BRAF基因V600E突變的螢光定量檢測引物和探針的製作方法
2023-08-05 05:46:56 2
本發明屬於生物醫學領域，涉及一種braf基因v600e突變的螢光定量檢測引物和探針。
背景技術：
braf基因位於染色體臂7q34上。它編碼b-raf，絲氨酸-蘇氨酸激酶是ras-raf-mek-erk-mapk(絲裂原活化蛋白激酶)信號級聯的一部分。該途徑的激活涉及促進細胞的生長，增殖和分化。
人體中存在三種功能性raf蛋白，即araf、braf和craf。其中，braf具有最高的基礎激酶活性，是mapk通路最有效的激活劑。
braf基因由18個外顯子組成，最常見的活化突變在1799位核苷酸的外顯子15中發現，涉及將胸腺嘧啶轉換為腺嘌呤。這導致在位置600的穀氨酸取代纈氨酸，其被指定為v600e。該突變發生在b-raf蛋白的激酶結構域內，據報導其激酶活性高於其正常對應物的10倍。因此，它作為癌基因，促進細胞生長，分化和生存。
已經鑑定了30多種不同的braf突變。然而，v600e佔所有braf突變的約90％，是臨床實驗室通常測試的突變。
braf基因突變在許多不同的癌症中發現，報導了各種頻率。發生率最高的惡性黑色素瘤(27-70％)，甲狀腺乳頭狀癌(36-53％)，結直腸癌(5-22％)和漿液性卵巢癌(30％)。然而，它也可能發生在其他癌症，包括肺癌，膠質瘤，室管膜瘤，非霍奇金淋巴瘤，急性淋巴細胞性白血病，肝癌，胃癌和食管癌中的低頻率(1-3％)。
免疫組化技術(ihc)用特異性抗體ve1識別v600e突變蛋白來檢測braf突變，且與sanger測序法一致性達95％以上，即使腫瘤樣本少的標本也可檢測，易於判讀，兼具低成本和高效的優勢，因此更適合作為初篩手段，正逐漸成為當前braf基因突變常用檢測方法。但該方法仍存在一些缺點。因為並非所有突變都引起抗原丟失，所以檢測的突變種類局限性較大。免疫組化結果有時因為圖像不夠清晰或者抗原抗體反應不充分導致結果很難解釋。可重複性較差，小活檢標本存在抽樣誤差。
高通量測序技術(nextgenerationsequencing)通過對braf基因進行深度測序，可以獲得braf整個基因內的突變信息，尤其是brafv600e，並且能夠通過測序深度計算突變頻率。但不可避免的存在測序成本高、實驗周期長等缺點，這也導致測序技術一般不用於初篩，而是作為初篩之後的確定手段。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種高靈敏度、高特異性、可重複性高、實驗成本低並且能夠快速得到brafv600e突變情況的快速檢測方法。
首先，本發明提供了一種用於檢測braf基因v600e突變的組合物。
本發明所提供的用於檢測braf基因v600e突變的組合物，具體由一個引物對和一個探針組成；所述引物對由引物1和引物2組成，所述引物1為序列表中序列1所示的單鏈dna，所述引物2為序列表中序列2所示的單鏈dna；所述探針為序列表中序列3所示的單鏈dna探針。
其中，所述引物對和所述探針也分別屬於本發明的保護範圍。
所述探針的5』端標記有螢光基團，3』端標記有淬滅基團。
在本發明的一個實施例中，所述螢光基團具體為fam；所述淬滅基團具體為bhq1。
其次，本發明還提供了一種用於檢測braf基因v600e突變的試劑盒。
本發明所提供的用於檢測braf基因v600e突變的試劑盒，含有下述a)和b)：
a)所述組合物或所述引物或所述探針；
b)陰性引物；所述陰性引物為序列表中序列4所示的單鏈dna。
在所述組合物中，所述引物1、所述引物2和所述探針的摩爾比為1：1：1。
在所述試劑盒中，所述引物1、所述引物2、所述陰性引物和所述探針的摩爾比為1：1：1：1。
所述組合物或所述引物或所述探針在製備所述試劑盒中的應用也屬於本發明的保護範圍。
所述組合物或所述引物或所述探針或所述試劑盒在製備用於篩查braf基因v600e突變相關癌症的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。
所述組合物或所述引物或所述探針或所述試劑盒和記載有「檢測braf基因v600e突變方法」的可讀性載體在製備用於篩查braf基因v600e突變相關癌症的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。
其中，所述檢測braf基因v600e突變方法，包括如下步驟：用權利要求1-7中任一所述的組合物或引物或探針或試劑盒對待測樣品進行taqman探針螢光定量rt-pcr反應。
進行所述taqman探針螢光定量rt-pcr反應時，反應體系中所述引物1和所述引物2的濃度為500nm，所述探針的濃度為500nm。
進行所述taqman探針螢光定量rt-pcr反應時，反應程序中的退火溫度為60℃。具體反應程序為95℃3min；95℃15s，60℃50s，45個循環；40℃30s。
本發明使用螢光定量pcr的方法，設計特異性的brafv600e檢測引物和探針。相對於免疫組化和高通量測序的檢測方法，螢光定量pcr的方法在保證高靈敏度和高特異性的基礎上，實驗周期更短、成本更低。而特異性的螢光探針相對於普通的pcr，又降低了假陽性，即非特異性擴增的出現。針對組織樣本dna和ffpe石蠟切片，本發明可以進行最低50ngdna、突變率最低0.5％的檢測，並且最終的螢光曲線ct值≤36，說明本發明所提供的引物和探針具有很好的靈敏度。
附圖說明
圖1為使用50ngcfdna，針對36％，10％，5％，1％突變頻率的陽性樣本和陰性樣本的檢測結果。雖然陰性樣本也有起峰，但可以與1％樣本很好分開。
圖2為使用20ngcfdna，針對10％，5％，1％，0.5％，0.1％突變頻率的陽性樣本和陰性樣本的檢測結果。雖然陰性樣本也有起峰，但可以與陽性樣本很好分開。
圖3為使用50ngffpe石蠟切片樣本dna，針對5％，1％，0.5％突變頻率的陽性樣本，陰性樣本以及8個正常人樣本的檢測結果。陰性樣本雖然與正常人樣本存在差異，但可以與陽性樣本很好分開。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、用於檢測braf基因v600e突變的引物和探針的設計選用
本發明中用於檢測braf基因v600e突變的引物和探針的設計原理如下：pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，探針兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；pcr擴增時，taq酶的5』－3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與pcr產物形成完全同步。如果存在突變，則特異性的引物和探針會與目標dna模板結合，釋放出螢光信號。這個螢光信號被螢光定量pcr儀檢測到並轉換為可讀的螢光曲線，再結合螢光曲線進行分析，可知樣本brafv600e的突變情況。
根據braf基因v600e區域設計特異性引物和探針，在研發初期本發明的發明人所在團隊曾經設計並試驗過一組引物和兩條探針：一條用於檢測v600e突變的探針，一條用於作為陰性對照的探針(即不含有v600e突變)。
正向引物-2：5』-gatccagacaactgttca-3』；
反向引物-2：5』-acacctcagatatatttcttca-3』；
陰性探針-2：cy5-ccatcgagatttcactgtagctagac-bhq2；
突變檢測探針-2：fam-ccatcgagatttctctgtagctagac-bhq1。
使用這組引物探針時，發現並不能很好的區分brafv600e突變，在檢測陽性樣本和陰性樣本時，兩條探針都會同等的發出螢光，雖然螢光曲線和螢光強度有所區別，但並不能很好的用於brafv600e突變的檢測。
更換思路後，重新設計檢測引物和探針，將設計的重點放在了引物的設計上。一共設計了三條引物和一條探針，即：
正向引物：5』-gtgattttggtctagctacgga-3』(序列1)；
反向引物：5』-tccacaaaatggatccagac-3』(序列2)；
螢光探針：fam-actgatgggacccactccatcga-bhq1(序列3)；
陰性引物：5』-tcacagtaaaaataggtgattttgg-3』(序列4)。
其中正向引物、反向引物和螢光探針的組合可以用來檢測brafv600e的突變；而陰性引物、反向引物和螢光探針的組合可以用來監測brafv600e區域整體的表達量，而並非對v600e突變進行檢測。這是由於在設計正向引物時，將引物設計在v600e突變附近，只有發生突變才能進行正常的pcr反應，釋放出螢光。而陰性引物則避開了v600e突變，選擇了沒有發生突變的區域，這樣無論樣本是否發生突變，pcr反應都能正常進行，釋放出螢光。可以通過對比正向引物組和陰性引物組擴增的螢光曲線來獲悉brafv600e突變的量以及在總dna中的比例。
實施例2、實驗反應體系和反應條件的測試
使用組織樣本和ffpe石蠟切片樣本(ngs檢測brafv600e陽性)所提的dna，以及螢光定量試劑盒kapaprobefastqpcrkits(kapabiosystems，#kk4703)進行了實驗，實驗體系大小根據試劑盒推薦確定為20μl。
在實驗環境和其他條件均相同的情況下，對實驗體系中的正向和反向引物濃度進行了優化測試，最終確定500nm的終濃度能夠達到最好的檢測效果。
在實驗環境和其他條件均相同的情況下，對實驗體系中的螢光探針濃度進行了優化測試，最終確定500nm的終濃度能夠達到最好的檢測效果。
最終確定的最佳反應體系如表1所示。
實驗反應條件在經過多次優化後，最終確定為：95℃3min；95℃15s，60℃50s，45個循環；40℃30s。
表1最佳反應體系
實施例3、標準品樣本檢測下限的確定
針對不同類型的標準品樣本(horizinbrafv600ecfdnareferencestandardset和horizonbrafv600effpereferencestandard)，利用標準品陽性樣本和陰性樣本配置不同突變頻率的陽性樣本，然後進行檢測下限實驗。具體實驗方法步驟與實施例2相同。
實驗結果見圖1、圖2和圖3。可見，本發明可以進行最低50ngdna、突變率最低0.5％的檢測，並且最終的螢光曲線ct值≤36。表明本發明所提供的引物和探針具有很好的靈敏度。
邁基諾（重慶）基因科技有限責任公司
braf基因v600e突變的螢光定量檢測引物和探針
gncln171097
4
patentinversion3.5
1
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dna
人工序列
1
gtgattttggtctagctacgga22
2
20
dna
人工序列
2
tccacaaaatggatccagac20
3
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dna
人工序列
3
actgatgggacccactccatcga23
4
25
dna
人工序列
4
tcacagtaaaaataggtgattttgg25