一種枯草桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在仔豬飼料中的應用的製作方法

2023-07-11 10:14:11

專利名稱:一種枯草桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在仔豬飼料中的應用的製作方法
一種枯草桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在仔豬飼料中的應用技術領域：
[0001]本發明涉及一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在仔豬飼料中的應用，屬於農業領域中的畜牧養殖技術領域：
和生物技術領域：
。涉及利用抗菌肽替代飼料中抗生素的添加，在預防仔豬腹瀉的前提下，減少仔豬中抗生素的殘留和保障食品的安全。
背景技術：
[0002]飼料安全即食品安全的概念在世界範圍內已成為共識。食品和飼料在美國屬於同一管理範圍，適用於同一部法律；丹麥政府為了保證食品安全，制定了飼料生產中禁止使用抗生素的規定；歐盟已禁止在動物飼養中使用抗生素作為飼料促進劑。隨著人民生活水平的提高，對動物產品的需求量越來越大，對綠色食品的呼聲越來越高。我國是養殖生產大國，但畜產品的出口比例相當低下，與我國作為一個畜產品生產大國的地位極不相稱。我國的一些農副產品由於農藥、抗生素等藥物殘留，重金屬含量等技術指標超過歐盟及主要進口國的質量標準，被拒收、扣留和終止合同等。近年來，畜產品中的抗生素藥物殘留問題越來越受到人們的重視，我國已嚴格限制將某些抗生素作為保健和促生長劑用於飼料。2002 年，農業部發布了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》公告，這表明傳統抗生素必將逐漸淡出歷史舞臺，尋找安全高效的抗生素替代品就顯得十分重要，鑑於抗生素的不利影響，開發通過調整動物胃腸道平衡而達到促進生長、維持動物健康、無毒副作用的綠色飼料添加劑已成為人們研究的熱點。特別是在我國未來養殖業的發展中，政府將進一步加大對飼料、獸藥與畜產品衛生安全的監管力度，積極推動發展綠色養殖業。因此，應用現代高科技手段研究和開發安全、高效、環保的抗菌添加劑，保障動物和人類自身的健康與安全，才能使我國由養殖生產大國成為養殖生產強國，實現養殖業的現代化。[0003]國外對抗菌肽已有較多研究，在動物生產實際中也已開始應用，其作為飼料添加劑的使用效果已被實驗證實，並已形成一定的市場需求。但一般抗菌肽的抗菌譜窄，通常只能抑制革蘭氏陽性菌。動物源抗菌肽天然資源有限，限制了在飼料中的大規模使用。微生物抗菌制肽由10個以下的胺基酸和一個脂肪酸組成一個環形的多肽分子，它和動物源抗菌肽相比，具有廣譜高效抗菌的優勢。利用微生物發酵生產抗菌肽脂，可大規模工業化生產， 生產周期短，生產成本大大降低，且不受季節和氣候變化等外在環境的影響，是克服抗菌肽實際應用技術瓶頸的最佳途徑。
發明內容
[0004]技術問題[0005]針對飼料中抗生素的使用導致食品安全的問題和動物源抗菌肽生產量低的問題。 本發明利用枯草芽孢桿菌生產抗菌肽的方法及其產品在仔豬飼料中的應用。發明目的之一抗菌肽生產方法及產品。發明目的之二 在仔豬飼料中的添加方法。[0006]技術方案`[0007]—種來自枯草芽孢桿菌的抗菌脂肽的生產方法,包括[0008]以枯草芽孢桿菌、Bacillusfmbj,種子培養基擴大培養，種子培養基 胰蛋白腖10. O g，酵母膏5.0 g, NaCl 5. 0 g，蒸餾水1000 ml, ρΗ7· 2 ;體積比2 5%接種， 28 35°C，5000 L發酵罐液體深層發酵30 48 h，液體發酵培養基葡萄糖20. O g/L，胰蛋白腖 5. O g/L，穀氨酸鈉 2 5%，MgS04 0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, KH2PO4 I g/L, FeSO4 0. 15 mg/L, MnSO4 5. 0 mg/L，CuSO4 0. 16 mg/L，pH7. 0 ;發酵工藝參數為溫度 28 35°C，攪拌轉速180 r / min，通氣量80 m3/h，罐壓O. 10 0· 12 Mpa, ρΗ7· 0，消泡劑O. 3% ;發酵液經離心去除菌體，然後在上清液中加入HCl調整pH至2. 0，靜置後離心，沉澱按發酵液體積分數 25 30%加乙醇並調pH至7. 0，進一步提取，提取物經賦型劑(麥芽糊精多孔澱粉=6、1) 吸附、乾燥，或直接進行吸附、乾燥，得抗菌肽成品，產品抗菌效價為2000(T300000 IU/g。消泡劑為聚醚、矽油或大豆油，優選大豆油。[0009]所述的枯草芽孢桿菌fmbj抗菌脂肽在仔豬飼料中的應用，其特徵為在仔豬基礎日糧中按照4000 IU/kg添加所述的抗菌脂肽。[0010]有益效果[0011]本發明的主要優點和積極效果如下[0012]1.本發明首次將枯草芽孢桿菌抗菌脂肽用於仔豬飼料中，可以顯著減少仔豬的腹瀉率，提高仔豬的飼料利用率，並通過提高三碘甲狀腺氨酸(T3)和降低甲狀腺素(T4)水平而提高機體免疫力。添加抗菌脂肽對仔豬的生長發育和免疫機能具有較好的調節和促進作用，提高雞的飼料利用率和免疫功能有積極的意義。[0013]2.本發明與目前仔豬飼料中使用的黃黴素相比，具有更好的促進生產和調節免疫的效果，對取代飼料抗生素添加和保障食品的安全具有重要意義。
具體實施方式
[0014]實施例1[0015]採用5000 L的發酵罐，以500 L放大後的最佳發酵工藝條件對枯草芽孢桿菌 (.Bacillus subtil is) fmb}(保藏號CGMCC No. 0943，見專利公開號CN1477189)進行發酵生產。最佳發酵工藝參數為溫度28 35°C，攪拌轉速180 r / min，通氣量80 m3/h，罐壓 O. 10 O. 12Mpa, pH7. O,大醜油 O. 3%。[0016]以枯草芽孢桿菌(ifeciJrJrW1S JrY1S)菌種fmbj,種子培養基擴大培養，種子培養基胰蛋白腖10. O g，酵母膏5. O g，NaCl 5. O g，蒸餾水1000 ml, ρΗ7· 2 ;體積比2 5%接種，28 35°C，5000 L發酵罐液體深層發酵30 48 h，液體發酵培養基葡萄糖20. O g/ L，胰蛋白腖 5. O g/L，穀氨酸鈉 2 5%，MgSO4 0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, KH2PO4 I g/L, FeSO4O.15 mg/L, MnSO4 5. 0 mg/L, CuSO4 0. 16 mg/L, pH7. 0 ;發酵工藝參數為溫度 28 35。。， 攪拌轉速180 r / min，通氣量80 m3/h，罐壓O. 10 0· 12 Mpa, ρΗ7· 0，消泡劑大豆油O. 3% ；[0017]發酵液採用的工業離心機為碟片式離心機(江蘇巨能機械有限公司生產，DBY211 型)，轉速為6000 r/min，去除菌體，然後將離心所得清液用6Ν HCl調pH至2. O、靜置24 h， 過濾除濾液得沉澱，沉澱按發酵液體積分數25 30%加乙醇並調pH至7. 0，進一步提取，提取物經賦型劑[麥芽糊精(山東西王澱粉有限公司):多孔澱粉(重慶泰威生物工程股份有限公司)=6、1]吸附、乾燥，或直接進行乾燥，得抗菌肽成品。抗菌肽的回收率為48.4%，純度為 58. 5%，抑菌效價為 50000 300000 IU/g。[0018]實施例2[0019]採用5000L的發酵罐，以1000 L放大後的最佳發酵工藝條件對Bacillus subtil is fmbj進行發酵生產。最佳發酵工藝參數為溫度32°C,攪拌轉速180 r / min, 通氣量 80 m3/h，罐壓 O. 10 O. 12Mpa, ρΗ7· O,大豆油 O. 3%。[0020]採用的工業離心機為碟片式離心機，轉速為6000 r/min，去除菌體，然後採用噴霧乾燥方式進行乾燥。其工藝為溫度210°C、風機轉速70轉/S、賦形劑麥芽糊精多孔澱粉=6、1，此時抗菌肽的回收率達54%，抑菌效價為20000 70000 IU/g乾粉。[0021]實施例3[0022]選用28日齡斷奶的長X大二元雜交健康仔豬360頭，根據公母各半、來源不同的原則隨機分為4個處理組，每處理設6重複，每重複15頭，各重複仔豬體重相近(P>0. 05)。 基礎日糧選用玉米-豆柏型，營養需要參照NRC (1998)《豬的營養需要》迴腸表觀可消化胺基酸模式，日糧組成和營養成分。處理組分別為空白對照組(C組)飼餵基礎日糧(基礎日糧中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素對照組(AC)在基礎日糧中添加5 mg/kg的黃黴素，試驗在基礎日糧中添加枯草芽孢桿菌fmbj抗菌脂肽2000 IU/kg,預試期為3天，試驗期為 28天。[0023]添加2000 IU/kg的組28天的平均體重較C組提高3. 76%; I組的平均體重日增量較C組增加8. 27%,增加顯著，較AC組增加1. 7%，但不顯著；1組的料重比F/G較AC組降低4. 14%，較C組也降低2. 87%。廣14天，I組的腸道大腸桿菌數量，較C組降低2個數量級，較AC組減少I個數量級，降低顯著，但是乳酸桿菌的數量較C組降低了 I個數量級 (PM 05),與AC組大致相當；Γ14天的腹瀉率較C組降低29. 5%，和AC組相同UXO. 05、。 顯著降低了廣14天的仔豬腹瀉率。[0024]添加2000 IU/kg抗菌脂肽能顯著提高血清三碘甲狀腺氨酸T3水平，降低甲狀腺素T4水平。I組的三碘甲狀腺氨酸T3水平較AC組提高61. 61% (Ρ<0.似)，較C組也提高37. 12% (P<0. 05)-,1組的甲狀腺素T4水平較C組和AC組分別降低14. 21% {P<0.防)和 19. 61% iP〈0. 05)0胰島素水平I組較C組也升高17. 63% (P0. 05)。 基礎日糧選用玉米-豆柏型，營養需要參照NRC (1998)《豬的營養需要》迴腸表觀可消化胺基酸模式，日糧組成和營養成分。處理組分別為空白對照組(C組)飼餵基礎日糧(基礎日糧中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素對照組(AC)在基礎日糧中添加5 mg/kg的黃黴素，試驗 組在基礎日糧中添加枯草芽孢桿菌fmbj抗菌脂肽4000 IU/kg,預試期為3天，試驗期為28天。[0028]添加4000 IU/kg的組28天的平均體重較C組提高5.73% (八％防)， 組的平均體重日增量較C組增加10. 06%,增加顯著iP0· 05),但是乳酸桿菌的數量較C組增加了1. 5個數量級(八％防)，與AC組大致相當；廣14天的腹瀉率較C組降低 35. 5%，和AC組相同(八％ 05),顯著降低了 f 14天的仔豬腹瀉率。[0029]添加4000 IU/kg抗菌脂肽能顯著提高血清三碘甲狀腺氨酸T3水平，降低甲狀腺素T4水平。 組的三碘甲狀腺氨酸T3水平較AC組提高59. 82% (Ρ<0. 01)，敬C組也提高35. 12% {P<0. 05)； 組的甲狀腺素T4水平較C組和AC組分別降低7. 15%和13. 00% iP<0.05/胰島素水平組較C組也升高23. 56%(/Yttft^)。但是抗菌脂肽對仔豬血清生長激素和皮質醇水平無顯著影響。[0030]甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平各組間均無顯著差異，但II組的TG水平較C組和AC組有升高趨勢，LDL-C水平較C組和AC組也有降低趨勢。II組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平較C組和AC組有升高18. 46% {P0. 05)0 II組的高低密度脂蛋白膽固醇之比(H/L)較C組分別升高42. 86% (P<0. 01), II組較AC組也升高25% (P<0. 05)ο II組總膽固醇TC水平最低，較C組降低21. 72% (P<0.似)，表明抗菌脂肽對斷奶仔豬脂肪代謝有一定作用。血清總蛋白TP方面，II組較C組和AC組分別升高15. 65%和16. 84% (P<0. 05/各組尿素氮(UN)無顯著差異且無明顯變 化趨勢。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus SMiiJi1SOfmbJ抗菌脂肽在仔豬飼料中的應用,其特徵為以保藏號為CGMCC No. 0943的枯草芽孢桿菌fmbj菌種，種子培養基擴大培養，種子培養基胰蛋白腖10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 ml，pH7. 2 ;體積比2 5%接種，28 35°C，5000 L發酵罐液體深層發酵30 48 h，液體發酵培養基葡萄糖20. -0 g/L，胰蛋白腖 5. 0 g/L，穀氨酸鈉 2 5%，MgSO4 0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, KH2PO4 1 g/L，FeSO4 0.15 mg/L, MnSO4 5. 0 mg/L，CuSO4 0. 16 mg/L，pH7. 0 ;發酵工藝參數為溫度 28 35。。，攪拌轉速180 r / min，通氣量80 m3/h，罐壓O. 10 0· 12 Mpa，pH7. 0，消泡劑O. 3% ;發酵液經離心去除菌體，然後在上清液中加入HCl調整pH至2. 0，靜置後離心，沉澱按發酵液體積分數25 30%加乙醇並調pH至7. 0，進一步提取，提取物經賦型劑吸附、乾燥，或直接進行吸附、乾燥，得抗菌脂肽產品，產品抗菌效價為2000(T300000 IU/g ;消泡劑為大豆油；賦型劑為體積比麥芽糊精多孔澱粉=6、1 ;在仔豬基礎日糧中按照4000 IU/kg添加所述的枯草芽孢桿菌fmbj抗菌脂肽。
專利摘要
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在仔豬飼料中的應用，屬於飼料添加劑和生物技術領域：
。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)fmbJ種子培養基擴大培養後，2～5%接種，28～35℃，5000L發酵罐液體深層發酵30～48h，然後提取，噴霧乾燥生產抗菌脂肽產品。這種抗菌脂肽按照4000IU/kg添加至仔豬基礎日料中，提高了飼料利用率，並對促進仔豬生長發育、預防仔豬腹瀉和提高仔豬免疫力均有較好的效果。本發明菌株枯草芽孢桿菌為安全的微生物，其抗菌產物安全性高。另外與目前仔豬飼料中使用的黃黴素相比，具有更好的效果，對取代飼料抗生素添加和保障食品安全具有重要意義。
文檔編號C12P21/02GKCN102094054 B發布類型授權 專利申請號CN 201010576515
公開日2013年4月10日 申請日期2010年12月7日
發明者陸兆新, 王恬, 呂鳳霞, 別小妹, 都海明, 趙海珍 申請人:南京農業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (5),