一種檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的引物序列及方法
2023-07-11 05:57:51
專利名稱：一種檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的引物序列及方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的引物序列及方法。
背景技術：
雖然近些年來藍藻問題一直存在，但並未引起公眾的重視，2007年無錫太湖區域藍藻大面積爆發給人們敲響了警鐘，也使人們開始意識到藍藻毒素問題的嚴重性。藍藻包括一系列不同的光化學合成細菌，這些細菌具有合成葉綠素a，藻膽素蛋白，藻藍蛋白和藻紅蛋白的能力。在一些水體中的藍藻細菌還能合成對多數真核生物體有很大毒性的成次生代謝產物。這些釋放的毒素進入娛樂和生活飲用水中對公眾健康和環境造成了很大的威脅。藍藻毒素根據其病理，可分為4種類型，包括肝毒素、神經毒素、皮疹毒素和細胞毒素等，按產毒藍藻的種類可分為微囊藻毒素、魚腥藻毒素、束絲藻毒素。在已發現的各種不同藻毒素中，微囊藻毒是目前已知的一在藍藻水華汙染中出現頻率最高、產生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類。目前，為了保障人民的身體健康，國家標準委和衛生部在新頒布的《生活飲用水標準》中，將微囊藻毒素的限值定為每升1微克，與世界衛生組織完全相同。但是，如何有效監測是目前執行這個標準所面臨的最大問題。傳統的測定水中銅綠微囊藻濃度的方法如顯微鏡計數法，存在費時費力、樣品保存時間短、很難對藻類進行分類以及無法區別產毒銅綠微囊藻和不產毒銅綠微囊藻等不足；近年來一些檢測微囊藻毒素的方法比如高效液相色譜法、蛋白磷酸酶抑制實驗和酶聯免疫吸附法發展迅速，但是仍存在著或多或少的問題，特別是在樣品的前處理時間和需要採集樣品的量上，樣品前處理時間比較長，需要採集的量較大。定性PCR技術是1985年由美國的莫裡森發明的，並獲得了 1993年的諾貝爾化學獎。PCR技術以其簡便、快速、靈敏、特異的特點，受到了分子生物學家的普遍重視。基本的 PCR技術原理是在高溫DNA多聚酶、模板DNA、引物、Mg2+、dNTP存在及特定離子強度下，通過高溫解鏈、低溫模板引物復性、中溫延伸反應，如此循環30-40次，從低拷貝模板獲得高拷貝產物的過程。實時螢光定量PCR技術(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加， 最終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統的PCR中，常用凝膠電泳分離並用螢光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在實時螢光定量PCR反應中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的螢光信號，隨著反應時間的進行，監測到的螢光信號的變化可以繪製成一條曲線。在PCR反應早期，產生螢光的水平不能與背景明顯地區別，而後螢光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應處於指數期的某一點上來檢測PCR 產物的量，並且由此來推斷模板最初的含量。CT值表示每個PCR反應管內螢光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關係，起始拷貝數越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。傳統的定量PCR絕對定量方法要求先製作重組質粒標準品，將提取出來的含有目標片段基因的重組質粒DNA進行梯度稀釋作為待測樣品的參照，據此檢測得到的數據受標準品的純度和DNA提取效率影響較大。
發明內容
本發明提供了一種檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的引物序列及方法，避免了 DNA提取效率的誤差，實現了精確定量。一種檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的引物序列，包括正向引物和反向引物，其鹼基序列為正向引物TATCATCTAGCCATTCTCGCATCT；反向引物AAATTTACAGCCAAACATCGG。一種用所述的引物序列檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的方法，包括(1)提取待測水樣中產毒銅綠微囊藻細胞的DNA，以提取的DNA為模板，用所述的正向引物和反向引物進行定量PCR擴增並記錄下達到螢光閾值時的循環數；(2)將步驟(1)中得到的螢光強度參照定量PCR測定產毒銅綠微囊藻細胞濃度的標準曲線得到待測水樣中產毒銅綠微囊藻細胞的濃度。步驟O)中所述標準曲線的標準品為從已知濃度梯度的產毒銅綠微囊藻細胞重提取的DNA。所述的定量PCR反應體系為1. 5ul DNA溶液，5ul SYBR Premix Ex Taq溶液， 0. 2ul ROX Reference溶液，0. 25ul的IOmM濃度的正反引物對，2. 8ul的DEPC水一般的定量PCR反應體系，小體積很容易造成PCR反應孔壁上殘留與蒸發反應液，導致反應體系間試劑濃度變異，所以一般定量PCR推薦反應液體積為20-50ul。本發明中對於反應孔壁上殘留液，通過離心以及添加ROX校準染料克服移液誤差；通過將反應板架空在冰盒子中加樣以及使用ABI公司原裝96孔板熱封膜封口來較少蒸發對反應結果的影響，將反應體系減少為 10ul，定量PCR的反應液相對較貴，這就造成實驗成本過高，影響檢測方法投入實際應用， 採用小體積的反應體系做定量PCR大大降低的實驗體系能大大減小實驗成本，使高通量檢測成為可能。所述的提取DNA的方法為用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取，採用該方法提取DNA具有以下優點⑴、節約時間只需要2-3個小時即可提取到樣品的DNA，與傳統的有機溶劑抽提法所需要的一天甚至二天比起來大大減少了預處理的時間；O)DNA提取過程中基本不發生降解；(3) DNA提取效率穩定，提取結果具有很好的重複性；(4)與反覆的有機溶劑抽提相比避免了與有毒物質的直接接觸，保障了實驗操作人員的工作環境。
本發明的有益效果(1)已知濃度的藻細胞梯度稀釋，然後分別提取各個梯度稀釋藻細胞的DNA將其作為標準品，這就避免了 DNA提取效率的誤差，實現了精確定量；(2)可以精確區分各類藻，並且樣品可以保存半年甚至多年，有利於將各個季節的樣品進行對比分析；(3)優化了定量PCR實驗的反應液體系，只需要IOul混合反應液，而一般實驗需要20ul甚至更多的反應液才能得出準確的數據，大大節約了檢測成本，使得高通量檢測成為可能；(4)採集低至0. Iml水樣就可以進行實驗檢測，當需要採集很多不同樣品時，採樣量低更方便快捷，攜帶及後處理更方便。
具體實施例方式DNeasy Blood & Tissue Kit 試劑盒提取 DNA 的步驟如下1)將IOOul水樣吸入1. 5ml的離心管中，加入180ul ATL緩衝液和20ul蛋白酶 K，震蕩混勻，然後將離心管放入設置恆溫56°C的搖床中震蕩1個半小時；2)在搖床中取出離心管，加入400 μ 1緩衝液BU200ul緩衝液與200ul無水乙醇的混合液)，震蕩混勻後將混合液吸入DNA提取專用管中，在7000g的離心力下離心1分鐘；3)將上層離心管置於新的2ml離心管中，加入500 μ 1的緩衝液AW1，在7000g的離心力下離心1分鐘，去除下層離心管；4)把上層液體放入新的2ml離心管，加入500 μ 1的緩衝液AW2，在20000g的離
心力下離心分離3分鐘，更換下層離心管並重新離心一次以確保上層離心管中沒有液體殘留；5)將上層離心管置於新的2ml離心管中，加入150ul的AE溶液，靜置1分鐘，然後於7000g的離心力下離心1分鐘，收集下層離心管中的溶液即為提取並純化完成的DNA。實施例1引物的設計(1)從 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ 網點的 genbank 中下載產毒銅綠微囊藻 mcyA 基因序列(accession no. AF139330)；(2)將序列輸入到I^rimer Premier 5. 0，設計出滿足定量PCR要求的引物，由於定量PCR要求擴增產物片段長度為50-150bp，經過篩選，我們確定了一對擴增產物片段長度為112bp的引物，即正向引物mcya :5-TATCATCTAGCCATTCTCGCATCT-3(SEQ ID NO 1)；反向引物mcyb 5-AAATTTACAGCCAAACATCGG-3 (SEQ ID NO 2)；(3)引物特異性的驗證軟體驗證採用NCBI的引物設計和特異性檢驗工具I^rimer-BLAST驗證引物的特異性，顯示引物特異性很好；實驗驗證驗證結果見實施例3中的實例1、2和3。實施例2標準品的準備(1)採用顯微鏡計數的檢測方法，配製好濃度為2. 7*107個/L濃度的產毒銅綠微
囊藻；
(2)將2. 7*107個/L濃度的產毒銅綠微囊藻按照三分之一梯度稀釋，分別稀釋成濃度為 9*106 個/L、3*106 個/L、l*106 個/L、3. 3*105 個/L 的標準品；(3)用DNeasy Blood & Tissue Kit提取標準品中的DNA，保存在零下20攝氏度待用。每一次定量PCR反應都需要加入標準品進行實驗，配製好反應預混液(包含5ul SYBR Premix Ex Taq 溶液，0.2ul ROX Reference 溶液，0. 25ul 的 IOmM 濃度的正向引物禾口反向引物，2. Sul的DEPC水)並用移液槍轉移到96孔反應板的反應孔中，在對應的反應孔中加入1. 5ul標準品及待測樣品的DNA，通過乂印01^ Software v2. O點擊開始實驗，實驗結束後系統即自動生成標準曲線和待測樣品的濃度，標準曲線以產毒銅綠微囊藻細胞濃度為橫坐標，CT值即達到螢光閾值時的循環數為縱坐標。實施例3引物序列的實驗驗證實例1(1)取已知濃度(顯微鏡計數)為1*106個/L的實驗室純種培養的產毒銅綠微囊藻 IOOul，用 DNeasy Blood & Tissue Kit 提取 DNA 並保存待測；(2)預先配製好定量PCR的反應預混液，包含5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0. 2ul ROX Reference溶液，0. 25ul的IOmM濃度的正向引物和反向引物，2. 8ul的DEPC水；(3)將反應預混液轉移至96孔反應板的反應孔中，將步驟(1)中提取的DNA取 1. 5ul及1. 5ul實施例2中的標準品DNA加入對應的反應孔中通過M^One Software v2. 0 點擊開始實驗，反應條件為95°C下熱變性10分鐘，然後進入40個循環的擴增階段，95°C變性10秒，62°C擴增10秒，擴增的同時掃描螢光信號，實驗結束後系統即自動生成標準曲線及根據每一輪擴增掃描到的信號強弱對比標準品的信號強弱得出樣品中產毒銅綠微囊藻的濃度，三個重複實驗結果分別為9. 96*105個/L、9. 91*105個/L、1. 02*106個/L0實例21)取顯微鏡計數為1*106個/L的小球藻、纖細裸藻、不產毒的銅綠微囊藻，節球藻混成IOOul溶液，用DNeasy Blood & Tissue Kit按照標準步驟提取DNA並保存待測；2)預先配製好定量PCR的反應預混液，包含5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0. 2ul ROX Reference溶液，0. 25ul的IOmM濃度的正向引物和反向引物，2. 8ul的DEPC水；3)將反應預混液轉移至96孔反應板的反應孔中，將步驟(1)中提取的DNA取 1. 5ul及1. 5ul實施例2中的標準品DNA加入對應的反應孔中通過M^One Software v2. 0 點擊開始實驗，反應條件為95°C下熱變性10分鐘，然後進入40個循環的擴增階段，95°C變性10秒，62°C擴增10秒，擴增的同時掃描螢光信號，實驗結束後系統自動生成標準曲線及根據每一輪擴增掃描到的信號強弱對比標準品的信號強弱得出樣品中產毒銅綠微囊藻的濃度，本實例中三個重複實驗結果分別都低於檢測線，說明樣品中沒有產毒銅綠微囊藻的存在。實例31)取已知濃度(顯微鏡計數)為1*106個/L的實驗室純種培養的產毒銅綠微囊藻50ul，並混入50ul的小球藻、纖細裸藻、不產毒的銅綠微囊藻，節球藻混合液，用DNeasy Blood & Tissue Kit按照標準步驟提取DNA並保存待測；2)預先配製好定量PCR的反應預混液，包含5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0. 2ulROX Reference溶液，0. 25ul的IOmM濃度的正向引物和反向引物，2. 8ul的DEPC水；3)將反應預混液轉移至96孔反應板的反應孔中，將步驟(1)中提取的DNA取 1. 5ul及1. 5ul實施例2中的標準品加入對應的反應孔中通過St印One Software v2. 0點擊開始實驗，反應條件為95°C下熱變性10分鐘，然後進入40個循環的擴增階段，95°C變性 10秒，62°C擴增10秒，擴增的同時掃描螢光信號，實驗結束後系統即自動生成標準曲線及根據每一輪擴增掃描到的信號強弱對比標準品的信號強弱得出樣品中產毒銅綠微囊藻的濃度，三個重複實驗結果分別為4. 87*105個/L、5. 01*105個/L、4. 93*105個/L，結果顯示其他藻的存在對本檢測方法無影響。實例1、2、3的結果表明定量PCR檢測方法得到的結果具有很好的重複性，並且跟顯微鏡計數的結果一致，說明設計的引物序列具有特異性，用該引物序列進行定量PCR檢測水腫產毒銅綠微囊藻是一種有效的檢測方法。實施例4用實施例1中設計的引物序列進行定量PCR檢測待測水體中產毒銅綠微囊藻的濃度。(1)採集湖泊或河流中的水樣作為待測樣品；(2)取待測樣品lOOul，用DNeasy Blood & Tissue Kit按照標準步驟提取DNA並保存待測；(3)配製定量PCR反應的反應液體系1. 5ul樣品DNA溶液，5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0. 25ul的IOmM濃度的正向引物和反向引物，2. 8ul 的DEPC水，每個樣品做三次重複，使用IOul量程的排槍操作，降低移液槍槍頭殘留溶液的影響；(4)將反應液體系轉移至96孔反應板的反應孔中，將步驟(1)中提取的DNA取 1. 5ul及1. 5ul實施例2中的標準品DNA加入對應的反應孔中通過M^One Software v2. 0 點擊開始實驗，反應條件為95°C下熱變性10分鐘，然後進入40個循環的擴增階段，95°C變性10秒，62°C擴增10秒，擴增的同時掃描螢光信號，實驗結束後系統即自動生成標準曲線及根據每一輪擴增掃描到的信號強弱對比標準品的信號強弱得出樣品中產毒銅綠微囊藻的濃度，三個重複實驗結果分別為1. 42*107個/L、1. 3*107個/L、1. 35*107個/L,說明待測水樣中含有產毒銅綠微囊藻，此結果說明利用實施例1中設計的引物序列進行PCR能有效檢測待測水體中的產毒銅綠微囊藻的濃度。
權利要求
1.一種檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的引物序列，其特徵在於，包括正向引物和反向引物，其鹼基序列為正向引物TATCATCTAGCCATTCTCGCATCT ；反向引物AAATITACAGCCAAACATCGG。
2.一種用權利要求1所述的引物序列檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的方法，其特徵在於，包括(1)提取待測水樣中產毒銅綠微囊藻細胞的DNA，以提取的DNA為模板，用權利要求1 所述的正向引物和反向引物進行定量PCR擴增並記錄下達到螢光閾值時的循環數；(2)將步驟(1)中得到的循環數參照定量PCR測定產毒銅綠微囊藻細胞濃度的標準曲線得到待測水樣中產毒銅綠微囊藻細胞的濃度。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述標準曲線的標準品為從已知濃度梯度的產毒銅綠微囊藻細胞中提取的DNA。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的定量PCR的反應體系為1.5ul DNA 溶液，5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0. 25ul IOmM濃度的正向弓I物和反向引物，2. 8ulDEPC水。
全文摘要
本發明公開了一種檢測水體中產毒銅綠微囊藻濃度的引物序列及方法，屬於分子生物學領域，包括(1)提取待測水樣中產毒銅綠微囊藻細胞的DNA，以提取的DNA為模板，用本發明公開的引物序列進行定量PCR擴增並記錄下達到螢光閾值時的循環數；(2)將步驟(1)中得到的螢光強度參照定量PCR測定產毒銅綠微囊藻細胞濃度的標準曲線得到待測水樣中產毒銅綠微囊藻細胞的濃度。本發明的引物特異性高，能夠迅速，精確的檢測處水體中產毒銅綠微囊藻細胞的濃度。
文檔編號C12N15/11GK102392077SQ20111038060
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者朱金餘, 陳紅 申請人:浙江大學