預防或治療局部缺血性疾病的藥劑的製作方法

2023-08-04 16:08:01

專利名稱：預防或治療局部缺血性疾病的藥劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於預防或治療局部缺血性疾病的藥劑，含有米達克因(midkine，以下縮寫為MK)作為活性成分。
背景技術：
局部缺血是這樣一種狀態，身體局部的血流完全被阻塞或者大為減少，導致缺氧、基質供應減少和代謝產物蓄積。儘管局部缺血的程度取決於血管梗阻敏度、它的持續時間、組織對它的敏感性和側副血管的發育程度，機能障礙通常發生在局部缺血的器官或組織中，長時間的局部缺血導致受影響組織的萎縮、變性和壞死。
缺血性腦血管損傷的形成機理分為三種類型，栓塞、栓子和血液動力。所有這三種類型的主要病理狀態都是腦缺血，其嚴重性和持續時間定義了腦組織損傷的程度。在嚴重缺血的部位，神經和內皮細胞迅速受到不可逆損傷，由於壞死形成典型的梗塞病灶。儘管血流適度地下降和缺血半影部的神經細胞功能被暫停了，它們的存活能力並沒有喪失，當循環通過側副血管重新開始時，剩餘的腦血管系統能夠恢復其功能。
在影響冠狀動脈並導致心肌缺血的缺血性心臟病中，缺血性心肌細胞損傷程度隨著冠狀動脈梗阻的時間延長，從可逆的細胞損害發展到不可逆的細胞損害。
可以想見，預防這種由局部缺血導致的細胞病或者刺激受損害細胞的再生的藥物提供了缺血性腦和心臟疾患的基本療法。
基於這種概念，據報導已經篩選出有效預防和治療瞬間性腦缺血繼發的神經細胞損傷的藥物，方法是將缺血腦保護因子候選物質注射到心室或外周血管中，研究該物質在形態上和功能上的作用。例如，prosaposin對蒙古沙土鼠的心室內給藥顯著減輕了局部缺血後的學習能力喪失，海馬CA1區的病理學檢查顯示，錐體細胞數量比對照組顯著增加(Sand，A.等《生物化學與生物物理學研究通訊》204994-1000，1994)。象prosaposin一樣，心室內注射睫狀神經營養因子(CNTF)和白細胞介素6(IL-6)也被證明以劑量依賴的方式顯著提高CA1區錐體細胞和突觸的數量(Wen，T-C等《神經科學快報》19155-58，1995)(Matsuda，S.等《神經科學快報》204109-112，1996)。另據報導，心室內注射鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)對缺血海馬具有明顯的保護作用，不過其方式與prosaposin、CNTF和IL-6不同(Wen，T-C等《神經科學》65513-521，1995)。不過，這些保護因子對缺血性腦疾患的作用機理尚未被詳細闡明。
發明的公開本發明提供一種新穎的藥劑，用於治療或預防多種由細胞死亡導致的疾病，細胞死亡是由局部缺血或應激反應引起的，該藥劑包含一種米達克因(MK)族蛋白質作為活性成分。
更確切地說，本發明提供(1)一種藥劑，用於治療或預防由局部缺血或應激反應導致的細胞病，該藥劑包含一種米達克因(MK)族蛋白質作為活性成分；(2)根據(1)的藥劑，其中所述的由局部缺血或應激反應導致的細胞病發生在腦實質；(3)根據(2)的藥劑，其中所述的腦實質是海馬CA1區中的錐體細胞；(4)一種藥劑，用於治療或預防由細胞病導致的疾病，細胞病是由局部缺血或應激反應引起的，該藥劑包含一種米達克因(MK)族蛋白質作為活性成分；(5)根據(4)的藥劑，其中所述的由局部缺血引起的疾病是腦梗塞；和(6)根據(4)的藥劑，其中所述的由局部缺血引起的疾病是心肌梗塞。
米達克因(MK)是與肝素結合的分泌蛋白，鹼性胺基酸和半胱氨酸中含有豐富的MK。它是作為一種在由視黃酸誘發的胚胎腫瘤細胞分化過程中被瞬時表達的基因產物而被發現的(Kadomatsu，K.等《生物化學與生物物理學研究通訊》1511312-1318，1988；Tomomura，M.等《生物化學雜誌》26510765-10770，1990；Tomomura，M.等《生物化學與生物物理學研究通訊》171603，1990)。MK與後來被發現的多效蛋白(pleiotrophin)(PTN)具有45％同源性(Merenimies，J. Rauvala，H.《生物化學雜誌》26516721-16724，1990)，因此MK和PTN構成MK族(Muramatsu，T.《Dev.Growth Differ.》361-8，1994)。
人們已經積累了很多關於MK功能的資料，現在很可能發現更新、更重要的功能。MK的主要功能包括下列五種1)神經營養因子活性(MK刺激神經細胞的存活和軸突分枝(Muramatsu，H.等《發展生物學》159392，1993；Michikawa，M.等《神經科學研究雜誌》35530，1993；Kikuchi，S.等，160，1993))；2)創傷治癒(MK減輕和預防由長時間白光刺激引起的視黃膜變性(Unoki，K.等《眼科學與視覺科學》354063，1994)，在實驗性大鼠腦和心肌梗塞早期的梗塞病灶附近誘發MK表達(Yoshida，Y.等《腦發育研究》8525-30，1995；Obama，H.等《抗癌研究》18145-152，1998))；3)個體發育(MK被瞬時表達的峰值出現在胚胎中期，後期主要蓄積在腎中)；4)纖溶系統的活化(濃度為10ng/ml的MK使牛主動脈血管內皮細胞的纖溶酶原激活物活性升高三至五倍(Kojima，S.等《生物化學雜誌》2709590，1995))；和5)癌症(MK頻繁地表達在維耳姆斯氏瘤、乳腺癌、肺癌、成神經細胞瘤，食道癌、胃癌、結腸癌和肝細胞瘤中(Tsutsui，J.等《癌症研究》531291，1933；Garver，R.I.等《癌症》741584，1994；Garver，R.I.等《美國呼吸細胞分子生物學雜誌》9463，1993；Nakagawa，A.等《癌症研究》551792，1995；Aridome，K.等《日本癌症研究》86655，1995)。
如上所述，在實驗性大鼠腦梗塞後早期的梗塞病灶附近誘發MK的表達，並已證明它僅在星形細胞中被表達(Yoshida，A.等《腦發育研究》8525-30，1995)。大鼠前腦發展成瞬間性缺血後的第四天，與MK共同構成一族的PTN也是在海馬中被強烈表達的，主要是在CA1區，併集中在星形細胞中(Takeda，A.等《神經科學》6857-64，1995)。按照慣例，伴隨局部缺血而產生的星形細胞活化被認為起到保護細胞的作用。MK和PTN在發生局部缺血後的中樞神經系統修復過程中可起到一定作用。
本發明人假定MK可能在腦梗塞發作後的患者內被瞬時表達，並測定了150位健康個體和36位腦梗塞患者血清中的MK濃度。健康個體的平均MK血清濃度為0.3ng/ml，患者為0.9ng/ml。而且，從剛發展成疾患之後的患者和梗塞面積更大的患者採集的血清樣本中，MK濃度趨向於更高。這些現象被認為是由局部缺血區附近被瞬時表達的MK的循環引起的。
最近報導在由外傷、局部缺血等導致的神經損傷中，各種不同神經營養因子的表達提高了(Frautschy，S.A.等《腦研究》553291，1991；Haynes，L.W.《神經生物學》2263，1988)。這些神經營養因子可能參與了神經損傷的修復機理，並直接地或間接通過膠質細胞作用於神經細胞，在其存活和修復中起到重要作用。
基於這些報導，本發明人利用腦缺血的實驗模型，檢查了MK的機理是否象其他神經營養因子一樣參與修復神經損傷。將MK從心室內注射到該模型的蒙古沙土鼠中，為了在形態學上檢查MK對海馬CA1區蛻膜脫落的抑制作用，分別在造模手術之前和之後給藥。由於蒙古沙土鼠內部頸動脈和椎骨動脈系統的吻合在八周後回縮，因此易於製備良好的不完全前腦缺血模型，方法是用夾子阻塞兩側共有頸動脈流通三至五分鐘，通過局部缺血後的再灌注，導致特定部位(海馬CA1區)神經細胞變性(延遲的神經細胞死亡)48至72小時。因此，蒙古沙土鼠的瞬間性前腦缺血模型可用於評估缺血腦的保護因子(Kirino，T.等《腦研究》23757-69，1982；Mitani，A.等《神經科學快報》131171-174，1991)。
在局部缺血手術前將MK心室內注射到蒙古沙土鼠中，以檢查其對缺血腦的保護作用。從蒙古沙土鼠前囟開2mm深的孔，將含有MK(0.063，0.125，0.25，0.5，1.0和2.0μg)、PTN(0.5，1.0和2.0μg)或bFGF(1.0和2.0μg)的生理鹽水心室內注射到動物中，bFGF已知對缺血腦具有保護作用，用作對比。四分鐘後，結紮兩側共用頸動脈以阻止循環五分鐘，造成瞬間性缺血前腦模型。循環重新開始九十六小時或七天後，切除腦，灌注4％多聚甲醛進行固定。從如此製備的石蠟塊取5μm厚切片，用蘇木精曙紅染色，計數每1mm左海馬CA1區的可見神經細胞數。如表1和2所示，與對照組(注射生理鹽水)相比，MK(0.5μg或以上)給藥組和PTN(2.0μg或以上)給藥組顯著抑制了海馬CA1神經細胞的蛻膜脫落。與對照組相比，濃度為2.0μg或以上的bFGF顯著抑制了海馬CA1神經細胞的蛻膜脫落。這些結果說明，前述MK或PTN的心室內給藥能夠抑制(預防)由缺血和隨後灌注導致的腦細胞損傷。
另外，將MK在局部缺血手術後對蒙古沙土鼠心室內給藥，以檢查其對缺血腦的保護作用。以上述相同方式建立瞬間性前腦缺血後，重新開始血循環，48小時後，以上述相同方式心室內注射MK。在注射後第七天，類似於上述製備5μm厚切片，用蘇木精曙紅染色，計數每毫米左海馬CA1神經細胞面積的可見神經細胞數。每mm海馬觀察到大約160個可見神經細胞(實施例1.2)。可見細胞數約等於將0.5μg MK在局部缺血手術前給藥。
記憶或學習等高水平精神活動無疑是人精神活動的基礎。因此，能夠減少記憶和學習障礙的藥物研製已經成為神經科學最感興趣的任務之一。已知的記憶或學習障礙的實驗模型有很多，其試驗方法極為不同。一種經常使用的試驗是用小鼠進行的被動性逃避學習試驗。
在實現本發明的過程中，本發明人闡明，與對照相比，MK或PTN在瞬間性前腦缺血手術之前或之後一定時期內的心室內給藥顯著抑制了海馬CA1神經細胞的蛻膜脫落。而且據報導，遞減型被動性逃避學習試驗中海馬神經細胞數與反應滯後時間的延長密切相關(Araki，H.等《生理學與行為》3889-94，1986；Sano，A.等《生物化學與生物物理學研究通訊》204994-1000；Wen，T.-C.等《神經科學》65513-521；Wen，T.-C.等《神經科學快報》19155-58)。因此，在施以局部缺血之前或之後心室內注射MK或PTN可以改善反應滯後時間。
海馬CA1神經細胞最容易受到腦缺血和隨後灌注的損傷這一事實，在局部缺血之前或之後注射MK或PTN的動物組與對照組相比，海馬CA1神經細胞的蛻膜脫落被顯著抑制這一實驗結果，以及MK或PTN改善了遞減型被動性逃避學習試驗的反應滯後時間這一報導，都說明MK或PTN預期可用於預防和治療由腦缺血和隨後灌注導致的神經細胞損傷，用於改善精神疾患，這是這些藥物的最終目的。
另外，下列實施例3揭示，在局部缺血應激反應和其他應激反應、如外傷應激反應導致的神經細胞損傷的情況下，MK響應於該損傷早期在損傷部位附近被表達。
因此，MK或PTN通過下列作用可用於預防或治療各種顱神經疾患，直接預防由基本因素導致的神經細胞全體或特定區域機能障礙、變性和細胞死亡，這些因素例如局部缺血、外傷和衰老，或者沒有可說明的因素，並刺激損傷神經細胞的再生。另外，MK與bFGF等其他具有不同作用機理的神經營養因子結合使用，可以產生協同或附加的保護作用，以預防由局部缺血或應激反應導致的神經細胞死亡。所治療的具體疾患可以包括腦梗塞、瞬間性腦缺血、腦血管痙攣引起的蛛網膜下出血後遺症等腦病、老年性痴呆和心搏停止後回生時發生的腦病。
本發明人通過結紮大鼠左下行冠狀動脈，也建立了實驗性心梗模型，利用免疫組織化學染色法檢測MK在心細胞內的表達(Obama，H.等《抗癌研究》18145-152，1998)。結果顯示，在大多數正常心臟的心細胞內沒有觀察到MK的表達，但在若干面對心室位置的心細胞內觀察到了MK的表達(圖4和5)。相形之下，在心梗模型心臟的右心室(RV)壁、隔膜和面對右心室的左心室(LV)壁心內膜上觀察到了強烈的MK表達(圖6)。左心室壁上其他對應於細胞死亡區的面積沒有被染色。這種MK染色的特異性是得到確認的，因為用抗MK抗體吸收MK後，MK染色消失(圖7)。因此，本發明人從免疫組織化學上證實了心梗中獨特的MK表達。令人驚奇的是，不僅在鄰近左心室梗塞部位的區域，而且在整個RV和隔膜的大部分面積，都觀察到了顯著加強的MK染色(圖6)。
用一條清楚的線劃分染色區和未染色區，這條線相當於冠狀動脈區之間的界線。有趣的是，心梗模型中MK的表達模式與同一模型中bFGF的表達模式不同(圖中沒有表示)。
對梗塞模型中MK表達的更深入檢查揭示了RV(圖8)和隔膜(圖9)中MK染色的外觀(用箭狀物和箭頭表示)。隔膜被放大了，在毛細管或面對毛細管內皮(

圖10)的心肌細胞半影觀察到了強烈的染色。心肌細胞內部也被強烈地染色了(用星號表示)。通過隔膜與LV之間的界線明顯區分開染色區和未染色區(圖10)。如上所述，除了心內膜心肌細胞以外，在LV中僅觀察到輕微和不均勻的MK染色(圖12)。
用RNA印跡分析法比較梗塞模型和正常大鼠的RV和隔膜中的mRNA表達，結果揭示，在梗塞模型大鼠中可檢測到mRNA水平升高。除了1.0kb MK mRNA以外，還檢測到一條與MK cDNA反應的1.8kb帶。該1.8kb帶可能是MK mRNA的異構形式(isoform)。這些結果說明，mRNA轉錄活性的穩定上升導致在發生梗塞後不久的心臟內MK免疫反應性升高。
在結紮大鼠左前冠狀動脈(LAD)導致的心肌梗塞中，MK表達顯著增強。這種增強歸因於MK mRNA的升高，發生在早期、梗塞後的六個小時內。儘管大面積梗塞心臟都有MK表達，不過在細胞死亡區沒有檢測到其表達，這說明MK參與受損心組織的修復。
如上所述，MK在腦梗塞後不久的壞死部位附近的水腫區被表達，考慮到這一事實，MK的表達說明了它可能參與不同病理學條件下的修復或癒合過程。實際上已經證實，MK預先給藥可預防由連續接受光刺激導致的視網膜變性(Unoki，K.等《眼科學研究與視覺科學》354063-4068，1994)。
bFGF表達與心肌梗塞有關，具有心保護作用(Speir，E.等《循環研究》71215-259，1992)。不過，本發明人能清楚地證明，在我們選擇的實驗條件下，MK比bFGF被更多地表達。MK和bFGF共同提高主動脈內皮細胞纖溶酶原激活物的活性(Kojima，S.等《生物化學雜誌》2709590-9596，1995)。它們也增強牙間質細胞的增殖(Mitssiadis，T.A.等《細胞生物學雜誌》129267-281，1995)。因此，它們也可以在修復受損心組織中一齊發揮作用。
另外，本發明人發現，MK也在心肌細胞內被微弱表達，在正常心臟心內膜內被高度表達。MK的這種局部表達類似於bFGF(Speir，E.等《循環研究》71215-259，1992)，但是它們在梗塞後表達的提高模式彼此不同。在正常心肌細胞內，bFGF被認為是參與促進DNA的合成、刺激存活、延緩衰老和調節細胞外基質的移行和產生(Speir，E.等《循環研究》71215-259，1992)。MK也可能在心臟內起到類似作用。心梗後MK的表達不僅在鄰近梗塞區域、而且在梗塞區域遠側的面積都被增強了。不僅在心室內，而且在心房壁，都檢測到了這種增強的MK表達。
從這些事實可以明顯看出，MK在心臟的啟動和修復中都起到重要作用，這說明了MK表達或信號轉導系統的異常可能導致多種疾患，包括心臟病。因此，MK被認為可作為用於預防或治療缺血性心臟病的藥物，例如引起心肌壞死的心肌梗塞，由冠狀動脈梗阻或血液循環的急性減少所引起。而且，MK或PTN作為藥物，可用於預防或治療一組由細胞病導致的其他局部缺血和應激反應疾患，例如由消化道循環障礙導致的缺血性結腸炎或腸繫膜動脈閉塞。
本發明的用於治療或預防由局部缺血導致的細胞病疾患的MK或PTN優選地是一種人重組MK或PTN，或具有其生物活性的部分肽片段。天然MK是沒有被糖基化的；因此未糖基化的MK是本發明所優選的。該MK包括由121個胺基酸殘基組成的人MK，但是它的胺基酸序列並不限於此(Muramatsu，T.《Develop.Growth Differ.》361-8，1994)。
在小鼠MK中，一種信號肽從由139個胺基酸殘基組成的前體蛋白中斷開，得到成熟的MK(由118個胺基酸殘基組成，分子量為13kDa)。這些胺基酸殘基中有三十個是鹼性胺基酸，10個是半胱氨酸殘基。由半胱氨酸殘基形成的五個二硫鍵構成N端和C端兩個結構域。這兩個結構域的生物化學性質和生物學性質是不同的，可能在體內功能表達上起到不同作用。C端側的肝素結合能力高於N端側(Muramatsu，H.等《生物化學與生物物理學研究通訊》2031131，1994)。軸突分枝和纖維蛋白溶解刺激能力主要結合在C端(Muramatsu，H.等《生物化學與生物物理學研究通訊》2031131，1994；Kojima，S.等《生物化學與生物物理學研究通訊》206468，1995)。因此，MK固有的具有生物活性的部分多肽片段也包括在本發明內。
利用重組DNA技術，人MK胺基酸序列中的特定胺基酸能夠容易地被刪除、插入或取代，以增強本發明藥物的活性或提高其安全性。例如，特定部位的胺基酸可以用其等價胺基酸在化學上取代。具體地說，疏水性胺基酸(例如Ala)既可以用另一種疏水性相當的胺基酸(例如Gly)取代，也可以用疏水性較高的胺基酸(例如Val、Leu或Ile)取代。同樣，帶負電的胺基酸殘基可以用另一種胺基酸取代(例如用Glu替換Asp)，或者帶正電的胺基酸殘基可以用另一種胺基酸取代(例如用Arg替換Lys)。另外，由於MK的C端一半具有軸突分枝能力，並含有肝素結合部位，例如從C端計算的第60-121位(C-半側60-121)或第62-104位(C-半側62-104)(Muramatsu，H.等《生物化學與生物物理學研究通訊》2031131-1139，1994)，因此它們可用於本發明的藥物。而且，希望疏水性胺基酸轉變為帶電胺基酸，只要這種轉變不會對MK的生物活性產生不利影響。本領域技術人員能夠進行上述修飾，以使MK具有優選的生物活性。由於蛋白酶的攻擊和不必要受體的幹擾，MK和PTN不能表現出它們的功效，象蛋白質藥物通常也不能表現一樣。因此，通過與聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖等綴合，可以提高MK和PTN的體內穩定性。例如，與PEG雜化的IL-6成功地延長了IL-6在血流中的停留。本發明也包括這種化學修飾的MK和PTN。
本文所用的術語「米達克因」或「MK」包括所有這些被修飾和被轉變的MK，只要它們保留了MK的原有生物活性。本文所用的術語「MK族」包括屬於該族的所有這些被修飾和被轉變的蛋白質(MK和PTN)，只要它們具有固有的生物活性。
本發明的MK族蛋白質可以直接給藥，用於預防或治療腦梗塞、心肌梗塞、缺血性結腸炎、上部腸繫膜動脈閉塞等。或者，也可以利用已知的藥物製備方法配製成包含該活性成分的藥劑。例如，可以配製成適用於對人有效給藥的藥物製劑，包括注射劑、鼻吸入製劑、經皮吸收劑、口服劑等，優選為注射劑。將製劑與藥學上可接受的載體或介質一起給藥，例如無菌水、生理鹽水、植物油(例如芝麻油、橄欖油等)、著色劑、乳化劑(例如膽固醇)、分散劑(例如阿拉伯膠)、表面活性劑(例如聚氧乙烯氫化蓖麻油表面活性劑)、加溶劑(例如磷酸鈉)、穩定劑(例如糖、糖醇和白蛋白)、防腐劑(對羥基苯甲酸酯)等。所提供的注射劑可以是冷凍乾燥物、水溶液和密封在滲透壓泵中的產物的形式。本發明的藥物製劑含有MK或PTN，它直接作用於腦實質和心肌細胞，發揮其功效。因此，不象常用的腦代謝刺激劑和腦循環改善劑等針對疾病的(nosotrophic)藥物那樣，本發明製劑可用於治療各種顱神經疾患，通過直接預防由基本因素(例如局部缺血、外傷和衰老，或者沒有可說明的因素)導致的神經細胞全體或特定區域機能障礙、變性和壞死，以及通過刺激損傷神經細胞的再生進行治療。
上述疾患可以利用基因療法進行治療，利用MK或PTN基因的啟動子區域，增強MK或PTN在局部缺血性疾病部位內的表達。
本發明藥劑可以注射給藥，每日劑量例如約為0.001至100μg/kg的MK或PTN蛋白，分一至六次動脈內、靜脈內、肌內、皮下、心室內或脊柱內注射。也可以通過向心室內和腦膜內插入導管，將該藥劑直接給藥。或者，可以將其加入到滲透壓泵中，通過植入體內的該泵連續給藥。
據報導，通過頸動脈注入甘露糖醇、尿素等的高滲溶液，可瞬時提高血-腦屏障的透過性(《美國國家科學院院報》76481-485，1979)，以及某些物質(即烷基甘油)促進其他藥物的腦內傳遞。本發明的藥劑也能用這些技術給藥。而且，已經報導了通過某些機理腦內攝取陽離子化的白蛋白的可能性(《臨床研究雜誌》70289-295，1982)。MK或PTN蛋白可以在用這樣一種方法進行化學修飾後給藥。
附圖的簡要說明圖1代表用乾冰處理後兩天的腦細胞顯微照片(x10)。A表示乾冰處理導致梗塞面積內的細胞，其周圍用蘇木精曙紅染色(H-E染色)。B表示H-E染色的、嚴重損傷的梗塞面積圖象。C表示用抗MK抗體染色的類似於B的面積圖象。
圖2代表用乾冰處理後兩天的腦細胞顯微照片。D是梗塞面積附近與抗MK抗體反應的細胞放大視圖(x50)。E表示用TUNEL法進行編程性細胞死亡染色(使用TaKaRa原位編程性細胞死亡檢測試劑盒)的類似於D的面積。觀察到TUNEL反應陽性細胞在核斷裂後導致編程性細胞死亡。
圖3代表頭外傷模型大鼠的腦細胞照片。A、C和E用H-E染色。B、D和F是對應於A、C和E的用抗MK抗體染色的圖象。A和B的放大率是25倍，C、D、E和F的放大率是100倍。
圖4是表示MK在正常心臟內的分布的顯微照片。
圖5是表示MK在正常心臟內的分布的顯微照片。
圖6是表示在左前下行冠狀動脈梗阻後，MK在大鼠心臟內的分布的顯微照片。
圖7是表示在左前下行冠狀動脈梗阻後，MK在大鼠心臟對照物內的分布的顯微照片。
圖8是表示在心肌梗塞形成後六小時，MK在大鼠心臟右心室壁上的分布的顯微照片。
圖9是表示在心肌梗塞形成後六小時，MK在大鼠心臟隔膜內的分布的顯微照片。
圖10是表示在心肌梗塞形成後六小時，MK在大鼠心臟隔膜與心室壁分界區域內和具有梗塞部位的左心室壁內的分布的顯微照片。
圖11是表示在心肌梗塞形成後六小時，MK在大鼠心臟隔膜內的分布的顯微照片。
圖12是表示在心肌梗塞形成後六小時，MK在大鼠心臟左心室壁內的分布的顯微照片。
圖13是表示在心肌梗塞形成後六小時，MK在大鼠心臟左心室心內膜內的分布的顯微照片。
圖14表示心肌梗塞患者血清內MK濃度的定期測量結果。
圖15表示腦梗塞患者血清內MK濃度的定期測量結果。
實施發明的最佳方式實施例1用瞬間性前腦缺血模型評估缺血腦保護性物質1.1局部缺血手術前缺血腦保護性物質的給藥1.1.1MK對缺血腦的保護作用按照日本特許出願公報(JP-A)平9-95454實施例1所述的方法製備人的重組MK，用在實施例1.1.2和實施例1.2中。將每組6至16隻雄性蒙古沙土鼠(六至八周齡，重60至80g)置於氟烷(日本藥典中的滷烷)麻醉的飼餵系統「HONEY MATIC M-3」(KIMURA MEDICALINSTRUMENT LTD.)中，在容器中裝入適量吸入麻醉劑氟烷進行麻醉。將蒙古沙土鼠固定在手術臺上，手術臺配有吹入器(NARISHIGESCIENTIFIC INSTRUMENT LAB.TYPE SR-5N，No.97024)支架。沿中線切開頭部，用牙鑽在離對著左眼球側的前囟2mm處開一個適當大小的孔，用於插入注射器。通過這個孔，用微量調節注射器(HAMILTONMICROLITER #701)向心室內注射2μl MK的0.5mg/ml、1mg/ml或2mg/ml溶液(0.5μg，1.0μg，2.0μg)(在生理鹽水中)。準備鹽水(日本藥典，生理鹽水，Otsuka生理鹽水注射液，Otsuka Pharmaceutical)給藥組和假手術組(Sham-op)作為對照組。將這些溶液注入心室內後，離開動物4分鐘，再縫合手術部位。沿中線切開胸部，暴露右和左共用頸動脈。兩側動脈用「第23號動脈Kremmer直線」結紮，以中止血流5分鐘，然後允許血液再次循環起來。在施加局部缺血過程中，腦溫和體溫保持恆定(37±2℃)。從麻醉狀態恢復後，將動物個體分開，放入看護籠中。飼餵動物，並允許自由飲水和進食。96小時後，灌注含有0.2％肝素(NovoHeparin Injection 100；Japan Hoechet Marion Russell，LTD.)和4％低聚甲醛的鹽水，對動物進行固定。用剪刀剪下頭部，切除腦，浸入4％低聚甲醛固定液中一天。將含有背側海馬的組織脫水和穿透，埋在石蠟中。
發明人從石蠟塊中製備了5μm切片，相當於從海馬尖開始0.5至1.0mm或從矢狀縫後面開始1.4至1.9mm，用蘇木精曙紅染色(H-E染色)。利用該組織製劑，用單側型曲線計測量五次海馬CA1的長度，計算平均值。在200倍放大率下計數海馬區內左海馬的錐體細胞(神經細胞)，結果除以上述平均值，計算每mm海馬CA1的可見神經細胞數。結果如表所示。
表1

*p＜0.05(多Dunnett比較)如表1清楚地所示，以0.5μg或以上的單劑量給藥的MK顯著預防了海馬CA1區內的延遲神經細胞死亡。
1.1.2MK的缺血腦保護作用與其他缺血腦保護因子的比較每種缺血腦保護因子以每次2μl劑量心室內給藥。兩側共用頸動脈分別用Sugita腦動脈瘤夾(標準型；MIZUHO)結紮。一周後灌注，對腦進行固定。除了這三項變化以外，進行本實驗的方式同1.1.1。從R DSystems(Funakoshi)購買重組人多效蛋白(PTN)和重組人鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。它們的劑量，PTN是2μg、1μg和0.5μg，bFGF是2μg和1μg。結果如表2所示。
表2

*p＜0.05，***p＜0.001(多Dunnett比較)本例也假定MK發揮統計學上顯著的缺血腦保護作用的劑量是0.5μg或以上，這與1.1.1所得大致相同。儘管在0.125μg的劑量下，比生理鹽水給藥組有更多的神經細胞存活，不過在統計學上差異是不顯著的。PTN發揮統計學上顯著的缺血腦保護作用所需的劑量大約是2μg，這約是MK的四倍。據報導對保護缺血腦有效的bFGF(Nakata，N.等《腦研究》605354-356，1993)在2μg劑量下發揮統計學上顯著的缺血腦保護作用，但是在該劑量下的可見神經細胞數小於在相等劑量MK下得到的細胞數的大約一半。從這些結果可以明顯看出，MK作為由局部缺血導致的顱神經細胞死亡的抑制劑顯示出對蒙古沙土鼠瞬間性缺血前腦模型的缺血腦保護作用，該作用相當於用已知缺血腦保護因子所得的作用，例如prosaposin、睫狀神經營養因子(CNTF)和白細胞介素6(lL-6)。
1.2繼發局部缺血手術再灌注的預定時間後使用缺血腦保護因子除了在局部缺血手術繼發再灌注的48小時後使用MK以外，本實驗的進行方式完全同1.1.2。當用2μg MK給藥時，48小時後的可見海馬CA1神經細胞數為160個細胞/mm海馬。這大致等於1.1.2中0.5μg劑量下所得的數字。該結果揭示，MK在繼發瞬間性腦缺血再灌注後一定時間內給藥能夠有效保護缺血的腦。
如上所證實，MK族蛋白質發揮缺血腦保護作用的機理可能不同於已知蛋白質缺血腦保護因子。最近已有報導，由外傷、局部缺血等導致的神經損傷引起各種神經營養因子的表達和增加。人們假定，這些神經營養因子參與了神經損傷的修復機理，並直接地或間接通過膠質細胞作用於神經細胞，在其存活和恢復中起到重要作用。因此，結合使用MK和其他神經營養因子預期能夠達到協同或附加作用。
實施例2MK在乾冰腦損傷(冷損傷)模型內的表達使用十隻雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)(體重160g)。腹膜內注射4％水合氯醛(10ml/kg)進行麻醉。用剪刀剪開頭皮，將7mm×10mm大小(約2mm厚)的乾冰壓在頭蓋骨上10秒鐘。然後縫合頭皮，再次飼餵動物，允許自由飲水和進食。在乾冰處理後的第1、2、4、7和14天，兩隻大鼠通過腹膜內注射4％水合氯醛(10ml/kg)進行麻醉，灌注含有0.2％肝素(Novo Heparin Injection 100；Japan Hoechet Marion Russell，LTD.)和4％低聚甲醛固定液的生理鹽水(日本藥典，生理鹽水，Otsuka生理鹽水注射液，Otsuka Pharmaceutical)進行固定。完全固定後，動物斬首。用剪刀取出腦，泡在4％低聚甲醛固定液中。固定24小時後，充分固化的腦用雙緣剃刀(FEATHER)從前端分成四片。將可以觀察到梗塞面積的組織切片脫水、穿透，用自動包埋機埋入石蠟中。由該石蠟塊製備5μm厚切片。將這些石蠟切片進行1)蘇木精曙紅染色(H-E染色)，2)抗MK抗體染色(兔抗小鼠MK多克隆抗體)，和3)編程性細胞死亡檢測。
圖1是用乾冰處理後兩天的、用H-E或抗MK抗體染色的腦細胞顯微照片(x10)。A代表乾冰引起的梗塞病灶及其附近的細胞，B代表嚴重損傷的梗塞病灶，C代表用抗MK抗體染色的類似於B的面積。C(抗MK抗體染色)中，在梗塞面積附近觀察到高水平的MK表達。
圖2是用乾冰處理後兩天的、用抗MK抗體染色或染色用於進行編程性細胞死亡檢測的腦細胞顯微照片(x10)。D代表梗塞面積附近與抗MK抗體反應的細胞放大視圖(x50)。E代表類似於D的梗塞面積附近的細胞顯微照片，用TUNEL法進行檢查(使用TaKaRa原位編程性細胞死亡檢測試劑盒)，以測定是否導致編程性細胞死亡。可以檢測到核斷裂和TUNEL反應陽性的細胞。如圖2所示，梗塞病灶染色越微弱，細胞受到的損害越大。
實施例3MK在大鼠腦損傷模型內的表達實施例2檢查了由局部缺血導致的腦梗塞模型內的MK表達。本例中，製備由機械應力導致的梗塞模型，以檢查其中的MK表達。使用十隻雄性SD大鼠(體重320g)。腹膜內注射4％水合氯醛(10ml/kg)進行麻醉。切除腦皮質製備腦損傷模型。用剪刀剪開頭皮，在沿冠狀縫對著左眼3mm處和沿矢狀縫對著枕部3mm處切除直徑4mm、厚3mm的腦皮質部分。使用Dispopunch(一次性皮膚環鑽)(Stiefel Laboratries)進行切除。確認切除完全後，縫合頭皮，再次飼餵動物，允許自由飲水和進食。在製備腦損傷模型後的第1、2、4、7和14天，從兩隻大鼠製備5μm厚切片，方法類似於實施例2。製備石蠟切片，用H-E和抗小鼠MK抗體染色。製備腦損傷模型後第1天所得結果如圖3所示；符號A、C和E代表H-E染色，符號B、D和F代表抗MK抗體染色。實驗人員證實，MK非常迅速地對機械損傷作出反應。H-E染色的組織圖象A、C和E表示，機械損傷對腦細胞造成巨大損害。抗MK抗體染色的組織圖象B、D和F顯示了很多抗體染色陽性的細胞，它們主要存在於痔面積附近和腦細胞高度損害的面積內，後者面積相當於A、C和E中的染色面積。這些結果清楚地證明，即使在神經細胞受到由局部缺血應激反應和機械應激反應導致的損傷的情況下，MK響應於損傷早期，在損傷面積附近被表達。
實施例4MK在心肌梗塞模型內的表達4.1心肌梗塞模型的製備按照Fine，G.等的方法(Fine，G.，Morales，A.和Scerpella，J.R.《病理學文獻》824-8，1966)，結紮左前下行冠狀動脈(LAD)，在Wistar大鼠(7周齡，雄性)左心室壁上製備實驗性心肌梗塞。結紮後六小時，處死大鼠，立即切除心臟進行分析。為了確認心肌細胞的活力(Fishbein，M.C.等《美國心臟雜誌》101593-600，1981)，發明人用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，測量了心肌梗塞的面積和大小。
4.2MK、抗MK抗體和抗bFGF抗體按照Take，M.等的方法(Take，M.等《生物化學雜誌》1161063-1068，1994)，製備MK和親和純化的兔抗小鼠MK抗體。親和純化的抗MK抗體的特異性幾乎與Muramatsu等所述抗體相同(Muramatsu，H.等《發展生物學》159392-402，1993)。在蛋白質印跡分析中，該抗體與MK反應，但不與PTN反應。MAb52(Wako Pure Chemicals)用作小鼠抗人bFGF單克隆抗體。該抗體識別大鼠bFGF(Takami，K.等《實驗腦研究》901-10，1992)。
4.3免疫組織化學分析取大鼠心室區的水平截面，在心室溫下固定在中性緩衝液-福馬林固定液中，埋入石蠟中，切成5μm厚切片。脫石蠟後，將切片在含有0.3％過氧化氫溶液的100％甲醇中培養30分鐘，以阻滯內源性過氧化酶。向切片中加入牛血清白蛋白(1％)，切片繼續培養30分鐘。為了檢測MK，將這些切片與親和純化的兔抗MK多克隆抗體(8μg/ml)在4℃下培養過夜。將切片與生物素化的山羊抗兔IgG抗體(Vector LaboratoriesCorp.，California)培養30分鐘，然後與生物素化的鹼性磷酸酶-鏈黴抗生物素蛋白複合體(Dako，Giostrup，Denmark)培養30分鐘。為了檢測bFGF，將切片與小鼠抗bFGF單克隆抗體(5μg/ml)在4℃下培養過夜，然後與生物素化的兔抗小鼠抗體(Vector Laboratories Corp.，California)培養30分鐘，進一步與生物素化的鹼性磷酸酶-鏈黴抗生物素蛋白複合體(Dako，Giostrup，Denmark)培養30分鐘。用固紅TR/萘酚(Sigma，St.Louis，MO)目測檢驗免疫反應。用蘇木精進行復染色。MK免疫染色的特異性的測定方法是，使重組MK吸收抗MK抗體，對所得複合體進行肝素-瓊脂糖親和色譜(Yasuhara，O.等《生物化學與生物物理學研究通訊》192246-251，1993)。
結果如圖4至13所示。
圖4至7是表示左前下行冠狀動脈閉塞後大鼠心臟內MK的可染色性增強的顯微照片。圖4和5代表正常的、免疫組織化學染色的大鼠心臟，其中MK在某些面對心室的心肌細胞內被表達。在其他隔膜的心肌細胞內檢測到弱免疫反應。不過，大多數心肌細胞幾乎不表達MK。圖6是表示心肌梗塞形成後六小時的大鼠心臟的顯微照片。在隔膜(SE)、右心室壁(RV)和左心室壁(LV)的心內膜內(箭狀物所示面積)檢測到強烈的MK染色。左心室壁與隔膜之間的免疫染色差異是非常明顯的。染色區和非染色區被一條清楚的界限分開，該界限相當於向這些區域供應養分的各冠狀動脈的分界區。LV的細胞死亡區內的心肌細胞沒有被染色。梗塞部位心臟內所觀察到的MK表達模式與同一心臟內bFGF的表達模式不同。圖7是表示用中和抗MK抗體染色的對照物的顯微照片。由於細胞在用中和抗MK抗體處理後沒有被染色，確認MK被這種方法特異性地染色。圖中所示的條在圖4、6和7中代表1500μm，在圖5中代表150μm。
圖8至13是表示心肌梗塞形成後六小時的大鼠心臟內詳細MK表達的顯微照片。在右心室壁(圖8)、隔膜(圖9和11)、隔膜、梗塞面積的心室壁與左心室壁之間的界限區(圖10)、左心室壁(圖12)、和左心室內的心內膜(圖13)內檢測到了MK的免疫組織化學染色。在心肌細胞(圖11和13中星號所示部分)和面對內皮細胞的心肌細胞或內皮細胞本身的半影(箭狀物和箭頭所示部分)內觀察到了MK的免疫反應。在高倍放大的隔膜顯微照片(圖11)中，面對血管的心肌細胞或血管內皮細胞的半影內的MK被強烈地染色了。心肌細胞內部(圖13)也被強烈地或適度地染色了(星號所示部分)。隔膜與LV之間的界限清楚地分開了非染色區和染色區(圖10)。圖中所示的條在圖8、9和10中代表200μm，在圖11、12和3中代表50μm。
實施例5梗塞患者血清中MK的測量利用JP-A平10-160735所述的EIA系統，發明人測定了心肌梗塞患者和腦梗塞患者血清中的MK濃度。將每份從患者收集來的血清樣本以3000rpm離心15分鐘(在室溫下)。這些血清貯藏在-80℃下。圖14表示定期測量心肌梗塞患者血清中的MK濃度的樣本。在心肌梗塞形成後較早階段，MK被表達。其在血液中的濃度升高並在形成後12小時達到峰值。24小時後降至形成後六小時的相同水平，31小時後降至約0.16ng/ml，這是正常受試者的平均水平。這種心肌梗塞形成後血液中MK濃度的變化大概是MK所獨有的。這種心肌梗塞與MK之間、包括MK在早期梗塞半影內的表達之間的相互關係，說明MK參與了心肌的修復機理。圖15表示腦梗塞患者血清中的MK濃度。在腦梗塞的情況下，也發現患者血液中的MK濃度非常高，患者的血樣是在腦梗塞形成後早期收集來的，例如圖15A、D、E和F。這些資料是研究的興趣所在，事實是在個體水平上，腦梗塞形成後早期的梗塞面積附近檢測到了大量MK。
工業實用性根據本發明的midkine族蛋白質或其部分肽對治療或預防由局部缺血導致的細胞病、或由所述細胞病引起的局部缺血性疾病是有效的。例如，這些蛋白質作為藥物是有效的，用於治療或預防腦血管疾患，例如蛛網膜下出血繼發的腦血管痙攣、阿耳茨海默氏病、阿耳茨海默型老年性痴呆、腦血管老年性痴呆等，以及腦梗塞、瞬間性局部缺血性疾病和頭外傷，和其他腦血管疾病，例如帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病、肌萎縮性退化疾患等。而且，這些蛋白質預期作為藥物，用於治療或預防局部缺血性疾病，例如心肌梗塞或心絞痛；缺血性結腸炎；上部腸繫膜動脈梗阻等。
另外，這些蛋白質預期能夠用在基因療法中，活化MK和PTN的基因啟動子，以在缺血部位表達MK和PTN。
權利要求
1.一種藥劑，用於治療或預防由局部缺血或應激反應導致的細胞病，該藥劑包含一種米達克因(MK)族蛋白質作為活性成分。
2.根據權利要求1的藥劑，其中所述的由局部缺血或應激反應導致的細胞病發生在腦實質。
3.根據權利要求2的藥劑，其中所述的腦實質是海馬CA1區中的錐體細胞。
4.一種藥劑，用於治療或預防由細胞病導致的疾病，該細胞病是由局部缺血或應激反應引起的，該藥劑包含一種米達克因(MK)族蛋白質作為活性成分。
5.根據權利要求4的藥劑，其中所述的由局部缺血引起的疾病是腦梗塞。
6.根據權利要求4的藥劑，其中所述的由局部缺血引起的疾病是心肌梗塞。
全文摘要
本發明提供了用於治療或預防由局部缺血導致細胞損傷的藥劑,該藥劑包含米達克因(midkine)族蛋白質作為活性成分;還提供了用於治療或預防局部缺血性疾患的藥劑,該藥劑包含米達克因族蛋白質作為活性成分。米達克因對治療或預防局部缺血性疾患和由局部缺血導致的細胞損傷是有明顯療效的;例如能夠顯著地預防腦梗塞的形成,它是缺血性腦疾患的典型代表。本發明的這些治療和預防藥劑對下列腦缺血性疾患是有效的,例如腦梗塞、瞬間性腦缺血性疾病和頭外傷,另外對治療和預防蛛網膜下出血繼發的腦血管痙攣、阿耳茨海默氏病、阿耳茨海默型老年性痴呆和腦血管老年性痴呆等以及其他腦血管疾病、帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病和肌萎縮性退化疾患等均是有效的。
文檔編號A61K38/18GK1278184SQ98810868
公開日2000年12月27日 申請日期1998年9月25日 優先權日1997年9月26日
發明者吉田義弘, 池松真也, 佐久間貞俊, 小田宗宏 申請人:吉田義弘, 明治乳業株式會社