一種利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其專用雙鏈RNA的製作方法

2023-06-17 19:14:11

專利名稱：：一種利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其專用雙鏈RNA的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其專用雙鏈RNA。
背景技術：
：菸草花葉病包括菸草普通花葉病[Tobaccomosaicvims(TMV)]和黃瓜花葉病[Cucumbermosaicvirus(CMV)]，是我國煙區的主要病毒病害，影響菸葉產量和品質，造成嚴重經濟損失。由於對植物病毒病害還缺乏有效的防治藥劑，而且TMV病毒存活期長、汁液傳毒易於病害的傳播；而CMV侵染寄主來源廣泛，有翅蚜蟲傳播利於病害的快速流行，加之菸草對兩種病害的抗原狹窄，且與劣質基因連鎖，常規育種手段很難育成優質、多抗的菸草品種。目前菸葉生產中所應用的主栽品種大多為中抗或感病品種，更沒有能夠兼抗兩種病毒的品種，所以應用現代生物技術手段挖掘新的抗病毒方法具有重要意義。利用雙鏈RNA(dsRNA)介導的幹擾機制可以將任何目的基因序列插入RNA幹涉載體，並獲得基因沉默效應。當dsRNA進入細胞後，被一禾中dsRNA特異的核酶內切酶Dicer識別，切割成2123bp的小片段，siRNA與RNA誘導的沉默複合體結合，並且作為模板識別目的mRNA;然後mRNA與dsRNA的正義鏈發生鏈互換，原先dsRNA中的正義鏈被mRNA代替，從dsRNA複合體中釋放出來，而mRNA則處於原先的正義鏈的位置；Dicer在同樣位置對mRNA進行切割，這樣又產生了2123bp的dsRNA小片段，與特異的核酶內切酶RISC結合，再次對目標RNA進行切割，從而使目的基因沉默。從作用機制上也是細胞抵禦外來基因的一種手段。Powell等(PowelABELP,NelsonRS,DeB,"Delayofdiseasedevelopmentintransgenicplantsthatexpressthetobaccomosaicviruscoatproteingene.Science,1986,232:738743)首次將TMV外殼蛋白(Coatprotein,CP)基因轉入菸草，培育出能穩定遺傳的抗病毒植株，但後來研究發現外殼蛋白基因介導的抗病性主要在病毒侵染早期起作用，推遲發病，在侵染基數較高、有反覆再侵染的情況下不能有效地控制病害的危害。
發明內容本發明的目的是提供一種雙鏈RNA。本發明所提供的雙鏈RNA，名稱為TMV-CMV-RNAi，是由正義鏈和反義鏈組成的雙鏈RNA;所述正義鏈為下述l)或2)的RNA片段1)其核苷酸序列是序列表中序列3;2)在嚴格條件下可與序列表中序列3限定的RNA序列雜交的核苷酸序列；所述反義鏈為下述3)或4)的RNA片段3)其核苷酸序列是序列表中序列4;4)在嚴格條件下可與序列表中序列4限定的RNA序列雜交的核苷酸序列。上述雙鏈RNA的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。上述雙鏈RNA的編碼基因，其特徵在於所述正義鏈的編碼序列為如下a)或b)的DAN片段a)其核苷酸序列是序列表中序列5;b)在嚴格條件下可與序列表中序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述反義鏈的編碼序列為如下c)或d)的DNA片段.-c)其核苷酸序列是序列表中序列6;d)在嚴格條件下可與序列表中序列6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。含有上述雙鏈RNA編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。本發明的另一個目的是提供一種培育抗CMV和TMV植物的方法。本發明所提供的培育抗CMV和TMV植物的方法，是將含有上述雙鏈RNA編碼基因的重組表達載體導入植物中，得到抗CMV和TMV的植物。本發明的培育抗CMV和TMV植物的方法，適合於CMV或TMV能侵染的各種植物，包括單子葉或雙子葉植物、草本、灌木或木本植物等，如菸草。本發明將CMV和TMV各株系外殼蛋白基因的保守區作為靶序列設計了雙鏈RNA，實驗證明該雙鏈RNA可降解目的RNA，提高植物抗CMV和TMV的能力。通過RNA幹擾來增強植物的抗病性，避免了其raRNA的翻譯，不產生病毒蛋白，避免了安全性方面的問題。圖1為重組表達載體pUCCRNAi-2TC的物理圖譜圖2為重組表達載體pUCCRNAi-2TC經PstIS每切後的酶切鑑定結果圖3為轉基因植株的實時PCR擴增CMVCP片段曲線圖及標準曲線圖圖4為轉基因植株的實時PCR擴增TMVCP片段曲線圖及標準曲線5為導入本發明的雙鏈RNA編碼基因的重組表達載體pUCCRNAi-2TC的轉化材料(S3,S4,S5)與對照材料(S2)攻毒後抗病性表型比較圖6為表達載體pUCC2300-35S-0CS的物理圖譜圖7為獲得的TMV和CMV外殼蛋白幹涉耙序列片段的PCR產物具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1、用於培育抗C匿和T匿菸草的雙鏈RNA(TMV-CMV-RNAi)及其編碼DNA的合成1、針對RNA幹涉耙序列DNA的合成採集菸草的菸草普通花葉病病葉(TMV)和黃瓜花葉病病葉(CMV)，分別提取其總RNA。用Promega公司的反轉錄試劑盒(ReverseTranscriptionSystem)反轉錄合成cDNA第一鏈。根據已報導的TMV-cp和CMV-cp序列設計閱讀框引物，分別進行PCR。其中，用於擴增TMV-cp的引物TMV1:5，GTCTTACAGTATCACTACTC3，和TMV2:5，ACGTGCCTGCGGATGTATAT3，，得到的序列如序列表中序列1;用於擴增CMV-cp的引物CMV1:5，ATCAACCAGTGCTGGTCGTA3，和CMV2:5，GATGGCGGCAACGGATAA3，，得到的序列如序列表中序列2。將得到的TMV-cp序列和CMV-cp序列輸入NCBI進行不同株系序列比對，找出保守序列區域，確定RNA千涉的靶序列，其中，TMV幹涉的靶序列如序列表中序列7，CMV幹涉的靶序列如序列表中序列8，設計其PCR擴增引物。其中，擴增TMVRNA幹涉耙序列的引物為TMV-F:5'-TAGTCGACGTGTTCTTGTCATCAGCGTG-3'和TMV-R:5，ATGGATCCGTAGCATCTMCGTTTCGGC-3，，上下遊引物的5'端各引入SalI和BamHI;擴增CMVRNA幹涉耙序列的弓I物為CMV-F:5，GGAGATCTAACTTTAGAGTCCTGTCGC3，和CMV-R:5，GTGGATCCTTATCGAACTCAGTGACTG3，，上下遊引物的5'端各引入BglII和BamHI位點。以上述第一鏈cDNA為模板，分別以TMV-F和TMV-R、CMV-F和CMV-R為引物進行PCR，擴增得到的核苷酸序列命名為TMV-cpi(核苷酸序列如序列7所示)和CMV-cpi(核苷酸序列如序列8所示)。擴增條件為94。C變性lmin，65。C退火40S，72。C延伸lmin，共35個循環。72"C後延伸10min。4"C保溫。其中，TMV-cpi和CMV-cpi的PCR擴增結果如圖7所示，表明得到302bp的TMV-cpi和213bp的CMV-cpi。圖7中，1—6為TMV-cpi凝膠電泳結果，7—12為CMV-cpi的凝膠電泳結果，M為DNA分子量標準。2、TMV-CMV-RNAi幹涉表達載體pUCCRNAi-2TC的構建(1)TMV-cpi和CMV-cpi片段的連接將TMV-cpi和CMV-cpi的PCR產物分別插入到pMD18-T(購自大連TaKaRa公司)中得到重組載體pMD18-TMV-cpi和pMD18-CMV-cpi。然後用BglII和EcoRI酶切pMD18-CMV-cpi，回收213bp的CMV-cpi片段；用BamHI及EcoRI酶切pMD18-TMV-cpi，回收含有302bp的TMV-cpi片段的載體片段，與上述CMV-cpi片段連接，得到重組載體pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi。用SalI和BamHI酶切pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi，回收含有TMV-cpi-CMV-cpi的大小為515bp的片段。(2)構建—RNA-TMV-cpi-CMV-cpi幹涉載體pUCCRNA幹涉載體用XhoI和BglII酶切，回收載體，將上述515bp片段正向連接至酶切後的pUCCRNA幹涉載體的XhoI和BglII位點間，得到重組載體pUCC-TMV-CMV。用SalI和BamHI酶切pUCC-TMV-CMV，得到515bp的TMV-cpi-CMV-cpi片段。TMV-cpi-CMV-cpi片段的核苷酸序列如序列表中的序列5。(3)將反向序列連接至RNA幹涉載體用SalI和BamHI酶切pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi，回收含有TMV-cpi-CMV-cpi的515bp左右的片段，用和ifeydil酶切pUCC-TMV-CMV，回收酶切後的載體，將TMV-cpi-CMV-cpi反向連接至回收後的載體的SalI和B柳HI位點，得到重組載體pUCC-TMVcpi-CMVcpi。用PstI酶切該載體，酶切結果表明切出1.4kb左右的片段(含有TMV-cpi-CMV-cpi反向重複序列)。即為陽性克隆。(4)構建TMV-cpi-CMV-cpiRNA幹涉表達載體回收上述用PstI酶切pUCC-TMVcpi-CMVcpi得到的1.4kb的反向重複序列片段，將其插入用PstI酶切的表達載體pUCC2300-35S-ocs(物理圖譜如圖6所示)的PstI位點，得到重組質粒pUCCRNAi-2TC,如圖1所示。對pUCCRNAi-2TC用PstI進行酶切驗證，結果如圖2所示，表明得到1.4kb的目的片段。圖2中M:2000bpladder分子量標記；1:重組質粒pUCCRNAi-2TC經Pstl酶切後的條帶。pUCCRNAi-2TC的測序結果表明，插入的目的片段中含有TMV-cpi-CMV-cpi片段的正向序列和反向序列，該目的片段可編碼TMV-CMV-RNAi的正義鏈(核苷酸序列如序列3所示)和TMV-CMV-RNAi的反義鏈(核苷酸序列如序列4所示)。實施例2、培育抗CMV和TMV的轉基因菸草1、轉基因菸草的獲得pUCCRNAi-2TC經熱擊轉化法轉入根癌農桿菌LBA4404中，並在含有lOOmg/LKan(卡那黴素)和50mg/L利福平(Rif)的YEB培養基上篩選陽性菌株。利用與攜帶有重組質粒的農桿菌共培養方法進行烤菸(NicotianatabacumL.)品種K326(購自中國菸草北方育種中心)轉化。具體方法如下(1)無菌苗準備將菸草種子在37'C浸泡過夜，再用30%的次氯酸鈉消毒15rain，無菌水洗3-5次，轉移到裝有MS固體培養基的玻璃高瓶中，光照培養。(2)預培養將無菌苗葉片切除邊緣和中脈後切成0.5cmXO.5cm的小塊，置於MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培養基上預培養兩天。(3)農桿菌的準備從平板上挑取新鮮單菌落或凍存的液體菌種，接種到2ml附加相應抗生素的LB液體培養基中，28°C，200rpm，振蕩培養至OD6。。=0.6—0.8。(4)侵染將農桿菌菌液於室溫條件下，4000rpm，離心10min，沉澱懸浮於10mlMS液體培養基中，將預培養的葉片放入菌液中浸泡15min，期間輕輕搖動。(5)共培養取出葉片，置於無菌濾紙上吸去附著的菌液；放回MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培養基上，暗處共培養兩天。(6)選擇培養將經過共培養的葉片轉移到MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Kan(卡那黴素)(200mg/L)+Cef(羧苄黴素)(500mg/L)的分化培養基上，光照培養3-4周左右。(7)繼代培養當葉盤分化出抗性不定芽或產生抗性愈傷組織時，將這些抗性材料轉移到新的分化培養基中上進行繼代培養。(8)生根培養待不定芽長到lcm左右時，將其切下並轉到MS+Kan(卡那黴素)(200mg/L)+Cef(羧苄黴素)(500mg/L)生根培養基上，2周左右長出不定根，當不定根長到2-3cm時，取出植株，徹底清除根部培養基，移入土壤中培養。提取12株卡那黴素抗性苗的基因組DNA，利用PCR方法進行擴增。其中，利用引物TMV-F和TMV-RPCR擴增得到302bpTMV幹涉耙序列，並且利用弓I物C雨-F和CMV-RPCR擴增得到213bpCMV幹涉耙序列的植株為陽性植株。結果共得到3株陽性材料，分別命名為S3、S4、S5。同時，按照上述方法將pUCC2300-35S-ocs轉入烤菸(NicotianatabacumL.)品種K326，獲得3株轉入pUCC2300-35S-ocs的菸草，作為轉空載體對照。2、TMV和CMV抗病鑑定將獲得的PCR陽性植株移栽至溫室管理。煙株團棵期稱取各50g的實施例1步驟1中的經鑑定由TMV感染所致的菸草普通花葉病病葉和經鑑定由CMV感染所致黃瓜花葉病病葉，加適量石英砂一起研磨後用磷酸緩衝液(pH7.O)稀釋製成汁液，在轉pUCCRNAi-2TC菸草S3、S4、S5和未轉基因菸草S2的新葉上進行摩擦接種，調查各植株TMV和CMV的發病情況。1)應用RT-PCR和螢光定量PCR方法進行幹涉效果定量分析在本實驗中，對TMV-cp和CMV-cp基因的表達採用螢光定量RT-PCR來進行分析。螢光定量PCR技術具有很高的靈敏度，可以檢測低於100個拷貝的raRNA的表達。而且操作簡便，快速，有利於對樣本建立動態觀測。由於mRNA採用RT-PCR進行定量分析，還應該考慮反轉錄效率和mRNA的降解等問題。該實驗通過避免樣品間操作方法的差異和模板間的差異而減少試驗結果的誤差。通過稀釋目的基因的PCR產物，建立了穩定的，相關性好的標準曲線。這樣，可以保證檢測的準確度。用RNeasyPlantMini提取試劑盒，分別提取接種TMV和CMV病毒的轉pUCCRNAi-2TC菸草(S3、S4、S5)、接種TMV和CMV病毒的轉pUCC2300-35S-ocs菸草(S2)和未轉基因未感染TMV和CMV菸草(Sl)的總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈。利用TaKaRaRNAPCRKit試劑盒，以cDNA第一鏈為模板，分別以TMV-F、T匿-R和CMV-F、CMV-R為引物PCR擴增TMV-cpi和CMV-cpi序列。利用0pticonTM2螢光定量PCR檢測系統進行TMV-cp和CMV-cp的mRNA含量分析。以起始拷貝數分別為105(T5)、104(T4)、103(T3)、102(T2)禾B101(Tl)個TMV-cpi和CMV-cpi為標準品，分別作標準曲線。通過測定PCR產物的0D值計算產物的拷貝數，具體計算方法如下拷貝數計算公式(6.02x1023拷貝數/摩爾)x(DNA濃度g/ml)/(MWg/mo1)=拷貝數/ml.DNA濃度mg/ml=(0D26。)x50mg/ralMWg/mol(平均分子量)-片段鹼基數x660道爾頓/bp螢光定量PCR擴增中以SYBRGreenI為螢光染料，PCR體系(25ul):弓i物(10pmol/iil)各0.5iil，dNTPS(翻)lul，10XPCRBuffer2.5tU，TaqDNA聚合酶(5UA4)0.5u1，模板DNA1u1，SYBGREENI(10X)0.15u1。PCR反應條件為先94"C預變性5min;再94。C變性lmin，64。C退火lmin，72°。延伸1.5rain，32個循環;最後72。C延伸10min。對TMV-cpi(圖3)和CMV-cpi(圖4)的實時PCR擴增曲線圖、標準曲線及拷貝數(表1)進行分析。TMV-cpi的標準曲線方程為y=-0.22x+3.44，偏相關係數為r2=0.990;CMV-cpi的標準曲線方程y=-0.24x+8.70，偏相關係數為r2=0.995。兩個標準曲線具有很好的線性關係，所以，實驗結果能夠反映出不同樣品之間的差異。從結果上看，接種TMV和CMV病毒的對照材料S2的TMV和CMV的病毒RNA在煙株體內迅速積累，S2的TMV和CMV的拷貝數都明顯高於轉化材料S3，S4，S5。說明TMV-CMV-RNAi編碼基因己經在菸草植株內表達出本發明的雙鏈RNA，侵入的病毒RNA靶序列大部分被煙株體內的RNA小片段降解。表1.各樣品的Ct值及起始拷貝數(TMV和CMV)樣品Ct值起始拷貝數tableseeoriginaldocumentpage92)發病情況接種病毒15天後S2出現輕微的花葉症狀，20天時出現明顯的葉片巻曲、黃化症狀;轉化材料S3在15天時未見發病。一個月後對照煙株S2出現全株花葉、葉片呈蕨葉、植株嚴重矮化。而轉化植株則只有一株S5出現花葉，其餘S3、S4均未發病，對CMV和TMV表現免疫(圖5)。說明CMV和TMV外殼蛋白的RNA幹涉序列已經在T。代轉化材料中得到很好的表達，其CMV和TMV幹涉序列已經轉移到了菸草的基因組。9序列表<160〉8〈210〉1633<212〉廳人工序列<400〉1gtcttacagtatcactactccatctcagttcgtgttcttgtcatcagcgtgggccgaccc60aatagagtt3attaatttatgtattaatgccttaggaaatcsgtttcaaaC3cei3ca^gc120tcgaactgtcgttC犯3g3Caattcagtgaggtgtggaaaccttcaccacaagtaactgt180taggtttcctgacagtgacttt犯ggtgtacaggtacaMgcggtattagactcgctagt240cacagcactgttaggtgcattcgax:3ct3aaatsgaatssaaatcaggcg300a^ccccacg3ctgccgaaacgttagatgctacccgtagagtagatgacgcaacggtggcc360ataaggagcgctataaataatttaatagtag^ttgatcsgagg肌cc3gatcttataat420cggagctctttcgagagctcttatggtttggtttggacctctggtcctgcaacttg站gt480attcaagatgcataataaataacggattgtgtccgtaatc3C3Cgtg3tgcgtacgataa540cgcatagtgtttttccctccactta犯tcgaagggttgtgtcttggatcgcgcgggtc肌600atgtatatggttcatatacatccgcaggcacgt633〈210〉2<211〉403〈212〉DNA人工序列〈400〉2atcaaccagtgctggtcgtaaccgtcgacgtcgtccgcgtcgtggttcccgctccgcccc60ctcctccgcggatgctaactttagagtcttgtcgcagcagctttcgcgacttaataagac120gttagcagctggtcgtccaactattaaccacccaacctttgtaigggagtg38CgCtgt3g180acctgggtacacgttcacatctattaccctaaagccaccaaaaatagaccgtgggtxtta240tt3cggta^tacctgattcagtcacggaatatgataagaagcttgtttc300gcgcattcaaattcgagttaatcctttgccga^tttgattctaccgtgtgggtgacgLgt360ccgta犯gttcctgcctcctcggacttatccg"ttgccgccate403〈210〉3<211〉515<212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉3ua3cuuu3g3guccugucgca^cagcuuucgcgacuuaauaagacguuagcagcuggucg60ucc^cuanuaaccacccaaccuuugugggimguga^cgcuguagaccuggguacacguu120C￡lC￡LUCUaAl￡Lgicccimaagccuccg犯犯u卿ccgugggucuumiuanggimM3gguu180gcugcuuccuganuc3gucacugaguucgauaacguguucuugucancagcgugggcega240cccamiageiguaiiguamiaaugccuimggaaaucBguuuc300agcucga3cugUCgUUC^￡Lg￡LC￡iauucag卿ggugugga^ccuucacceicaaguaac360uguimgguuuccugacagugacuuimaggugimca^ggimcaaugcggumiuagacucgcu420agucacagcacuguimggugcsuucga^cimauagauguug3犯肌cag480gcgaaccccacgacugccgaa^cguuagaugcimc515<210〉4515<212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉4guagcaucua_acguuucggcagucgugggg皿cgccugauuuucaacaucuauuauucua60uuuuagugucgaaugcaccuaacagugcugugacuagcgagucuaauaccgcauuguacc120uguacaccuu3朋guc3cuguc3gga^3ccuaaca_guuacuuguggug犯gguuuccaca180CCUC3CUg33uugucuuuga3cg3C8guucgagcuuguuguguuugaaiacugaiiuuccim240acanaaaiiuaauuaacucuauugggucggcccacgcugaugacaagaaca300cguuaucg33cucagugacug犯uc3ggEi3gcagcaeiccuuuu3cc肌犯uaagscccsc360ggucu肌uuucggaggcuim8iggguuaimgaugug33cgugimcccsggucuscageguu420cacimccc3c犯3gguugggugguua_aimguuggacgacc3gcugcu33cgucuuanu33480gucgcgaaagcuguugcg3caggacucuaaaguua515<210〉5<211〉515<212〉DNA<213〉人工序列<400〉5gtagcatctaacgtttcggcagtcgtggggttcgcctgattttcaacatctattattcta60ttttagtgtcgaatgcacctaacagtgctgtgactagcgagtctaataccgcattgtacc120tgtacaccttaaagtcactgtcaggaaacctaacagttacttgtggtgaaggtttccaca180cctcactgaattgtctttgaacgacagttcgagcttgttgtgtttgaaactgatttccta240aggcattaatacataaattaattaactctattgggtcggcccacgctgatgacaagaaca300cgttatcgaactcagtgactgaatcaggaagcagc朋ccttttacc3t犯taagacccac兆0ggtctattttcgg3ggctta3gggttsit3gatgtg朋cgtgtaccc3ggtctscsgcgtt420cactacccacaaaggttgggtggttaatagttggacgaccagctgctaacgtcttattaa480gtcgcgaaagctgttgcgacaggactctaaagtta5156515<212〉DNA<213〉人工序列<400〉6taactttagagtcctgtcgcaacagctttctccaactattaaccacccaacctttgtgggcacatctataacccttaagcctccgaaaatgctgcttcctgattcagtcactgagttcgacccaatagagttaattaatttatgtattaaagctcgaactgtcgttcaaagacaattcagtgttaggtttcctgacagtgactttaaggtagtcacagcactgttaggtgcattcgacacgcgaaccccacgactgccgaaacgttagatgcg6ictta_at犯g3Cgtt3gtagtgaacgctgtagacctg8gaccgtgggtctt3ttatgtaacgtgttcttgtcatcagtgccttaggaaatcagtttctgaggtgtggaaaccttcacgtacaggtacaatgcggtattaaaat3g犯ta^tsg3tgtgctac12cagctggtcg60ggtacacgtt120gt3333ggtt180cgtgggccga240aaacacaaca300cacaagtaac360tagactcgct420tgaaaatcag480515〈210〉7302DNA<213〉人工序列〈400〉7cgtgttcttgtcatcagcgtgggccgacccaatagagttaattaatttatgtattaatgc60cttaggaaatcagtttcaaacacaacaagctcgaactgtcgttcaaagacaattcagtgei120ggtgtggaaaccttcaccacaagtaactgttaggtttcctgacagtgactttaaggtgta180caggtacaatgcggtattagactcgctagtcacagcactgttaggtgcattcgacactaa240aatagaataataga/tgttgaaaatcaggcgaaccccacgactgccgaaacgttagatgct300ac302<210〉8<211〉213<212〉DNA人工序列〈400〉8taactttagagtcctgtcgcaacagctttcgcgacttaataagacgttagcagctggtcg60tccaactattaaccacccaacctttgtgggtagtgaacgctgtagacctgggtacacgtt120cacatctataacccttaagcctccgaaaatagaccgtgggtcttattatggtaaaaggtt180gctgcttxctgattcagtcactgagttcgataa21權利要求1、一種雙鏈RNA，是由正義鏈和反義鏈組成的雙鏈RNA；所述正義鏈為下述1)或2)的RNA片段1)其核苷酸序列是序列表中序列3；2)在嚴格條件下可與序列表中序列3限定的RNA序列雜交的核苷酸序列；所述反義鏈為下述3)或4)的RNA片段3)其核苷酸序列是序列表中序列4；4)在嚴格條件下可與序列表中序列4限定的RNA序列雜交的核苷酸序列。2、權利要求1所述雙鏈RNA的編碼基因。3、根據權利要求2所述的基因，其特徵在於所述正義鏈的編碼序列為如下a)或b)的DNA片段a)其核苷酸序列是序列表中序列5;b)在嚴格條件下可與序列表中序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述反義鏈的編碼序列為如下c)或d)的DNA片段C)其核苷酸序列是序列表中序列6;d)在嚴格條件下可與序列表中序列6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體。5、根據權利4所述的載體，其特徵在於所述重組表達載體為如圖l所示的pUCC腿i-2TC。6、含有權利要求2或3所述基因的轉基因細胞系。7、含有權利要求2或3所述基因的重組菌。8、一種培育抗CMV和TMV植物的方法，是將權利要求4或5所述的含有所述雙鏈RNA編碼基因的重組表達載體導入植物中，得到抗CMV和TMV的植物。9、根據權利8所述的方法，其特徵在於所述植物為雙子葉植物。10、根據權利9所述的方法，其特徵在於所述雙子葉植物為菸草。全文摘要本發明公開了一種利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其專用雙鏈RNA。該雙鏈RNA，是由正義鏈和反義鏈組成的雙鏈RNA；所述正義鏈的序列是序列表中序列3，或在嚴格條件下可與序列表中序列3限定的RNA序列雜交的核苷酸序列；所述反義鏈的核苷酸序列是序列表中序列4，或在嚴格條件下可與序列表中序列4限定的RNA序列雜交的核苷酸序列。該培育抗CMV和TMV植物的方法，是將含有上述雙鏈RNA編碼基因的重組表達載體導入植物中，得到抗CMV和TMV的植物。該雙鏈RNA可降解目的RNA，提高植物抗CMV和TMV的能力。通過RNA幹擾來增強植物的抗病性，避免了其mRNA的翻譯，不產生病毒蛋白，避免了安全性方面的問題。文檔編號C07H21/02GK101186629SQ20071018791公開日2008年5月28日申請日期2007年11月15日優先權日2007年11月15日發明者萬秀清,儲成才,郭兆奎,顏培強申請人:黑龍江省菸草科學研究所