內皮細胞化動脈瘤支架及其製備方法
2023-07-22 07:41:11 2
專利名稱：內皮細胞化動脈瘤支架及其製備方法
技術領域：
本發明屬生物醫療材料領域，涉及一種新型動脈瘤支架，具體涉及一種內皮細胞化動脈瘤支架及其製備方法。
背景技術：
顱內動脈瘤是導致急性自發性蛛網膜下腔出血的最主要原因，也是人類猝死的重要原因之一。血管內介入治療目前已成為顱內動脈瘤治療的重要手段之一。特別是一些難治性動脈瘤，如梭形或層間動脈瘤、寬頸動脈瘤、椎基底動脈瘤等，直接外科手術治療難度大、效果差，且常伴嚴重併發症，而血管內治療則呈現安全、微創的優越性。過去的十年間，應用電解可脫性彈簧圈(GDC)治療顱內動脈瘤已經被本領域普遍接受。然而，由於彈簧圈治療動脈瘤的歷史有限，儘管短期療效得到臨床肯定，長期療效仍有待進一步觀察。Hayakawa等在455個動脈瘤GDC栓塞後複查發現178(39％)個動脈瘤未完全填塞，有瘤頸殘留。其中大型(11-25mm)或巨大型(＞25mm)動脈瘤和寬頸(＞4mm)小型(4-10mm)動脈瘤出現復發的概率遠高於窄頸小型動脈瘤。Bavinzski(Bavinzski G，et al.JNeurosurg.1999；91(2)284-93)等在顱內動脈瘤GDC栓塞後的屍檢中也發現瘤頸較大的動脈瘤頸口的新生內膜覆蓋較少。因而Geremia等將支架置於動脈瘤瘤頸附近載瘤動脈中，通過支架的網狀結構幹擾正常的血流促使瘤內血栓形成，組織纖維化，進而閉塞瘤腔。支架技術的應用為顱內難治性動脈瘤的治療開闢了新的局面。然而，支架技術在動脈瘤中的應用還存在缺陷。首先，支架作為金屬異物可以誘發載瘤動脈的血栓形成；其次，金屬支架的刺激性作用可引起血管內膜增生，導致載瘤動脈的狹窄或閉塞(Levy EI，et al.Neurosurgery.2002；51(5)1280-5)。這些問題，已限制了支架在臨床中的廣泛應用。本領域研究認為，對於顱內巨大型及寬頸動脈瘤，如何在支架建立後加快瘤頸口新生內皮的產生和覆蓋，是減少動脈瘤復發和避免載瘤動脈狹窄的關鍵問題。
研究認為，支架內皮細胞化的目的在於使動脈瘤瘤頸處被內皮細胞封閉，重建血管壁。對於栓塞不全者，可以使瘤腔與循環血液隔絕；對於完全栓塞的動脈瘤，可以減輕血流對彈簧圈或瘤內血栓的衝擊，降低再通的發生率。支架上的內皮細胞，有利於減輕和修復治療中損傷的血管內皮，可以避免金屬支架與血流直接接觸，減少對血流的幹擾；同時內皮細胞還可以分泌一氧化氮(NO)、前列環素(PGI2)等活性物質，降低血管痙攣和狹窄的發生率。因此在支架表面實現內皮細胞化，可以減少支架的金屬裸露面積從而能夠減輕植入後引起的異物炎症反應，同時內皮細胞分泌的活性物質，有助於支架形成具有抗凝特性的光滑表面。支架內皮細胞化的前景十分誘人，但仍然有許多實際的問題有待解決。如支架內皮細胞化的效果取決於種植的內皮細胞數目、粘附細胞的抗血流衝刷能力等，其中首先要解決的是內皮細胞來源問題。異體內皮細胞因涉及免疫排斥反應而不宜應用於臨床；轉基因永生化內皮細胞系具有潛在的致瘤危險。目前進行的人血管內皮細胞的體外培養中，以臍靜脈和幼童包皮的血管內皮細胞培養方法較為成熟，顯然這兩種方法都不大可能應用於支架的內皮細胞化。儘管血管細胞生物學已取得很大的進步，但內皮細胞的獲得仍不夠便利。因而，尋找新的內皮細胞獲得途徑是建立可供臨床應用的內皮化支架的關鍵問題之一。
選擇合適的表面塗層材料，形成適合內皮細胞生長的支架表面是建立內皮化支架的又一關鍵問題。內皮化支架進入血管內後，其附著的內皮細胞必須具備抗血流衝刷能力，同時部分裸露的塗層材料不能引起血小板聚集而發生血栓。以往採用的纖維連接蛋白(Fibronectin)和多聚賴氨酸(poly-L-lysine)粘附力有限，同時存在促進血栓形成的隱患。
發明內容
本發明的目的是改進已有的金屬材質動脈瘤支架的性能，克服已有技術的缺陷，提供一種內皮細胞化動脈瘤支架。本發明將自體血管內皮細胞對支架金屬表面修飾，能在支架建立後加快瘤頸口新生內皮的產生和覆蓋，減少動脈瘤復發和避免載瘤動脈的狹窄，提高動脈瘤特別是顱內動脈瘤的治癒率，減少動脈內血栓形成的機會。
本發明的另一目的是提供所述內皮細胞化動脈瘤支架的製備方法。
本發明首先解決了內皮細胞的來源，採用從自體靜脈內皮層採集擴增的血管內皮細胞，並將該細胞粘附於經生物相容性的，生物可降解的，無毒的高分子生物材料塗層處理的不鏽鋼動脈瘤支架表面，製成自體內皮細胞化動脈瘤支架，用於動脈瘤的血管內治療，特別是顱內動脈瘤的介入治療。
本發明所述的高分子生物材料選自肝素鍵合的聚(乳酸-胺基酸)共聚物(專利申請號01132179.2；國際申請號PCT/CN01/01622)，其生物相容性好，可降解且無毒。
本發明通過下述方法製備，包括以下步驟1、培養自體血管內皮細胞取實驗用犬頸靜脈，血管段，放入1％膠原酶(Sigma)，0.125％胰酶(Sigma)中消化，吸出細胞懸液，離心，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培養液重懸細胞，將1×106細胞密度的細胞懸液種植於塗有多聚賴氨酸的培養皿CO2培養箱中培養，傳代。
2、製備塗層材料及不鏽鋼支架表面塗層將交酯或內酯與含多官能團胺基酸的嗎啉二酮衍生物(derivative ofmorpholine-dione)，其中兩者的投料摩爾比例控制在99∶1～1∶99，以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合；所得聚合物用Pd/C為催化劑催化氫化或採用HBr/HAc為催化劑脫去保護基團後，得具有可反應性側基的生物降解型聚酯，再將脫保護後的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環己基碳二亞氨為催化劑進行反應，得到可完全生物降解的藥物高分子材料。
將製備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到濃度從10％wt～0.01％wt的溶液，噴塗到支架表面，劑量從10～1000ug，抽乾，消毒後待用。
所述的交酯或內酯包括L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內酯等類似的單體。
(3)內皮化不鏽鋼支架集成採用1×107-5×107的高滴度細胞懸液滴在血管支架上，使均勻貼附在支架上後浸入培養液，CO2培養箱中培養24小時備用。
本發明提供了決定支架內皮細胞化效果的種植的內皮細胞數目，保證了粘附細胞的抗血流衝刷能力。
本發明自體內皮化不鏽鋼支架製備的每個步驟中均進行了相應的理化性能和生物學特徵的檢測，結果表明符合設計要求。表1是塗層材料的理化及生物特徵。表2是內皮化支架的生物學特徵。
表1
表2
將上述集成的內皮化不鏽鋼支架置於體外血流衝刷儀中，採用70dyne/cm2切應力衝刷24小時，觀察結果顯示支架表面內皮細胞形態無明顯變化，並計每1mm長度支架表面的粘附細胞數量無明顯減少，0、12、24小時細胞數分別為305.3±22.54；294.7±20.45；288.6±30.97。
本發明所用實驗試劑，儀器及實驗動物均為市購。
本發明採用自體血管內皮細胞修飾不鏽鋼動脈瘤支架表面，克服了不鏽鋼裸支架的諸多缺陷，具有以下主要優點。
1、抗載瘤動脈血栓形成。
內皮化的支架表面避免了金屬與血液直接接觸，減少炎症反應後產生血栓形成作用，降低載瘤動脈狹窄的發生率；塗層材料中鍵合的肝素在支架到達治療位置後緩慢釋放，阻止了治療早期載瘤動脈內的血栓形成。
2、促進治療後動脈瘤瘤頸部位內皮細胞層的形成。
通過支架帶入的自體內皮細胞在瘤頸部位沿支架的網格排列，這種排列結構大大減少了內皮細胞所要爬行的距離，可在瘤頸部位疏鬆的血栓表面形成內皮細胞層，從而真正達到治癒動脈瘤的目的。
3、自體內皮細胞容易採集、無免疫源性、不存在倫理問題。
人類自體內皮細胞可以在大隱靜脈的內皮層中採集擴增而得。自體內皮細胞的使用避免了諸如臍靜脈內皮細胞、永生化內皮細胞系等需要考慮的排斥反應以及倫理問題等。
4、本發明所涉及的技術方法成熟可行，成本在可接受範圍內。
圖1犬血管內皮細胞形態(放大倍數200)。
圖2A，B均為內皮細胞化支架在掃描電鏡下的形態。
具體實施例方式
實施例1(1)培養自體血管內皮細胞取實驗用犬一側頸靜脈，無菌下剝離靜脈周圍的芥蒂組織，用D-hank’s液反覆衝洗血管，將血管內的血液衝洗乾淨，用外科縫線把血管一頭扎住，血管內壁外翻，外科縫線扎住血管另一頭將血管段放入1％膠原酶(Sigma)，0.125％胰酶(Sigma)中37℃消化20分鐘，用血清終止消化吸出細胞懸液，離心1500轉/分5分鐘，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培養液重懸細胞，將1×106細胞密度的細胞懸液種植於塗有多聚賴氨酸的培養皿中放入37℃5％CO2培養箱中培養，待細胞鋪滿皿底後進行細胞傳代。
(2)塗層材料的製備及不鏽鋼支架的表面塗層將交酯或內酯與含多官能團胺基酸的嗎啉二酮衍生物以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合；其中兩者的投料摩爾比例控制為99∶1；反應溫度為50-200℃，反應時間為0.5-46小時；所得聚合物用Pd/C為催化劑催化氫化24～180小時，得到具有可反應性側基的生物降解型聚酯，反應溫度為10-35℃，反應時間為8-80h；再將上述脫保護後的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環己基碳二亞氨為催化劑進行反應，即得可完全生物降解的藥物高分子。
將製備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到濃度從10％wt～0.01％wt的溶液，所得溶液採用計算機控制的噴塗工藝噴塗到支架表面，劑量為10ug，然後抽乾，消毒後待用。
所述交酯或內酯可選用L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內酯等類似的單體。
(3)內皮化不鏽鋼支架的集成用1×107的高滴度細胞懸液緩慢地滴在血管支架上並旋轉支架，在倒置顯微鏡下可見血管內皮細胞均勻的貼附在支架上後浸入培養液中放入37℃ 5％CO2培養箱中培養24小時後準備進行體內植入支架。
本發明自體內皮化不鏽鋼支架製備的各步驟中均進行了相應的理化性能和生物學特徵的檢測，結果表明符合設計要求。表1是塗層材料的理化及生物特徵。
表2是內皮化支架的生物學特徵。
表1
表2
實施例21、培養自體血管內皮細胞同實施例1。
2、製備塗層材料及不鏽鋼支架表面塗層將交酯或內酯與含多官能團胺基酸的嗎啉二酮衍生物，其中兩者的投料摩爾比例為1∶99，以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合；反應溫度為50～200℃，反應時間為0.5～46小時，得到聚合物的交酯或內酯與含多官能團胺基酸的嗎啉二酮衍生物的摩爾比例為1∶99；所得聚合物用HBr/HAc為催化劑脫去保護基團後，得具有可反應性側基的生物降解型聚酯，反應溫度為10-35℃，反應時間為8-80h；再將脫保護後的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環己基碳二亞氨為催化劑進行反應，即得可完全生物降解的藥物高分子材料。
將製備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到濃度從10％wt～0.01％wt的溶液，用電腦程式控制的噴塗工藝噴塗到支架表面，劑量為1000ug。抽乾，消毒後待用。
所述的交酯或內酯可選用L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內酯等類似的單體。
(3)內皮化不鏽鋼支架集成採用5×107的高滴度細胞懸液慢滴在血管支架上，並旋轉支架，使均勻貼附在支架上後浸入培養液中放入37℃ 5％CO2培養箱中培養24小時後準備用。進行體內植入支架。
本發明支架進行了相應的理化性能和生物學特徵的檢測，結果表明符合設計要求。
實施例3內皮化支架介入治療動脈瘤的實驗將上述自體內皮細胞化動脈瘤支架均勻壓縮於微導管球囊表面備用。
選用上述的同一實驗用犬(15-20Kg)，頸外靜脈採集後建立頸總動脈動脈瘤模型(瘤頸8mm；瘤體6×8×10mm3)。模型建立後三周，將頸總動脈動脈瘤犬經靜脈全身麻醉後固定於數字減影血管造影(DSA)床，經右側股動脈插入6F動脈鞘。常規血管造影顯示動脈瘤位置及形態後，將6F導引導管置於載瘤頸總動脈的近端。自體內皮細胞化動脈瘤通過微導管輸送到動脈瘤瘤頸位置，球囊擴張到位後釋放支架。即刻複查DSA顯示支架位置滿意，動脈瘤內渦流產生，部分血栓形成，瘤體縮小。三月後複查DSA顯示動脈瘤不顯影。將動脈瘤解剖離體，經免疫組化染色顯示瘤頸部位有內皮細胞層形成。對照組採用裸不鏽鋼支架經相同途徑治療後，三月後DSA顯示動脈瘤閉塞不全，免疫組化染色顯示瘤頸部位內皮細胞層形成不全。
權利要求
1.一種內皮細胞化動脈瘤支架，其特徵是由塗層生物可降解的高分子生物材料的不鏽鋼動脈瘤支架和自體血管內皮細胞組成，所述的不鏽鋼動脈瘤支架表面塗層上貼附自體血管內皮細胞。
2.按權利要求1所述的內皮細胞化動脈瘤支架，其特徵是所述的自體血管內皮細胞選自自體靜脈內皮層。
3.按權利要求1所述的內皮細胞化動脈瘤支架，其特徵是所述的支架表面塗層的高分子生物材料為肝素鍵合的聚乳酸-胺基酸共聚物。
4.按權利要求1的內皮細胞化動脈瘤支架的製備方法，其特徵是包括以下步驟，(1)培養自體血管內皮細胞取實驗用犬頸靜脈血管段，放入1％膠原酶，0.125％胰酶中消化，吸出細胞懸液，離心，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培養液重懸細胞，將1×106細胞密度的細胞懸液種植於塗有多聚賴氨酸的培養皿CO2培養箱中培養，傳代；(2)製備塗層材料及不鏽鋼支架表面塗層將交酯或內酯與含多官能團胺基酸的嗎啉二酮衍生物，以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合，所得聚合物用Pd/C為催化劑催化氫化或採用HBr/HAc為催化劑脫去保護基團後，得具有可反應性側基的生物降解型聚酯，再將脫保護後的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環己基碳二亞氨為催化劑進行反應，得到可完全生物降解的藥物高分子材料；將製備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，所得溶液噴塗到支架表面抽乾，消毒後待用；(3)內皮化不鏽鋼支架集成採用1×107-5×107的滴度細胞懸液滴在血管支架上，使均勻貼附在支架上後浸入培養液，CO2培養箱中培養24小時備用。
5.按權利要求4的製備方法，其特徵是步驟2所述的交酯或內酯選自L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內酯等類似的單體。
6.按權利要求4的製備方法，其特徵是步驟2的交酯或內酯與含多官能團胺基酸的嗎啉二酮衍生物的投料摩爾比例為99∶1～1∶99。
7.按權利要求4的製備方法，其特徵是步驟2的溶解在氯仿中的所得溶液濃度為10％wt～0.01％wt，噴塗到支架表面的劑量為10～1000ug。
全文摘要
本發明屬生物醫療材料領域，涉及一種內皮細胞化動脈瘤支架及其製備方法。本發明將自體靜脈內皮層採集擴增的血管內皮細胞粘附於經生物相容性的，生物可降解的，無毒的高分子生物材料塗層的金屬動脈瘤支架表面製成動脈瘤支架，能在支架建立後加快瘤頸口新生內皮的產生和覆蓋，減少動脈瘤復發和避免載瘤動脈的狹窄，提高動脈瘤特別是顱內動脈瘤的治癒率，減少動脈內血栓形成。本發明克服了不鏽鋼裸支架的諸多缺陷，無免疫源性和倫理問題，製備成本不高、技術成熟。有利於提高我國在新型血管內治療材料和推動顱內動脈瘤介入治療的學術水平。
文檔編號A61L27/40GK101073677SQ20061002665
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月17日 優先權日2006年5月17日
發明者朱巍, 周良輔, 程樹軍, 汪洋, 毛穎, 宋冬雷, 田彥龍, 朱雲夢 申請人:復旦大學附屬華山醫院