通過抑制腸內膽固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的組合物的製作方法

2023-07-22 09:32:31 2

專利名稱：通過抑制腸內膽固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於抑制高脂血症和肥胖症的組合物。更具體而言，本發明涉及通過遏制腸內膽固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的組合物。
背景技術：
膽固醇已知是誘發冠心病的因素，已知冠心病佔目前所有死因的30%以上。心血管疾病據認為是脂肪攝入高且肥胖人群大的發展中國家的疾病，在韓國其發病率由於伴隨經濟水平發展的飲食西方化、缺乏鍛鍊、工作過勞等快速增加。特別是，涉及 血中膽固醇運載的低密度脂蛋白(LDL)被認為是特定的動脈硬化的誘發因素，並且氧化的LDL已知顯示出有力的動脈硬化誘發活性。同時，肥胖症通常認為是消化不良和消耗後剩餘的殘餘卡路裡轉化為脂肪細胞並存儲在身體各部位，特別是皮下組織和腹腔的現象。肥胖症的原因包括遺傳因素、環境因素和能量代謝失調等。肥胖症的類型根據發病原因可以劃分為單純性(原發性)肥胖症和症狀性(繼發性)肥胖症。大多數肥胖症患者為單純性(原發性)肥胖症，並且已知由於其體內卡路裡攝入過多和缺乏卡路裡消耗而導致的過剩能量累積為脂肪所致。症狀性(繼發性)肥胖症已知由甲狀腺機能減退、腎上腺皮質激素過度分泌和多囊卵巢症候群等疾病，或口服避孕藥、鎮靜劑、類固醇激素和含有抗組胺成分的藥物等藥物引起。肥胖症由於脂肪組織的腹部壓力而引起便秘、消化不良、胃腸障礙，引發如糖尿病、高血壓、動脈硬化、心臟病和癌症等成人疾病及其併發症，以及精神疾病,如與身體有關的不滿、焦慮、人格障礙和抑鬱。即，肥胖症是各種疾病的誘因。因此，需要減少身體內吸收的膽固醇的量，從而預防心血管疾病和作為各種疾病誘因的肥胖症。為此，阻斷膽固醇的吸收是最有效的方法。同時，本領域中已知依折麥布(Ezetimibe)是抑制膽固醇吸收的化合物，也被稱為「Zetia」。考慮到需求逐漸增加的與肥胖症相關的市場，需要開發新型替代物。

發明內容
技術問題因此，鑑於上述問題而完成了本發明，本發明的一個目的是開發和提供能夠提供降低腸內吸收的膽固醇的量而抑制或預防高脂血症和肥胖症的組合物。技術方案根據本發明的一個方面，提供了抑制膽固醇吸收的組合物，所述組合物包含作為活性成分的IgY型抗體，所述抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl-樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
根據本發明的另一方面，提供了預防或抑制肥胖症的組合物，所述組合物包含作為活性成分的IgY型抗體，所述抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
根據本發明的又一個方面，提供了預防或抑制高脂血症的組合物，所述組合物包含作為活性成分的IgY型抗體，所述抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的 NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
下面，將更加詳細地描述本發明。
本發明的第一第二和第三方面提供了抑制膽固醇吸收的組合物、預防或抑制肥胖症的組合物和預防或抑制高脂血症的組合物。所有這三個方面均包含作為活性成分的IgY 型抗體，所述抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
由本發明的下述實驗可知，所述IgY型抗體有效抑制了小腸中的膽固醇吸收(抑制機制見圖I)，所述抗體的抗原包含NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
根據上述抑制膽固醇吸收的效果，可以製備所述IgY型抗體並將其用作抑制膽固醇吸收的組合物和預防或抑制由膽固醇的過度吸收引起的肥胖症和高脂血症的組合物，所述抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
並且，本發明所用的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)蛋白是存在於腸內的膽固醇運載蛋白。例如，人類具有序列編號I所示的核酸序列和序列編號2所示的胺基酸序列。NPClLl 已知在小腸內膽固醇吸收中具有重要作用。通過內吞再循環的由NPClLl蛋白進行的膽固醇吸收有助於單向(體內)吸收，並且不受HDL、細胞內膽固醇吸收和血中濃度影響。而且， NPClLl已知可選擇性識別非酯化的游離膽固醇，並促進向肝癌細胞中的單向運載(J.Mark Brown 等，Biochem. J. (2007)406，273-283)。
本發明中，製備了阻斷上述NPClLl作用的抗體，特別是產生並使用了 IgY型抗體， 所述IgY型抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。由於NPClLl (尼曼-匹克Cl樣 I)中的向腔突出的環部分的序列已知，通過生物合成或遺傳重組將該環部分製成肽，並可用作表位。
並且，IgY是卵黃中所含的抗體，並且已知被開發為IgY型的抗體被人體攝入時幾乎不具有副作用。可以通過將抗原注射到雞體內而製備IgY。該方法是本領域中已知的，因此省略了對其的具體說明。
並且，本文所用的術語「活性成分」表示組合物中的膽固醇吸收的抑制效果和對高脂血症或肥胖症的抑制效果源自本發明提供的"IgY型抗體〃，並且表示可以添加除這些成分之外的其他各種輔助成分，從而有助於保存性和吸收。
並且，NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環共有7個，其具有由序列編號4、6、8、10、12、14和16表示的胺基酸序列，並被用作製備抗體的表位。因此，本發明中可用作表位的NPClLl中的向腔突出的環部分中存在的胺基酸序列是由序列編號4、6、8、10、12、14和16表示的胺基酸序列之一。
並且，在本發明中，可以通過將能夠引發抗原性的載體蛋白與NPClLl (尼曼-匹克 Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列結合，從而形成用於製備IgY型抗體的抗原。隨著分子量增加，抗原性可提高。這時，可以使用選自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)中的一個作為引發抗原性的載體蛋白。
有益效果
本發明組合物中作為活性成分所包含的針對NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)的來自卵黃的IgY型抗體與作為小腸中膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)結合，從而幹擾膽固醇和該運載蛋白之間的結合，由此完全阻斷體內膽固醇的吸收，進而預防高脂血症和肥胖症。


通過下述結合附圖進行的詳細描述，可以更清楚地理解本發明的上述和其他目標、特徵和其他優點，其中
圖I是顯示抗NPClLlIgY抑制膽固醇吸收的機制的示意圖2圖示了產生IgY的重組抗原的製備和所製備的抗原的免疫原性的測試結果；
圖3圖示了所產生的重組抗體IgY的電泳結果；
圖4圖示了重組抗體IgY與抗原的結合能力的蛋白印跡結果；
圖5圖示了定量顯示疫苗是否形成抗體IgY的ELISA結果；
圖6圖示了利用!fepG2細胞系確認IgY與NPClLl蛋白結合的體外免疫螢光術結果。該結果通過利用共聚焦顯微鏡以400X放大 倍數觀察獲得；
圖7圖示了確認小鼠小腸組織中IgY與NPClLl蛋白結合的體內免疫組織化學結果。該結果通過利用共聚焦顯微鏡以200X放大倍數觀察獲得；
圖8圖示了確認小鼠小腸組織中IgY與NPClLl蛋白結合的體內免疫螢光術結果。 該結果通過利用共聚焦顯微鏡以200 X放大倍數觀察獲得；
圖9圖示了利用HepG2細胞系的膽固醇攝入抑制測試結果。圖9中，』COM』和』ISA』 表示佐劑的種類，並且ISA表示利用「ISA 70佐劑」製備的抗NPClLl IgY樣品，』COM』表示利用「完全弗氏佐劑(Difco,美國)」製備的抗NPClLl IgY樣品；和
圖10圖示了攝入高膽固醇飼料8周中的體重變化(*;ρ〈0·05，**;ρ〈0·01)。
具體實施方式
下文中，為了進一步了解本發明，而提供了下述實施例。本發明的範圍不限於下述實施例，並且還包括其技術實質等同方式。
製備例I:重組抗原的製備和適合性的確認
下面，克隆由NPClLl的整個胺基酸序列中的胺基酸序號373至634表示的共262 個胺基酸，以使重組抗原具有序列編號4表示的環I (NPC1L1在腔方向上具有的總計7個環中的第2個環)的胺基酸，從而製備重組抗原(下文稱為』蛋白373』)。
另外，克隆由NPClLl的整個胺基酸序列中的胺基酸序號416至635表示的共220 個胺基酸，從而製備重組抗原(下文稱為』蛋白416』)。
另外，克隆由NPClLl的整個胺基酸序列中的胺基酸序號509至633表示的共125個胺基酸，從而製備重組抗原(下文稱為』蛋白509』)。
將用於製備抗原以產生IgY的各克隆DNA序列連接到具有純化用His標籤的 pET-15b載體的Xho I/BamH I克隆位點，然後利用IPTG在大腸桿菌BL21 (DE3)宿主中表達。
過表達後，將DNA序列在His6親和柱上純化，並溶解，用所得重組蛋白進行 SDS-PAGE和蛋白質印記。
此處用於蛋白質印記的抗體是商售抗NPClLl小鼠單克隆抗體和HRP綴合的山羊抗小鼠抗體。
測試結果如圖2所示。結果，過表達和純化的重組NPClLl抗原(蛋白373、416和 509)與來自小鼠的抗NPClLl抗體反應，由此可知，製備出了作為具有主要表位的重組蛋白的NPClLl抗原，其具有產生可抑制NPClLl蛋白功能的抗體性質。
實施例通過重組抗原的免疫接種來製備IgY抗體
(I)疫苗的製備
將上述製備例I中製備的重組肽型抗體型NPClLl抗原與弗氏完全佐劑 (Difco263810,美國)等體積混合，從而製備疫苗。為了根據佐劑的存在確認抗體形成的差異，利用注射器將ISA70(普通佐劑)和抗原等量混合，從而製備用於產生特定的卵黃抗體的疫苗。
重組肽和載體之間的偶聯利用馬來醯亞胺激活的BSA和KLH偶聯試劑盒 (Maleimide Activated BSA, KLH conjugation Kit, Sigma-Aldrich, MBK1,美國)進行，並且該方法根據使用手冊進行。下面簡述該方法。將載體蛋白在PH 6.6溶於20禮磷酸鈉、 230mM NaCl、2mM EDTA和80mM蔗糖中，將重組肽於pH 6. 6溶於20mM磷酸鈉、IOOmM EDTA 和80mM EDTA中，將載體蛋白和重組肽在冷卻下混合攪拌12小 時以上，並最終在S印adex G-25M凝膠過濾柱上分離。
(2)產卵雞的免疫
將所製備疫苗肌肉內注射到22周齡的Hy系棕色產卵雞中，以3周的間隔一次接種，並加強2次。
(3)免疫-卵黃抗體的分離和確認
i)免疫-卵黃抗體的分離
利用硫酸銨(sigma美國)從經免疫的產卵雞所產的雞蛋中分離IgY。所述硫酸銨法如下進行根據 Akita 等的方法(Akita, E. M. and Nakai, S. Immunoglobulins from egg yolk: isolation and purification. J. Food. Sci. , 57:629-633，1992)，從卵黃中去除卵膜，以1:4的比例用pH 2. 5D. W稀釋，並將稀釋物在_20°C冷凍2天，將稀釋物於7000rpm離心30分鐘，並過濾上清液從而分離水溶性蛋白。利用過飽和硫酸銨溶液在4°C過夜,使純蛋白從所分離的蛋白中沉澱出。將經沉澱的溶液離心從而獲得沉澱物，並以PBS重懸，並在 4°C以PBS緩衝液透析，從而獲得分離的抗體樣品。
ii)電泳
根據 Laemmli 的方法(Laemmli. U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259):680-685, 1970),利用的5%堆積膠和10%分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)。電泳後，用考馬斯亮藍R-250溶液將凝膠染色30分鐘，並利用脫色緩衝液確認所分離的IgY抗體。 圖3顯示了所製備的重組抗體IgY的電泳結果。
(4)所分離的IgY與抗原結合的確認
通過蛋白質印跡來確認所分離的IgY抗體和肽抗原之間的結合。結果如圖4所示， 經確認，通過免疫製備的IgY識別了含有NPClLl的C環部分並且經綴合的重組蛋白。
測試例I:利用ELISA測試方法確認抗體的形成
在該測試例中，根據ELISA測試法確認了利用完全佐劑和ISA 70佐劑製備的疫苗 (蛋白416)是否形成抗體。
a)將NPC1L1-BSA-綴合的抗原利用碳酸鹽緩衝液以400ng/ml的濃度塗覆在96孔 ELISA板上，並在37°C溫育I小時以實現完全塗覆。
b)抗原用PBST洗滌3次，並用1%-BSA在37°C封閉I小時。
c)抗原用PBST洗滌3次，以IOOul樣品處理，並在37°C封閉I小時。
d)抗原用PBST洗滌3次，以作為二抗的100 μ I抗雞-IgY-HRP處理，並在37°C封閉I小時。
e)抗原用PBST洗滌3次，向其中加入100 μ I所製備的底物溶液，並進行顏色反應 10分鐘，並且以2Ν硫酸終止反應。
f)利用ELISA讀取器確認結果。
根據該測試結果(圖5)和以1:10，000的比例稀釋的抗體樣品的結果，將空白值與ISA70-IgY和COM-IgY比較時，觀察到約10倍至15倍的O. D差異。普通IgY和空白樣之間沒有O. D差異。這表明形成了抗NPClLl的IgY抗體。
另外，對於由佐劑之間的差異導致的抗體形成，與ISA 70佐劑相比，含有微生物的OMP的弗氏完全佐劑(Difco 263810，美國)展示出更優的滴度。
由實施例I的蛋白質印記和測試例I中ELISA的測試結果可知，很好地形成了抗 NPClLl的IgY抗體，並且抗體與抗原結合。
測試例2 :體外NPClLl免疫螢光術
為了確認分離自卵黃的抗NPClLl的IgY抗體(蛋白416的抗體)是否與作為抗原的NPClLl蛋白結合，將已知可過表達NPClLl的肝癌細胞系0fepG2細胞系)用於體外免疫突光術(Davies JP, Scott C，Oishi K, Liapis A, Ioannou YA. Inactivation of NPClLl causes multiple lipid transport defects and protects against diet-induced hypercholesterolemia. J Biol Chem. 2005 年 4 月 I 日；280 (13):12710-20. 2005 年 I 月 25日電子出版)。
將細胞以lX104/ml的濃度接種在載玻片室中，溫育18小時，然後測試。去除細胞培養基，以3. 7%的甲醛固定細胞，以PBST洗滌，用滲透緩衝液(0. 2%TritonX-100)處理 20分鐘，將均為2. 5ug/ml的抗NPClLl的IgY (—抗)和兔抗NPClLl (Santa Cruz,美國) (商售抗體)以1/50的比例稀釋，並以各稀釋抗體處理細胞。用PBS洗滌細胞，將抗雞的 IgY-Alexa488 (Biotium,美國)(二抗)和抗兔的 IgG-Alexa488 (Invitrogen,美國)均以1/100的比例稀釋，於室溫(RT)用各個經稀釋的抗體處理細胞I小時，並以PBS洗滌， 用H0echst33258對核反染色30分鐘並封固，利用多光子共聚焦雷射掃描顯微鏡(LSM 510 METANL0, Carl Zeiss,德國)觀察結果。
由免疫螢光術(IF)的結果(圖6)可知，除了未以一抗處理的陰性對照之外，抗 NPClLl的IgY抗體與作為抗原並在細胞質中表達的NPClLl結合，由卵黃製備的抗體與靶蛋白結合良好。
測試例3:體內免疫組織化學和免疫螢光術
由所述結果可知，抗NPClLl的IgY (蛋白416的抗體)在體外結合NPClLl蛋白， 為了確認抗NPClLl的IgY是否與小腸內實際存在的NPClLl蛋白結合，利用小鼠小腸組織進行了免疫組織化學(IHC)分析和免疫螢光術(IF)。
(I)體內免疫組織化學
為了確定分離自卵黃的抗NPClLl的IgY是否與NPClLl蛋白結合，對小鼠小腸組織進行了免疫組織化學分析。
Altmann等(Altmann Sff,Davis HR Jr,Zhu LJ, Yao X, Hoos LM, Tetzloff G,Iyer SP,Maguire M, Golovko A,Zeng M, Wang L, Murgolo N, Graziano MP. Niemann-Pick Cl Like I protein is critical for intestinal cholesterol absorption. Science. 2004年 2 月 20日;303(5661) :1201-4)報導大量小腸NPClLl分布在小腸近端部分。
因此，收集小鼠小腸，分離除十二指腸以外的近端部分的空腸，並以PBS洗滌除去腸道內存在的食物，以4%的多聚甲醛固定，利用自動組織處理機(Leica，德國)以石蠟固定，包埋(Leica，德國)以製備石蠟塊，並以組織切片機(Leica，德國)切割為5μπι的尺寸，從而產生用於免疫染色的載玻片樣品。
將載玻片以二甲苯脫石蠟，在乙醇系列溶液(100%、95%、90%、80%、70%、50%)中水合，以PBS洗滌 ，以O. 3%的H2O2處理，從而去除內源性過氧化物酶，以5%的標準血清 (Vector,美國)封閉，以預定濃度的分離自卵黃的抗NPClLl的IgY(2. 5 μ g/ml)和商售抗體(兔抗NPC1L1，1/50，Santa Cruz，美國)作為一抗進行處理，在4°C溫育過夜。以PBS 洗滌樣品，以稀釋的(1/100) 二抗(抗雞生物素、抗兔生物素，Vetor,美國)於室溫(RT) 處理2小時，以PBS洗滌，並利用VECTASTAIN ABC試劑盒(Vetor，美國)使ABC溫育2小時。ABC與DAB溶液(Vetor，美國)反應2分鐘至5分鐘，以PBS洗漆，以蘇木精(Vector, 美國)反染色，以D. W洗滌，以乙醇系列溶液脫水，以二甲苯處理並封固，利用光學顯微鏡 (Carl Zeiss,德國)觀察結果。
(2)體內免疫螢光術
為了確認分離自卵黃的抗NPClLl的IgY是否結合NPClLl蛋白，對小鼠小腸組織進行了免疫螢光術。利用二甲苯對組織石蠟二甲苯進行脫石蠟，在乙醇系列溶液 (100%、95%、90%、80%、70%、50%)中水合，以PBS洗滌，以O. 3%的H2O2處理，從而去除內源性過氧化物酶，以5%的標準血清(Vector，美國)封閉，以預定濃度的分離自卵黃的抗 NPClLl 的 IgY(2. 5 μ g/ml)和商售抗體(兔抗 NPC1L1，1/50，Santa Cruz,美國)作為一抗進行處理，在4°C溫育過夜。以PBS洗滌樣品，以均為1/100稀釋的作為二抗的抗雞 IgY-Alexa488 (Biotium,美國)和抗兔 IgG_Alexa488 (Invitrogen,美國)於室溫處理 2 小時，以PBS洗滌，以Hoechst33258對核反染色，並安裝，利用光學顯微鏡(Carl Zeiss,德國)觀察結果。
(3)測試結果
由圖7和圖8所示的結果可知，抗NPClLl的IgY抗體強烈表現在整個迴腸絨毛遠端部分，並表現在除絨毛遠端部分的近端部分，並且通過IF確認了在絨毛遠端部分的上皮細胞中以線的形式強烈發射螢光。
由這些結果可知，本發明製備的IgY即使在小腸中也確實進行了結合。
測試例4:抗NPClLl的IgY抗體的膽固醇攝入測試
為了確定抗NPClLl的IgY(蛋白416的抗體)的效力和效果，利用H印G2細胞進行了膽固醇攝入測試。
利用含10%FBS(Difco,美國)的DMEM(Difco,美國)培養基將Hep G2細胞以 2XlOVml的密度在24孔板中溫育18小時，以不同濃度(5 μ g/ml,25 μ g/ml和50 μ g/ml) 的抗NPClLl的IgY進行處理,且作為陽性對照以10μ g/ml的已知作為膽固醇攝入抑制劑的依折麥布(Ezetimibe)進行處理。將各樣品在37°C預溫育I小時，然後移走，並向其中加入新鮮培養基，隨後洗滌。以50 μ M的放射性同位素標記的[3Η]-膽固醇處理樣品3小時。將細胞以不含脂肪酸的含O. 1%BAS的PBS溶液洗滌 ，以HBSS (Difco，美國)收集，以含 l%Triton X-100 (Sigma,美國)的HBSS溶解細胞，利用Beckmen LS6500閃爍計數器測定放射劑量，利用作為對照組的IgY施用組進行比較和測試。
由圖9的結果可知，與未經處理的對照組相比，作為陽性對照的依折麥布在濃度為10 μ g/ml時顯示出顯著降低(p〈0. 05), IgY在濃度為25 μ g/ml時顯示出膽固醇攝入的顯著降低(P〈0. 05)。圖9中，』 COM』和』 ISA』表示佐劑的類型，「ISA」表示利用「ISA70佐劑」的抗NPClLl的IgY處理組，而』 COM，表示利用「完全弗氏佐劑(Difco,美國)」的抗 NPClLl的IgY處理組。
這些結果表明，所製備的抗NPClLl的IgY抗體有效結合NPClLl蛋白，並且結合的 IgY顯著抑制了 NPClLl的膽固醇攝入。即，本發明的抗NPClLl的IgY是具有與依折麥布相同效果的抗體，依折麥布是已知作為常規膽固醇攝入抑制劑的藥物。
測試例5:抗NPClLl的IgY抗體的動物實驗
為了確認與小腸膽固醇運載蛋白NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)結合的抗NPClLl 的IgY抗體(蛋白416的抗體)的有效性，進行了動物實驗。
(I)實驗動物
此處所用的實驗動物是獲自K0ATECH (韓國)的5周齡C57BL/6雌性小鼠，將這些動物馴養7天，在測試前一天將動物分組(n=10)，以所有實驗組的平均重量相同的狀態進行分組。實驗動物在聚碳酸酯籠(寬26cm,長42cm,高18cm)中飼養,並在以無菌蒸懼水和飼料餵養的同時使上述動物與實驗動物(Purina Korea, Inc.)交配,除正常組之外的所有組自由進食可導致動脈粥樣硬化的膳食(獲自Central Lab. Animal Inc. D12336, Research diets, INC.，美國)，從而使其在實驗期內攝入高濃度的膽固醇。實驗動物根據春川生物產業基金會(Chuncheon bioindustry foundation)的實驗動物倫理委員會的指示進行測試。
(2)實驗組和實驗材料的管理
使所有實驗組的平均重量相同，進行實驗組分組。將動物共分為5組，大致分為未經處理的正常組和高膽固醇飼料施用組，高膽固醇飼料的對照組，和根據IgY的施用而劃分的IgY對照組和IgY施用組。IgY的施用量為50mg/kg動物體重和250mg/kg動物體重， 對於IgY對照組以250mg/kg動物體重的量施用抗幽門螺旋桿菌的IgY，對於正常組和對照組施用PBS。
(3)體重的測量
根據個體識別方法利用動物用耳衝器在實驗動物的耳朵上進行標記，測定相對於 100%的實驗初始重量的重量增加百分數。每周於預定時間測定重量一次。
(4)統計學處理
利用GraphPad 4. Oprism程序通過單向ANOVA測試確定實驗結果的顯著性,並相對於施用高膽固醇飼料的對照組進行表示。
(5)實驗結果
由圖10可知，作為施用高膽固醇飼料的結果，實驗後3周時重量增長百分比快速增高，並且在6周後觀察到顯示寬曲線的重量增長百分比；假設實驗初始重量為100%，施用高膽固醇飼料的對照組顯示出重量增加41%，而施用抗NPClLl的IgY的組顯示出重量增加 30%和29%，這表明由飼料引起的體重增加百分比顯著降低(p〈0. 01)。
另外，為了確認IgY的施用效果,施用抗幽門螺旋桿菌的IgY的組沒有顯示出所施用IgY對體重增加的抑制效果。
因此，可以認為IgY有效地作用於小腸膽固醇運載蛋白NPC1L1，從而顯著抑制體重增長。
雖然為了闡釋的目的已經披露了本發明的優選實施方式，但本領域技術人員可理解的是在不背離所附權利要求中限定的本發明的範圍和實質的情況下，可以進行各種變化、增加和替換。
序列表自由文字
Seq. No. I表示編碼人的小腸中存在的膽固醇運載蛋白NPClLl (尼曼-匹克Cl樣 I)的核酸序列。
Seq. No. 2表示編碼人的小腸中存在的膽固醇運載蛋白NPClLl (尼曼-匹克Cl樣 I)的胺基酸序列。
Seq.No.4、6、8、10、12、14和16表示NPClLl(尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的 7個環的胺基酸序列。
Seq. No. 3、5、7、9、11、13 和 15 分別表示編碼 Seq. No. 4、6、8、10、12、14 和 16 的胺基酸序列的核酸序列。
權利要求
1.一種抑制膽固醇吸收的組合物，所述組合物包含作為活性成分的IgY型抗體，所述IgY型抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
2.如權利要求I所述的組合物，其中，所述向腔突出的環部分中的部分胺基酸序列是由選自序列編號4、6、8、10、12、14和16中的一個序列表示的胺基酸序列。
3.如權利要求I所述的組合物，其中，通過將能夠引發抗原性的載體蛋白與NPClLl(尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列結合，從而形成所述抗原。
4.如權利要求3所述的組合物，其中，所述能夠引發抗原性的載體蛋白選自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)。
5.一種預防或抑制肥胖症的組合物，所述組合物包含作為活性成分的IgY型抗體，所述IgY型抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
6.如權利要求5所述的組合物，其中，所述向腔突出的環部分中的胺基酸序列是由選自序列編號4、6、8、10、12、14和16中的一個序列表示的胺基酸序列。
7.如權利要求5所述的組合物，其中，通過將能夠引發抗原性的載體蛋白與NPClLl(尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列結合，從而形成所述抗原。
8.如權利要求7所述的組合物，其中，所述能夠引發抗原性的載體蛋白選自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)。
9.一種預防或抑制高脂血症的組合物，所述組合物包含作為活性成分的IgY型抗體，所述IgY型抗體的抗原包含作為小腸膽固醇運載蛋白的NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列作為表位。
10.如權利要求9所述的組合物，其中，所述向腔突出的環部分中的胺基酸序列是由選自序列編號4、6、8、10、12、14和16中的一個序列表示的胺基酸序列。
11.如權利要求9所述的組合物，其中，通過將能夠引發抗原性的載體蛋白與NPClLl (尼曼-匹克Cl樣I)中的向腔突出的環部分中的全部或部分胺基酸序列結合，從而形成所述抗原。
12.如權利要求11所述的組合物，其中，所述能夠引發抗原性的載體蛋白選自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)。
全文摘要
本發明公開通過遏制腸內膽固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的組合物。本發明組合物中所含的作為活性成分的源自卵黃的IgY型抗NPC1L1(尼曼-匹克C1樣1)抗體與作為腸內膽固醇運載蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1樣1)粘附，從而幹擾膽固醇和該運載蛋白之間的結合，進而基本阻斷體內的膽固醇吸收，從而避免高脂血症和肥胖症。
文檔編號A61P3/00GK102869382SQ201180021554
公開日2013年1月9日 申請日期2011年4月25日 優先權日2010年6月10日
發明者張相澔, 崔水榮, 李琰翲, 安載真, 鄭洪傑, 權赫世, 樸正金, 白鬥淵 申請人:(株)Ad生物技, 白腮傳株式會社