改性的中空纖維材料用於從優選血液和血漿的液體中除去由大腸桿菌產生的外毒素的用...的製作方法
2023-07-16 02:49:36
改性的中空纖維材料用於從優選血液和血漿的液體中除去由大腸桿菌產生的外毒素的用 ...的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於從包含蛋白質的液體(特別是血液或血漿)中體外除去由致病性大腸桿菌產生的外毒素的化學改性的中空纖維材料,及其用於治療患有疾病的患者的用途,所述疾病例如是由腸出血性大腸桿菌細菌(EHEC感染)或其它致病性大腸桿菌,例如腸毒性大腸桿菌(ETEC)或腸聚集性大腸桿菌(EAEC)引起的。
【專利說明】改性的中空纖維材料用於從優選血液和血漿的液體中除去由大腸桿菌產生的外毒素的用途及它們用於治療伴隨疾病的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於從包含蛋白質的液體(特別是血液或血漿)中體外除去由致病性大腸桿菌產生的外毒素的化學改性的中空纖維材料,以及用於治療罹患例如由腸出血性大腸桿菌細菌(EHEC感染)或其它致病性大腸桿菌如腸毒性大腸桿菌(ETEC)或腸聚集性大腸桿菌(EAEC)引起的疾病的患者的用途。
【背景技術】
[0002]大腸桿菌(STEC細菌)產生的志賀毒素(又名志賀樣或Vero毒素)在1977年已有描述(Konowalchuk 等人,Infect Immun, 1977,18:775-779),但是直到 1983 才將其與溶血性尿毒症症候群(HUS)聯繫起來(Karmali等人,Lancet, 1983,2:619-20)。從那時起,特別是對於兒童而言,已經證明了 STEC感染是急性腎衰竭的主要原因。直到現在還公認的是,HUS一旦形成,其治療仍是非常困難的(Thorpe CM,Food Safety CID.2004,38:1298-1303)。因此,研究工作主要集中在保護免受這些致病細菌的感染。
[0003]因為STEC是非聚集性菌,志賀毒素從腸到血流中的轉移似乎是形成這種疾病的前提條件。另外,脂多糖被認為是HUS發病機理中的另一個因素(Siegler等人,Am JNephrol, 2001,21:420-425 ;Safdar 等人,JAMA, 2002,288:996-1001 ;Dundas 等人,ClinInfect Dis,2001,33:923-931)。據估計感染STEC的患者中有5-10%發生了危及生命的疾病 HUS。
[0004]2011年初,在德國以及一些周邊國家,在沒有任何預警的情況下發生了一波EHEC感染。儘管有專家、健康組織(包括Robert-Koch機構)、專業臨床人員和醫生的共同努力,在治療這波感染時仍是明顯地無能為力,特別是對於HUS綜合症而言。正是這種以前基本上未知的和聚集性的EHEC細菌0104:H2使感染EHEC的3154名患者中的845名發生了溶血性尿毒症症候群(HUS) (Robert-Koch-機構數據),由此發展至從臨床和健康政治的觀點考慮都難以應對的處境。即使在專家之間進行的國際性經驗交換,其結論仍是到目前為止仍沒有科學的治療措施來可靠地對抗這種嚴重的疾病。由於在五月份的感染潮期間的無能為力,開支異常高漲,使醫院的預算以及總體保健成本緊張,特別是在相關的聚集區域中。目前,這種狀況仍可能在任何時候和任何地方再次出現。這種情況對於現代醫學科學來說是不能接受的,這使得有必要將所有的科研努力置於流行病學的領域,預防和最重要的是治療致病性大腸桿菌感染,尤其是EHEC感染。
[0005]Stxl-細菌(Stxl=志賀毒素I)代表了共同之處在於生產志賀毒素的異源生物群。因此,在HUS患者中,檢測和描述了多種STEC血清型。顯著聚集性的是變體0104:H4,正是這一變體導致了在中歐的多地發生了上述感染。現在,可以使用分子遺傳學方法(PCR)可靠地和相對快速地進行多種STEC變體的診斷。在兩種志賀毒素家族(Stxl和Stx2)之間進行了血清學區分,其中可以發現具有不同嚴重程度的毒素變體。EHEC菌株0154、026、0123、011和0145是常見的人類致病性變體,而0157:H7是第一個與胃腸疾病有關的菌株。志賀毒素由一個酶促A子單元和5個與膜結合的B子單元組成(AB5-蛋白質)。B子單元負責與它們的配體進行特異性結合,而A子單元移位到靶細胞中並在其酶活化時通過蛋白質合成抑制殺死細胞。對於志賀毒素來說,細胞表面上的受體是脂醯鞘氨醇三已糖苷(globotriaosylceramide, Gb3),其存在於大多數真核細胞上,特別是腸上皮細胞、上皮細胞和腎皮層細胞。志賀毒素的B子單元與Gb3受體的末端三糖結合。從細菌釋放出來的志賀毒素只有在破壞並滲透腸上皮之後進入血流,並通過粘附於白細胞而被運輸到優選腦和腎的內皮細胞(Thorpe CM, Food Safety CID.2004,38:1298-1303)。這些細胞具有特異性的STEC受體,這可以解釋在器官方面的某些特異性和併發症。在該疾病的初始狀態,總的來說,主要症狀是水性腹瀉,有時隨後發生血性腹瀉(在德國發生在25%患者中),並隨後發生以血液學改變、腎衰竭、癲癇發作伴隨腦水腫為特徵的HUS。
[0006]死亡率達到患者的10%。致病性STEC細菌主要通過人的食物鏈轉移(肉、蔬菜、黃瓜、豆芽菜、鮭魚)。而且很有可能在人類之間轉移。在治療這種特定的細菌傳染時,反而表現出抗生性,因為這導致患者血液中志賀毒素濃度增加(Safdar等人,JAMA,2002,288:996-1001 ;Dundas 等人,Clin Infect Dis, 2001, 33:923-931)。目前,治療的重點在於衛生措施,以避免細菌出現在人類食物鏈中。
[0007]使被感染的患者的腸中和更重要的是血液中的毒素負載降低的努力尚未表現出任何可證實的臨床結果(Thorpe等人,Food Safety CID.2004,38:1298-1303)。醫學方法還沒有通過動物試驗階段(豬、小鼠)。一期臨床試驗由於沒有什麼效果而被中止(Trachtman等人,JAMA2003,290:1337-1344)。
[0008]因此,直到今天,在醫學技術方面尚沒有可用的藥物、物質或措施具有針對人的志賀毒素疾病的發病機理的目標導向性治療和改善。對於例如下述來說,情況也是這樣:
[0009]a)用於口服給藥的合成毒素結合劑(Trachtman等人,JAMA, 2003,290:1337-1344 ;Watanabe 等人,J Infect Dis,2004,189:360-368)
[0010]b)通過特異性細胞表面蛋白質(Gb3-受體)與志賀毒素競爭的益生菌(Pinyon等人,J Infect Dis,2004,189:1547-1555),或
[0011]c)使用針對志賀毒素的單克隆抗體進行試驗(Mukherjee等人,Infect Immun,2002, 70:5896-5899 ;Sheoran 等人,Infect Immun, 2003, 71:3125-3130)?
[0012]所有已知的治療措施都是以希望受益於腸腔中的毒素結合的努力為基礎的。將來應該而且會繼續探索合適的方法。
[0013]此外,也可能有用的是關於與生產Stxl和Stx2的菌株競爭結合受體的細菌重組工程的方法(Pinyon等人,J Infect Dis,2004,189:1547-1555)。另外,使用針對志賀毒素的單克隆抗體或抗體混合物似乎也是有吸引力的並且是理論上有利的,因為這種方法適用於許多其它疾病。然而,從臨床的觀點考慮,針對致病性EHEC感染的理論上可能的所有治療措施到至今為止還沒有令人滿意。
[0014]關於致病性大腸桿菌感染(尤其是EHEC感染)的治療和另外的HUS的治療的目前已知知識的概述中,顯而易見的是,基於研究的醫學和臨床醫學仍沒有對抗這種威脅性傳染病的有效措施。在臨床水平上,通過血漿交換治療來應對這個問題的嘗試也不太可信。這是一種非選擇性的但卻不那麼有效的方法。除了計劃除去志賀毒素之外,還同時從患者提取了保護性和抗炎性的介質。這種血漿交換需要每名患者大約12升血漿的交換量,這需要大量的供體並且可能伴隨其它感染和變態反應的較高風險。此外,血漿交換治療涉及昂貴的治療費用。
【發明內容】
[0015]因此,本發明的目的在於提供可以避免目前的治療措施的缺點並通常能夠有效治療感染致病性大腸桿菌(尤其是EHEC)的患者的治療方法和相應的材料以及適當的裝置。這個問題的解決是利用了在EP1602387中描述的原本被開發用於在體外灌注系統中從患者的血液或血漿中除去細菌內毒素(脂多糖,LPS)和脂磷壁酸(lipoteichonic acids,LTA)的方法和相應的材料或裝置。
[0016]本發明涉及用於治療與腹瀉有關的腸疾病和(如果適用)與後遺症有關的物質,這種腸疾病是由產生外毒素的大腸桿菌弓I起的,所述物質包含化學改性的中空纖維材料,所述化學改性的中空纖維材料選自聚醯胺、聚碸、聚醚、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、及其衍生物和/或混合物,其中所述中空纖維材料經過改性而包含具有陰離子交換基團的觸鬚,其中所述陰離子交換基團包含合成的聚陽離子鏈、半合成的聚陽離子鏈和天然的聚陽離子鏈中的至少一種,其中所述合成的、半合成的和天然的聚陽離子鏈是直鏈或支鏈的。
[0017]本發明意外地發現,藉助這種物質和包含這種物質的裝置可以通過吸附而有效地從血液或血漿中除去志賀毒素,儘管細菌毒素LPS和LTA與志賀毒素在化學結構和生物化學功能方面都是不同的。LPS和LTA是用脂肪酸酯化的低聚糖/聚糖,它們屬於革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的膜的一部分。
[0018]然而,志賀毒素是革蘭氏陰性菌的酶促活性的胞內蛋白質(外毒素)。
[0019]感染致病性大腸桿菌的患者在感染腸毒性大腸桿菌的情況下可能經歷不同類型的腹瀉,所述腹瀉可以是兒童的水性的、輕度的、短暫的、自限性的、斷奶性的腹瀉,導致嚴重排便的腹瀉或旅行者腹瀉;在感染腸聚集性大腸桿菌的患者中發生了伴隨輕度發燒和很少的嘔吐至沒有嘔吐的水性的、粘液樣的、帶血的和分泌性的腹瀉疾病。在感染腸出血性大腸桿菌1-2天後,腹瀉變成血性腹瀉並伴隨腹痛,其可以持續4到10天,並且在一些情況下(5-10%),該疾病可能會進展到HUS。
【具體實施方式】
[0020]如本文中使用的,術語「外毒素」是指由任何致病性大腸桿菌菌株、優選ETEC、EAEC、最優選EHEC產生的任何外毒素。
[0021]優選將本發明的物質在裝置中提供,所述裝置布置為過濾器模塊的形式,最優選可用於血漿灌流/吸附性血漿分離置換系統。對要用於吸附性血漿分離置換法的裝置來說,尤其要滿足以下條件:
[0022]1.外毒素的清除應該是選擇性的和儘可能有效的。
[0023]2.所用的吸附劑的結合能力應該滿足最佳的實踐要求。
[0024]3.吸附劑必須能夠在性能沒有損失或改變的情況下通過熱或Y輻射滅菌。
[0025]4.吸附劑應該允許最大200ml/min的足夠高的流速。
[0026]5.清除方法必須表現出醫學上必須的生物相容性和血液相容性,並且必須不損害任何生理學控制系統和保護機制,例如免疫系統、補體系統或凝血系統。
[0027]本領域技術人員應該能夠根據這種性能要求找到適合的中空纖維吸附材料。原則上,可以使用由聚醯胺、聚碸、聚醚、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、或這些聚合物的衍生物和/或混合物製造的中空纖維材料。在本發明的一個特別優選的實施方案中,所述中空纖維由聚醯胺組成,優選尼龍。
[0028]本發明的適合的中空纖維材料是基於親合性膜,如在例如美國專利US5053133和US5766908以及W096/22316中所述。這些膜基體材料可以通過已知的方法進行改性,特別是通過接枝聚合來改性,關於這一方面,參見例如W096/22316,其中描述了一種適合的方法。適合於生產中空纖維吸附材料(即,本發明物質)的用於適當的聚合物材料的其它衍生化方法也是本領域技術人員公知的並且可以在本發明的範圍內加以使用。
[0029]優選將本發明的物質布置在裝置中,使得有效流量的血液或血漿流過它們,確保中空纖維膜的最大潤溼,以便可以發生外毒素在中空纖維吸附材料上的最佳吸附。中空纖維材料在本發明裝置中的優選的布置方法公開在W098/57733、W098/33581、W098/19777或W098/28064中,特別優選的布置方式還描述在EP1002566中。
[0030]除了中空纖維材料,本發明的裝置可以包含另外的材料,例如在中空纖維之間的平坦的膜,其通常可以提供進一步的吸附和分離性能。相應的吸附裝置布置描述在EP0956147 中。
[0031]在上述的文獻中公開的材料和改性方法和吸附裝置的最終布置都可以用在本發明的裝置中。然而,其它布置、材料和改性方法也被包括在本發明範圍內,條件是它們可以有效地將外毒素從血液和血漿中除去,並且滿足對於吸附性血漿分離置換的上述要求1-5。
[0032]為了使從血液或血漿中除去外毒素特別有效,所述裝置利用了化學改性的中空纖維,使得外毒素尤其充分地結合於中空纖維材料並由此被從血液或血漿中除去。優選進行中空纖維材料的化學改性(化學修飾),並且對於所述改性來說已經證明接枝聚合(參見上述)是尤其有利的,被接枝到中空纖維材料上的化合物表現出良好的外毒素結合能力。還已經證明了陰離子交換基團的接枝是尤其有利的。這些陰離子交換基團在具有大量陽離子基團的更長鏈的形式(稱為觸鬚)時是尤其有利的。基體材料上的這些觸鬚樣的伸長能夠結合外毒素分子,使中空纖維材料的效率進一步提高。中空纖維材料利用觸鬚的這種改性優選利用合成的和/或半合成的和/或天然的聚陽離子鏈,並且所述鏈可以是直鏈或支鏈的。尤其優選本發明的中空纖維材料用具有叔胺和/或季銨的陽離子鏈或聚陽離子鏈進行改性。
[0033]將陰離子交換基團固定在中空纖維材料上的另一種可能是本領域技術人員公知的用於化學固定的標準技術。
[0034]中空纖維材料上的優選的陰離子交換基團包括二 -或三烷基氨基烷基、二-或二 -燒基氨基芳基_、二-或二 -芳基氨基燒基、二 -或二 -芳基氨基芳基、二 -或二 -燒基銨基烷基_、二-或三-芳基銨基烷基、二 -或三-芳基銨基芳基_、和二 -或三-烷基銨基芳基殘基。此外,由胺基酸形成的帶正電荷的或者包含叔胺或季銨基團的聚合物,例如聚賴氨酸、聚精氨酸或聚組氨酸、或者其共聚物或衍生物,也適合作為本發明範圍內的陰離子交換材料,以及聚乙烯亞胺。
[0035]在本發明的尤其優選的實施方案中,所述裝置包含用二乙氨基烷基或二乙氨基芳基殘基改性的聚醯胺中空纖維材料,特別是二乙氨基乙基聚醯胺。[0036]此外,優選設置裝置使得其能夠作為現有灌注系統的可更換的濾筒使用。其可以容易地被插入到灌注系統中,並且,由於所使用的中空纖維材料的高結合能力和特異性,其可以具有小的體積,使得可以實現與目前已有的系統相比大大降低的死體積。令人驚訝的是,可以將本發明的裝置製成尺寸為例如長12cm和直徑5cm的濾筒,其可以非常有效地用於體外灌注系統中。在本實施例中的濾筒的死體積可僅為大約115ml。因此,在本發明的範圍內優選使濾筒的尺寸實現< 150ml、優選80-130ml的死體積。
[0037]如可顯示的那樣,所述濾筒可以除去外毒素,特別是有效地和選擇性地除去志賀毒素,除了本發明新發現的可能性之外,僅這麼小的死體積就提供了相對於現有技術的令人驚訝的和顯著的除去外毒素的優點,尤其是在一次性操作中同時除去志賀毒素和LPS。在治療結束和裝置的清潔之後或甚至在實施延長的(連續的)血液或血漿灌流之後,可以簡單地插入一個新的濾筒。
[0038]在本發明的範圍內,發現相關的中空纖維材料在生理學pH下通過吸附以高的選擇性和能力從全血和/或血漿中清除外毒素,尤其是志賀毒素。
[0039]已經發現,甚至在生理學pH,只有較少的、組成安全的量的血液和血漿蛋白質被吸附。特別地,在本發明範圍內僅有相當少量(< 2%)的纖維蛋白原被從患者的血液中除去,使得天然的凝血級聯在使用本發明的裝置時幾乎沒有受損。
[0040]因此,本發明的另一個目的是上述的和包含在本發明裝置中的中空纖維材料用於製造用於從體液(特別是血液或血漿)中除去外毒素的裝置的用途。
[0041]優選選自聚醯胺、聚碸、聚醚、聚乙烯、聚丙烯或聚酯、和這些材料的衍生物和/或混合物的用於本發明的中空纖維材料允許從患者的血液循環中清除外毒素,特別是志賀毒素,並由此可以有利地用於吸附性血漿分離置換裝置中。通常,在這種裝置中,首先將全血分離為血漿和微粒性血液組分,然後將血漿導向通過吸附材料,然後把微粒性血液組分返回到血漿中。
[0042]在一個優選的實施方案中,作為本發明的吸附劑使用的中空纖維材料是經過化學改性的,使得可以在其上發生最佳的外毒素吸附。尤其優選通過接枝聚合進行中空纖維的改性,並且優選陰離子交換基團的接枝,特別是以所謂的觸鬚形式,即鏈狀的、具有儘可能多的陰離子交換基團的支鏈分子的形式。
[0043]尤其優選的中空纖維材料是DEAE-改性的聚醯胺。
[0044]如上述已經描述的,對於本發明的裝置,有利的是將裝置設置為過濾器的形式,如有可能可以布置為一次性濾筒的形式,以確保容易的和安全的使用。
[0045]因此,本發明的另一個目的是本發明的裝置或根據本發明生產的設備用於從體液(尤其是血液或血漿)中除去外毒素的相應用途。尤其有利的是,利用了本發明物質的裝置被用於體外灌注系統,所述體外灌注系統提供細菌外毒素從患者血液的尤其有效的去除並使患者獲得特別成功的治療。此外,在本發明的應用過程中,外毒素以非常高的選擇性被除去,而內源性蛋白質僅以非常小的程度被除去(即使有的話),或者所述去除僅適用於可容易地被置換的蛋白質並且這種去除不會導致已經很虛弱的患者的顯著應激。患者的治療可以是治療性的和/或預防性的。因此,本發明的治療可用於感染致病性大腸桿菌的患者,以便治療腸疾病以及與感染有關的後遺症,例如在EHEC感染情況下的HUS。所述治療可以被認為是預防性的,因為它可以降低發展成HUS的風險。[0046]在本發明的範圍內,還可以使用上述吸附材料用於外毒素、尤其是志賀毒素的分離、富集和檢測。本發明物質的這種用途是本發明的另一個目的。所述分離、富集和檢測可以從任何流體進行,優選從血液或血漿中進行,並且可以為了任何目的而操作,儘管尤其優選用於分析和/或診斷。
[0047]通過以下實施例進一步說明本發明。
[0048]實施例
[0049]實施例1:在體外條件下通過選擇性吸附而除去志賀毒素
[0050]A)志賀毒素的製備
[0051]為了製備和富集志賀毒素,將大腸桿菌EHEC0104在包含以下物質的培養基中培養過夜:NaCl (10g/L)、胰蛋白腖(Triptone, 10g/L,Becton Dickinson)和酵母提取物(5g/L, Becton Dickinson)。在將懸浮液離心分離(200g, 30min)和將大腸桿菌沉降之後,獲得志賀毒素2(Stx2)被高度濃縮的上清液。Stx2的濃度相當於4.06的「光密度」(0D450/620)。該數值是通過使用專用的ELISA檢測試劑盒(Premier EHEC, Meridian Bioscience)測定的。
[0052]B)通過S.A.F.E.bt吸附裝置灌注志賀毒素溶液(B.BraunMelsungen AG)
[0053]根據A)中所述的方法獲得上清液的等分試樣,其包含被以1:2比例稀釋的Stx2。通過向吸附裝置濾筒施加負壓而將該溶液分別灌注通過S.A.F.E.bt吸附裝置(4次)。得自相應灌注液的數據列於表1中。
[0054]表1:志賀毒素的清除率
[0055]
【權利要求】
1.用於治療與腹瀉有關的、以及如果適用的話與後遺症有關的腸疾病的物質,所述腸疾病是由產生外毒素的大腸桿菌引起的,所述物質包含改性的中空纖維材料,所述中空纖維材料選自聚醯胺、聚碸、聚醚、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、及其衍生物和/或混合物,其中所述中空纖維材料經過改性而包含具有陰離子交換基團的觸鬚,其中所述陰離子交換基團包含合成的聚陽離子鏈、半合成的聚陽離子鏈和天然的聚陽離子鏈中的至少一種,其中所述合成的、半合成的和天然的聚陽離子鏈是直鏈或支鏈的。
2.權利要求1的物質,其中所用的中空纖維是通過接枝聚合和/或化學固定來改性的。
3.權利要求1或2的物質,其中所述陰離子交換基團由包含叔胺或季銨的聚陽離子鏈組成。
4.上述權利要求任一項的物質,其中陰離子交換基團選自:二-或三-烷基氨基烷基、二-或三-烷基氨基芳基、二-或三-芳基氨基烷基、二-或三-芳基氨基芳基、二-或三-烷基銨基烷基、二-或三-芳基銨基烷基、二 -或三-芳基銨基芳基、二 -或三-烷基銨基芳基殘基,衍生自胺基酸的帶正電荷或者包含叔或季氨基的聚合物,如聚賴氨酸、聚精氨酸或聚組氨酸、或者其混合物或衍生物,或聚乙烯亞胺。
5.上述權利要求任一項的物質,其中所述中空纖維材料是用二乙氨基乙基改性的聚醯胺。
6.上述權利要求任一項的物質,其中所述中空纖維材料是尼龍。
7.上述權利要求任一項的物質,其中所述物質在一個裝置中提供,所述裝置被布置為過濾器模塊形式。
8.權利要求7的物質,其中所述過濾器模塊具有<150ml、優選80-130ml的死體積。
9.權利要求7或8的物質,其中所述裝置允許最大為200ml/分鐘的流速。
10.上述權利要求任一項的物質,其中所述裝置設計為用於血漿灌流系統。
11.上述權利要求任一項的物質,其從患者的血液或血漿結合併除去毒素。
12.上述權利要求任一項的物質,其中所述治療可以是預防性的和/或治療性的。
13.上述權利要求任一項的物質,其中所述物質結合由腸出血性大腸桿菌、腸毒性大腸桿菌或腸聚集性大腸桿菌產生的外毒素。
14.上述權利要求任一項的物質,其中所述物質結合由腸出血性大腸桿菌產生的毒素。
15.上述權利要求任一項的物質,其中所述毒素屬於志賀毒素家族。
16.上述權利要求任一項的物質,其中所述物質用於治療由大腸桿菌產生的外毒素引起的腹瀉和/或溶血性尿毒症症候群,所述外毒素優選為志賀毒素。
17.上述權利要求任一項的物質,其中所述物質同時結合外毒素和LPS,所述外毒素優選為志賀毒素。
18.權利要求1-17任一項的物質用於從任何流體非治療性地分離、富集和/或檢測由大腸桿菌產生的毒素的用途。
【文檔編號】B01J41/04GK103842083SQ201280042706
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2011年9月8日
【發明者】D·賽德爾, B·R·耶格爾 申請人:安全Bt股份有限公司