0NR207(見圖4)上形成入門克隆，PD0NR207-R0P,測序檢測目的基因序列無誤後，再通過LR反應體系將目的基因克隆轉移到超表達載體pk7WG2 (如圖幻，這樣也就將目的基因克隆於Ti質粒的CaMV35S 啟動子下遊，形成含目的基因的超表達載體，可實現其在轉基因植株內的超表達，最後參照分子克隆指南將含目的基因的超表達載體進一步轉化EHA105農桿菌，以備用於菸草遺傳轉化。BP反應體系
PCR products100 ng
Vector (pD0NR207)30-50 ng
5X Buffer1 μ 1
BP enzyme mix0. 3 μ 1
Add water to total5 μ 1
25°C溫浴過夜，反應結束後加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，將反應產物轉化DH5 α感受態細胞。LR反應體系
Entry clone50-100 ng
Destination vector100 ng
LR Enzyme mix0. 5 μ 1
Add water to total5 μ 1
25°C溫浴過夜，反應結束後加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，將反應產物轉化DH5a感受態細胞。菸草轉基因植株的獲得與抗性分析
2. 1菸草遺傳轉化及Tl代轉基因種子的收穫
採用葉盤遺傳轉化法(徐剛標等，2007 ；植物基因工程(第二版))，利用1.2.3中所構建的含目的基因的超表達載體的農桿菌，侵染2個月的無菌野生型菸草1(3 小苗的葉盤 (0. 5cmX0. 5cm)。在含卡那黴素(100 mg/L)的MS培養基上篩選抗性小苗，並對抗性小苗的基因組DNA進行PCR檢測，以確定卡那黴素篩選的可靠性。獲得一系列的轉基因株系，其中得到DN 36株。所有的DN株系均用套袋自交收穫Tl代轉基因種子。利用Tl代轉基因種子進行轉基因菸草表型分析與功能鑑定。2. 2 CaROPl參與調控植物病原菌防禦反應過程
本發明應用青枯病病原菌(取自福清地方辣椒青枯病菌，現保存於福建農林大學生命科學學院實驗室)對DN-CaROPl野生型對照進行辣椒青枯病病原菌活體接種，5_7d後發現 DN-CaROPl轉基因菸草突變體相對於野生型對照表現出對病原菌侵染的明顯抗性，在對照菸草接種部位產生較強的過敏反應壞死斑(圖6)，說明DN-CaROPl可顯著提高轉基因菸草對辣椒青枯病病原菌的侵染的抗性。結果
本發明發現DN-CaROPl可顯著提高轉基因菸草對辣椒青枯病病原菌的侵染的抗性，該基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應用價值。
權利要求
1.一種辣椒DN突變體，其特徵在於所述辣椒DN突變體為DN-CaROPl突變體，該突變體基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一種如權利1要求所述突變體的超表達載體的構建方法，其特徵在於將辣椒 DN-CaROPl突變體與CaMV35S啟動子核心序列融合，構建成DN-CaROPl的超表達載體。
3.一種含有權利要求1所述的突變體或由權利要求2或3所述的方法構建的超表達載體在茄科植物菸草抗青枯病基因工程中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種辣椒DN突變體在菸草抗青枯病基因工程中的應用，所述辣椒DN突變體為DN-CaROP1突變體，該突變體基因至少含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，構建方法是將辣椒DN-CaROP1突變體與CaMV35S啟動子核心序列融合，構建成DN-CaROP1的超表達載體。本發明的辣椒DN-CaROP1突變體在菸草中的超表達與野生型菸草相比顯著提高轉基因菸草的抗青枯病能力，該突變體在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應用價值。
文檔編號C12N15/82GK102154309SQ20101060936
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者何水林, 劉志欽, 劉林林, 官德義, 牟少亮, 蔡漢陽, 邱愛連, 陳彥生 申請人:福建農林大學