利用侵染相關基因的協同作用提高微生物殺蟲效果的方法
2023-08-05 03:00:36 1
專利名稱：利用侵染相關基因的協同作用提高微生物殺蟲效果的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種利用基因工程提高微生物殺蟲效果的方法。
背景技術：
自然界中分布有十分豐富的殺蟲微生物。在微生物導致的昆蟲死亡中，病原真菌佔60％以上。因此，研製和開發微生物殺蟲劑特別是真菌殺蟲劑受到國內外的廣泛關注。近年來，真菌殺蟲劑產品發展迅速，防治對象包括溫室害蟲、沙漠蝗蟲、水稻葉蟬以及衛生害蟲，如蟑螂、白蟻、蒼蠅等，市場規模日益擴大，產生了良好的經濟和社會效益。
但是真菌殺蟲劑存在擊倒害蟲時間長、不能有效的將害蟲控制在作物受損之前等不足。因此，克服和解決這一問題，對於研製新型高效真菌殺蟲劑具有重要意義。殺蟲真菌擊倒昆蟲包括孢子附著在昆蟲體壁並萌發、侵染結構(如附著胞)的形成、菌絲穿過昆蟲體壁、菌絲在蟲體內生長並使昆蟲致病等主要過程。其中菌絲穿透昆蟲體壁是致病的關鍵過程，該過程不僅決定侵染的成敗，而且其速度對殺蟲真菌擊倒昆蟲的時間影響很大。昆蟲體壁主要由蛋白質和幾丁質組成，蛋白質填充在幾丁質骨架結構中形成堅固的昆蟲外殼。殺蟲真菌通過機械壓力和水解酶的降解作用穿透體壁。在這一過程中殺蟲真菌分泌蛋白酶、幾丁酶和酯酶等多種水解酶，其中蛋白酶和幾丁酶起重要作用。
近年來，隨著生物技術的發展和對真菌侵染昆蟲分子機理研究的深入，利用基因工程進行菌株改造為解決上述問題提供了可能。如美國馬裡蘭大學的St.Leger等人(1996)將真菌侵染昆蟲時分泌的一種類枯草桿菌蛋白酶Pr1基因導入綠僵菌(Metarhizium anisopliae)野生菌株中組成性表達，顯著提高了菌株毒力，重組菌株擊倒害蟲的時間縮短了25％，作物損失降低了40％。St.Leger等人還將綠僵菌類枯草桿菌蛋白酶Pr1基因導入昆蟲杆狀病毒中，也顯著提高了病毒毒力。這說明，利用基因工程改造菌株是解決上述問題的有效途徑。但是目前人們在殺蟲真菌的基因工程方面主要局限在Pr1等基因的研究上，從報導的重組菌株的殺蟲效果來看，尚未達到令人滿意的水平。其原因之一是，昆蟲的體壁除了蛋白質外，幾丁質也是主要成份。相對於蛋白酶而言，對幾丁酶在侵染過程所起作用的研究較少。從現有的研究結果來看，幾丁質酶也是誘導酶，它由在蛋白酶作用後露出的幾丁質誘導產生。在金龜子綠僵菌侵染昆蟲體壁的初期只有低水平表達，60h後表達量才明顯增加，並由菌絲附近向體壁其它部分擴散(St.Leger1996)。在基因克隆方面，目前僅從金龜子綠僵菌克隆了2個幾丁酶基因(Bogo1998，Sun1998)，但至今還未有在白僵菌(Beauveria SP.)中克隆幾丁酶基因的報導。有關殺蟲真菌幾丁酶基因的功能和表達特性的研究也很少。
幾丁質在昆蟲體壁中起骨架結構作用，因此，幾丁酶在降解昆蟲體壁中的作用也十分重要。而且，St.Leger(1986)的體外試驗研究表明，金龜子綠僵菌通過蛋白酶和幾丁酶的協同作用水解昆蟲體壁。Charnley等(1991)用Dimilin(一種幾丁質合成抑制劑)處理昆蟲幼蟲，使其幾丁質合成受損，接種金龜子綠僵菌後發現，殺蟲真菌降解昆蟲體壁的速度顯著提高，體壁幾乎完全被分解，並且金龜子綠僵菌的寄主專化性降低，即對多種經Dimilin處理的昆蟲體壁的降解效果一樣。但是這一方法的關鍵是用幾丁質合成抑制劑使幾丁質合成受阻來提高蛋白酶降解昆蟲體壁的速度。利用侵染相關基因的協同作用提高微生物降解昆蟲體壁的速度從而提高殺蟲效果的研究尚未見報導。
發明內容
本發明的目的在於，根據昆蟲體壁的結構和昆蟲病原真菌的侵染機理，提供一種利用基因工程提高殺蟲真菌殺蟲效果的方法。該方法的要點是利用殺蟲真菌分解寄主體壁水解酶的協同作用，同時將兩種或兩種以上的水解酶基因導入殺蟲真菌，使其組成性表達並協同作用，促進真菌菌絲穿透昆蟲體壁，縮短擊倒時間。該方法還可用於提高其它殺蟲微生物如細菌、病毒等的殺蟲效果和植物的抗蟲效果。
本發明的基本思路是將昆蟲病原真菌侵染昆蟲時起關鍵作用的類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁酶基因BbChit-1同時導入殺蟲微生物或植物，使其組成性超量表達，提高殺蟲微生物的毒力或提高植物的抗蟲能力。
本發明依次通過以下步驟實現(1)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因BbChit-1基因克隆①球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的cDNA基因克隆利用昆蟲體壁誘導球孢白僵菌分生孢子萌發後的芽管狀物，提取RNA，純化mRNA，構建cDNA文庫，同時，根據對不同來源的類枯草蛋白酶基因的同源性比較結果，按其中2個保守序列設計引物，上遊引物BbP-1(forward primer)的序列為5′＞tgg ggt cta ggt cgc atc tc＜3′；下遊引物BbP-2(reverse primer)的序列為5′＞gcc agg tgc gaa aat gtc aac＜3′，然後利用RT-PCR技術擴增出大小為593bp的類枯草桿菌蛋白酶探針BbP，利用此探針篩選cDNA文庫，獲得陽性克隆，釋放文庫，酶切驗證，測序驗證，獲得大小為1557bp的CDEP-1 cDNA基因(polyA除外)；②球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基因克隆根據CDEP-1 cDNA 5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增CDEP-1的基因組序列，上遊引物序列為5′＞ctt cat cca gca agc aaagtc＜3′，下遊引物序列為5′＞gtt aaa tat aca gat caa tga gtt ttg＜3′；③球孢白僵菌內切幾丁酶Bbchit1的分離純化及序列測定在利用幾丁質誘導培養球孢白僵菌的基礎上，分離純化出具有內切酶活性的幾丁酶Bbchit1，並進行N』端胺基酸測定，序列為AGTCATKGRPAGKVLQGYWENWD；④球孢白僵菌內切幾丁酶Bbchit1的cDNA的克隆提取利用幾丁質誘導的球孢白僵菌總RNA，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，結合下遊加接頭的Oligo-dT引物，利用3′RACE擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列；⑤球孢白僵菌內切幾丁酶基因Bbchit1的克隆根據3』RACE得到的cDNA序列，利用YADE技術擴增Bbchit1的全長基因，用於YADE的線性擴增引物序列為5』＞ccg tgc ttg cga atg tcg＜3』，指數擴增引物序列為5』＞ggc acc gtc cca gtt ctc＜3』，以DraI酶切球孢白僵菌的基因組DNA為模板，YADE擴增得到了長為1400bp的片段，連接3』RACE和YADE的產物，得到Bbchit1的全長基因序列；(2)蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因BbChit-1雙價載體的構建將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於構巢麴黴(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子Pgpd和色氨酸基因的終止子TtrpC之下，然後將二者串聯於真菌表達載體，構建成雙價基因的真菌表達載體，或將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1串聯於原核表達系統，構建成雙價基因的原核表達載體，或將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於植物組成性啟動子如35sCAMV和Nos終止子之下，然後將二者串聯於植物表達載體，構建成雙價基因的植物表達載體；(3)獲得同時超量表達蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1重組微生物或抗蟲植物利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入蟲生真菌或其它殺蟲微生物或植物，篩選獲得同時組成性超量表達蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組微生物或抗蟲植物。
上述步驟(1)-①中獲得大小為1557bp的CDEP-1的cDNA，其中含有一個1134bp的開放閱讀框(ORF open reading frame)，5′端非編碼區長72bp，3′端非編碼區長為353bp，1134bp的開放閱讀框編碼一個377個胺基酸、分子量為38616的蛋白質，其等電點為PI＝8.302。N端18個胺基酸是一個信號肽序列，其中含有一個帶正電荷胺基酸(Arg)，8個胺基酸的疏水區域和螺旋轉彎的胺基酸(Pro)，信號肽的剪切位點的識別序列(Ala-Pro-Val)。進一步對胺基酸序列分析表明，Asp138、His168和Ser323為枯草桿菌蛋白酶活性區域的關鍵胺基酸，組成絲氨酸類蛋白酶的電子傳遞鏈。
(1)-②中擴增得到的片段長為1760bp，命名為gCDEP-1，在Genebank上的登錄號為AY040532。與CDEP-1序列相比較，gCDEP-1含有3個內含子，每個內含子具有典型的邊界序列GT..AG，內含子中含有分枝序列CTAAT和CTGAC。
(1)-④擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列片段長為1120bp，包含編碼幾丁酶Bbchit1成熟蛋白的序列和3』端非編碼序列。
(1)-⑤中得到的Bbchit1全長基因序列，Genbank登錄號為AY145440。Bbchit1含有長為1047bp的開放閱讀框架(ORF，open reading frame)，編碼348個胺基酸，其中含有幾丁酶典型的活性序列95-98(SXGG)和128-135(DGIDXDXE)。對照N-端測序結果，Bbchit1含有長為28個胺基酸的信號肽序列。
上述步驟(3)中蟲生真菌是指白僵菌(Beauveria SP.)、綠僵菌(MetarhiziumSP.)、擬青黴(paecilomyces SP.)、輪枝菌(Verticillium SP.)等。其它殺蟲微生物包括細菌、病毒等。
該發明的優點是將蟲生真菌侵染昆蟲時分泌的兩類主要水解酶類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶基因克隆，將二者分別置於真菌、細菌或植物組成性啟動子之下，然後串聯於真菌、細菌或植物表達載體上，構建類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶基因的雙價表達載體。利用遺傳轉化技術將雙價表達載體分別轉入蟲生真菌、殺蟲細菌或殺蟲病毒，獲得同時高效表達類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶的重組菌株，使二者在微生物侵染昆蟲時協同作用，提高菌株毒力；或者將雙價載體轉入植物，獲得同時表達類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶的轉基因植株，使二者在植物中協同作用，提高植株的抗蟲能力。
具體實施例方式實施例1通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於構巢麴黴(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子Pgpd和色氨酸基因的終止子TtrpC之下，然後將二者串聯於真菌表達載體，構建成雙價基因的真菌表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入蟲生真菌白僵菌，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組菌株。
實施例2通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於構巢麴黴(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子Pgpd和色氨酸基因的終止子TtrpC之下，然後將二者串聯於真菌表達載體，構建成雙價基因的真菌表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入蟲生真菌綠僵菌，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組菌株。
實施例3通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於構巢麴黴(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子Pgpd和色氨酸基因的終止子TtrpC之下，然後將二者串聯於真菌表達載體，構建成雙價基因的真菌表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入蟲生真菌擬青黴，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組菌株。
實施例4通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於構巢麴黴(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子Pgpd和色氨酸基因的終止子TtrpC之下，然後將二者串聯於真菌表達載體，構建成雙價基因的真菌表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入蟲生真菌蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanni)，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組菌株。
實施例5通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1串聯於原核表達載體，構建成雙價基因的原核表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入蘇雲金芽孢桿菌，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組菌株。
實施例6通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於病毒組成性啟動子和終止子之下，然後將二者串聯於病毒表達載體，構建成雙價基因的病毒表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入核型多角體病毒，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組菌株。
實施例7通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於植物組成性啟動子35SCAMV和NOS終止子之下，然後將二者串聯於植物表達載體，構建成雙價基因的植物表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入棉花，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的抗蟲棉花。
實施例8通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於植物組成性啟動子35S CAMV和NOS終止子之下，然後將二者串聯於植物表達載體，構建成雙價基因的植物表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入水稻，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的抗蟲水稻。
實施例9通過誘導培養，提取球孢白僵菌誘導性表達的RNA，根據類枯草桿菌蛋白酶序列同源性比較，設計兼併引物，利用RT-PCR擴增探針，然後從球孢白僵菌誘導性表達的cDNA文庫中鉤取類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根據CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增出CDEP-1的基因組序列gCDEP-1；通過誘導培養，分離純化具有內切活性的球孢白僵菌幾丁質酶BbChit-1，測定其N』端胺基酸序列，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，利用3』RACE等技術擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列，根據cDNA序列設計引物，利用YADE技術擴增cDNA片段上遊序列，包括信號肽序列、3』端非編碼序列和部分啟動子序列，連接3』RACE和YADE的產物，得到了Bbchit1的全長基因序列Bbchit1；將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於植物組成性啟動子35SCAMV和NOS終止子之下，然後將二者串聯於植物表達載體，構建成雙價基因的植物表達載體；利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入油菜，篩選獲得同時組成性超量蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的抗蟲油菜。
權利要求
1.一種利用侵染相關基因的協同作用提高微生物殺蟲效果的方法，其特徵在於，依次包括下列步驟(1)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因BbChit-1基因克隆①球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的cDNA基因克隆利用昆蟲體壁誘導球孢白僵菌分生孢子萌發後的芽管狀物，提取RNA，純化mRNA，構建cDNA文庫，同時，根據對不同來源的類枯草蛋白酶基因的同源性比較結果，按其中2個保守序列設計引物，上遊引物BbP-1(forward primer)的序列為5′＞tgg ggt cta ggt cgc atc tc＜3′；下遊引物BbP-2(reverse primer)的序列為5′＞gcc agg tgc gaa aat gtc aac＜3′，然後利用RT-PCR技術擴增出大小為593bp的類枯草桿菌蛋白酶探針BbP，利用此探針篩選cDNA文庫，獲得陽性克隆，釋放文庫，酶切驗證，測序驗證，獲得大小為1557bp的CDEP-1cDNA基因(polyA除外)；②球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基因克隆根據CDEP-1cDNA 5′端和3′端序列設計引物，以球孢白僵菌的基因組DNA為模板擴增CDEP-1的基因組序列，上遊引物序列為5′＞ctt cat cca gca agc aaagtc＜3′，下遊引物序列為5′＞gtt aaa tat aca gat caa tga gtt ttg＜3′；③球孢白僵菌內切幾丁酶Bbchit1的分離純化及序列測定在利用幾丁質誘導培養球孢白僵菌的基礎上，分離純化出具有內切酶活性的幾丁酶Bbchit1，並進行N』端胺基酸測定，序列為AGTCATKGRPAGKVLQGYWENWD；④球孢白僵菌內切幾丁酶Bbchit1的cDNA的克隆提取利用幾丁質誘導的球孢白僵菌總RNA，根據N』端胺基酸序列設計上遊兼併引物，結合下遊加接頭的Oligo-dT引物，利用3′RACE擴增出編碼幾丁酶Bbchit1的cDNA序列；⑤球孢白僵菌內切幾丁酶基因Bbchit1的克隆根據3』RACE得到的cDNA序列，利用YADE技術擴增Bbchit1的全長基因，用於YADE的線性擴增引物序列為5』＞ccg tgc ttg cga atg tcg＜3』，指數擴增引物序列為5』＞ggc acc gtc cca gtt ctc＜3』，以DraI酶切球孢白僵菌的基因組DNA為模板，YADE擴增得到了長為1400bp的片段，連接3』RACE和YADE的產物，得到Bbchit1的全長基因序列；(2)蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因BbChit-1雙價載體的構建將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於構巢麴黴(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子Pgpd和色氨酸基因的終止子TtrpC之下，然後將二者串聯於真菌表達載體，構建成雙價基因的真菌表達載體，或將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1串聯於原核表達系統，構建成雙價基因的原核表達載體，或將類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1和幾丁質酶基因Bbchit1分別置於植物組成性啟動子如35sCAMV和Nos終止子之下，然後將二者串聯於植物表達載體，構建成雙價基因的植物表達載體；(3)獲得同時超量表達蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1重組微生物或抗蟲植物利用遺傳轉化技術，將構建的雙價載體轉入蟲生真菌或其它殺蟲微生物或植物，篩選獲得同時組成性超量表達蛋白酶CDEP-1和幾丁質酶BbChit-1的高毒力重組微生物或抗蟲植物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的微生物是真菌、細菌或病毒。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的真菌是白僵菌、綠僵菌、擬青黴、輪枝菌。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的植物是棉花、水稻、油菜。
全文摘要
一種利用侵染相關基因的協同作用提高微生物殺蟲效果的方法，將蟲生真菌侵染昆蟲時分泌的兩類主要水解酶類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶基因克隆，並將二者分別置於真菌、細菌或植物組成性啟動子之下，然後串聯於真菌、細菌或植物表達載體上，構建類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶基因的雙價表達載體。利用遺傳轉化技術將雙價表達載體分別轉入蟲生真菌、殺蟲細菌或殺蟲病毒，獲得同時高效表達類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶的重組菌株，使二者在微生物侵染昆蟲時協同作用，提高菌株毒力；或者將雙價載體轉入植物，獲得同時表達類枯草桿菌蛋白酶和幾丁質酶的轉基因植株，使二者在植物中協同作用，提高植株的抗蟲能力。
文檔編號C12N15/56GK1412311SQ0215320
公開日2003年4月23日 申請日期2002年11月26日 優先權日2002年11月26日
發明者裴炎, 方衛國, 張永軍 申請人:西南農業大學