BiP蛋白抗原表位多肽及其篩選方法與應用的製作方法

2023-07-11 14:26:21

專利名稱：：BiP蛋白抗原表位多肽及其篩選方法與應用的製作方法
技術領域：
：木發明屬於免疫學領域，涉及抗原表位多肽的篩選、免疫學方法的建立以及臨床診斷試劑的應用，尤其是涉及BiP蛋白抗原表位多肽的篩選，得到具有診斷意義的最佳BiP蛋白抗原表位多肽對應的胺基酸序列，以及建立檢測患者血清中最佳BiP蛋白抗原表位多肽IgG抗體的免疫學方法，以及將其作為抗原在製備診斷類風溼關節炎的藥物中的應用。
背景技術：
：類風溼關節炎(RheumatoidArthritis,RA)是一種以慢性破壞性關節炎為主的全身性自身免疫病，主要表現為受累關節的疼痛、腫脹，或有皮下結節、低熱、貧血等關節外表現。其基本病理變化為慢性滑膜炎，病變可侵及滑膜下軟骨和骨，造成關節破壞，導致畸形。RA在我國的患病率為0.32%-0.38%(施桂英，慄佔國.關節炎概要.中國醫藥科技出版社.2003;24)，全國近500萬患者，致殘率高達93%，是造成喪失勞動力和致殘的主要疾病之一。本病的病因仍不十分清楚，一般認為與遺傳、免疫功能紊亂、感染等有關。臨床上缺乏特異性的血清學標誌。1987年美國風溼病協會診斷標準中類風溼因子(RF)是唯一的血清學指標，但RF在類風溼病人中的陽性率為70。/。，並且見於19%的其他系統性風溼性疾病，並且在感染性疾病、腫瘤和正常老年人中均可呈陽性。所以近年來，不少學者致力於RA相關的新抗原及自身抗體的研究，為認識該病的發病過程及診斷提供依據。這些抗體包括RA33(敏感性29-36%，特異性40-87%)(MeyerO,TauxeF，FabregasDetal.Anti-RA33antinuclearautoantibodyinrheumatoidarthritisandmixedconnectivetissuedisease:comparisonwithantikeratinandantiperinuclearantibodies.ClinExpRheumatol,1993;ll(5):473-478.)、抗CCP抗體(敏感性60-80%,特異性98%)(SchellekensGA,deJongBA，vandenHoogenFHetal.Citrullineisanessentialconstituentofantigenicdeterminantsrecognizedbyrheumatoidarthritis-specificautoantibodies.JClinInvest,1998;101(1):273-281.)、抗Sa抗體(敏感性22-40%，特異性85-100%)(HueberW,HassfeldW,SmolenJSetal.Sensitivityandspecificityofanti-Saautoantibodiesforrheumatoidarthritis.Rheumatology,1999;38(2):155-159.)、AKA(敏感性27-47%，特異性84-94%)、APF(敏感性29-79%，特異性89-98%)(vanBoekelMA,VossenaarER，vandenHoogenFHJetal.Autoantibodysystemsinrheumatoidarthritis:specificity,sensitivityanddiagnositicvalue.ArthritisRes,2002;4(2):87-93.)等。人內質網分子伴侶(theimmunoglobulinheavychainbindingprotein,BiP)，是在內質網上穩定表達的一種應激蛋白，屬於熱休克蛋白70(Hsp70)家族中的一員(OrtizC,CardemilLHeat-shockresponsesintwoleguminousplants:acomparativestudy.JExpBot，2001;52(361):1711-1719.)。其在促進蛋白前體進入內質網、蛋白質的摺疊和轉運中發揮重要作用(J0rgensenMM，JensenON,HoistHUetal.Grp78isinvolvedinretentionofmutantlowdensitylipoproteinreceptorproteinintheendoplasmicreticulum.JBiolChem,2000;275(43):33861-33868.)。研究發現，BiP還是一種可以引起RA特異性T、B細胞免疫效應的靶抗原，其在RA的發生中具有非常重要的作用(BlassS，HaferkampC，SpeckerCetal.Rheumatoidarthritis:autoreactiveTcellsrecognisinganovel68kautoantigen.AnnRheumDis,1997;56(5):317-322.)。前期國外及我們的研究已證實抗BiP抗體對RA的診斷具有很好的價值(陳巧林，何文智，李想等.人內質網分子伴侶BiP的克隆、表達及其在RA患者血清抗體檢測中的作用.現代免疫學，2007;27(2):104-108.Bodman-SmithMD,CorrigallVM,BerglinEetal.AntibodyresponsetothehumanstressproteinBiPinrheumatoidarthritis.Rheumatology(Oxford),2004;43(10):1283-1287.)，但BiP在RA發生中的作用機制仍不清楚，尚無對其抗原表位的相關研究。對BiP抗體所識別部位的分析可以提供有關該蛋白結構方面的信息，通過研究也可以進一步了解BiP蛋白的結構與功能的關係。另外，確定其抗原表位對於提高BiP在RA的診斷價值、研究其在RA的發病機制及免疫治療方面的作用具有重要意義。
發明內容針對前述研究現狀及類風溼關節炎臨床血清學診斷需求，本發明的目的在於提供一種新的BiP蛋白抗原表位多肽，以及其對應的胺基酸序列。所述的BiP蛋白抗原表位多肽可以特異性地檢測類風溼關節炎患者血清中的抗BiP蛋白多肽IgG抗體，該抗體檢測結果顯示在RA患者血清中的陽性率高，而其他對照疾病(乾燥症候群、系統性紅斑狼瘡)及正常人群血清中陽性率很低(系統性紅斑狼瘡及正常人陽性率為零)，完全符合臨床實驗室診斷的需要。因而所述的BiP蛋白抗原表位多肽可以被提供作為RA患者臨床血清學診斷用抗原。本發明的第二個目的在於提供所述的BiP蛋白抗原表位多肽的篩選方法。本發明採用新的生物信息學方法結合免疫檢測分析方法，篩選獲得可作為RA抗原BiP蛋白的抗原表位多肽。本發明的第三個目的在於提供一種將含有所述BiP蛋白抗原表位多肽或其衍生物作為抗原用於檢測RA患者血清抗BiP蛋白多肽IgG抗體的方法，即單特異性ELISA法。木發明對所述的免疫學檢測方法的各種條件(包被緩衝液、抗原包被濃度、一抗稀釋液及封閉液等)均進行了優化，並得到實驗驗證。本發明的第四個目的在於提供所述的BiP蛋白抗原表位多肽在製備用於診斷RA的藥物的應用。該應用是基於所述的BiP蛋白抗原表位多肽測定抗BiP蛋白多肽IgG抗體在RA診斷中的價值評定。具體地，本發明所述的BiP蛋白抗原表位多肽可以用於製備RA的臨床診斷試劑盒。根據木發明的第一個目的，本發明提供了一種BiP蛋白抗原表位多肽，所述多肽是如下(a)或(b)的多肽(a)、由SEQIDNO.l所示的胺基酸序列組成的多肽，該胺基酸序列如下NH3-Gly-Val-Leu墨Ser-Gly-Asp-Gln陽Asp-Thr-Gly-Asp-Leu-Val-Leu陽COOH(b)、在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。SEQIDNO.l所示多肽為BiP蛋白序列中的部分胺基酸殘基。根據本發明的第二個目的，本發明所述的BiP蛋白抗原表位多肽的篩選方法，包括以下步驟A)選取人全長BiP蛋白基因序列開放閱讀框(ORF)1962nt(223-2184nt)核酸序列對應的胺基酸序列為對象，採用Standard、Karplus、Emini、Amphiphi、Pellequer五種關於抗原表位預測的標準方法(OdoricoM,PellequerJL.BEPITOPE:predictingthelocationofcontinuousepitopesandpatternsinproteins.JMolRecognit,2003;16(l):20-22.)，分析上述654aa長度的BiP蛋白二級結構，確定其抗原決定簇；B)按抗原趨勢指數排列，計算分析得出較好的抗原表位序列，合成候選的若干條多肽，通過免疫檢測，篩選得到與類風溼關節炎患者血清IgG抗體反應最強的抗原多肽，即(a)多肽；C)通過在上述(a)多肽上經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸重新合成一系列多肽，經免疫檢測得到類似於步驟B中獲得的抗原多肽與類風溼關節炎患者血清IgG抗體反應的多肽及其衍生物，從而得到具有抗原表位活性的(b)多肽，即(a)多肽的衍生物。本發明所述的BiP蛋白抗原表位多肽其對應的衍生物，均可以很好檢測抗BiP蛋白多肽IgG型抗體。迄今為止，國內外尚無關於該多肽(包括篩選到的抗原表位多肽及衍生多肽)序列的抗原性、該多肽檢測血清中對應抗體的方法及其作為抗原在類風溼關節炎診斷中的應用。本發明所述的BiP蛋白抗原表位多肽可以用本領域人員所熟知的方法得到，例如固相合成法等。上述所選取的人全長BiP蛋白基因序列ORF1962nt基因序列來源於NCBI(>gi|16507237|reflNP—005338.11heatshock70kDaprotein5(glucose-regulatedprotein,78kDa)[Homosapiens])。根據發明的第三個目的，本發明提供了一種用於檢測類風溼關節炎患者血清抗BiP蛋白多肽IgG抗體的免疫學方法，即將木發明所述的BiP蛋白表位多肽作為抗原，採用單特異性ELISA法檢測類風溼關節炎患者血清抗BiP蛋白多肽IgG抗體。酶聯免疫吸附法(ELISA)的原理是將純化的、已鑑定生化特性的抗原包被在固相的聚苯乙烯微孔板上；若為抗體陽性，已稀釋的血清中的特異性抗體將與包被在固相上的抗原結合；第二步，過氧化物酶標記的抗人抗體與已結合的抗體反應；第三步，結合的標記抗體與色原底物溶液作用後而呈現顏色。顏色的深淺與血清標木中抗體的濃度成正比。ELISA檢測產品大致可以分為三種"單特異性ELISA"試劑盒(包被有單特異性抗原)可提供對一種抗體的定量體外檢測；"抗體譜ELISA"試劑盒可在一條微孔板上對多種不同抗體分別進行半定量體外檢測；"混合ELISA"試劑盒的固相包被有混合抗原，可半定量檢測多種抗體，而其單特異性需進一步檢測。ELISA檢測中，由於抗原抗體反應需要必須的結合條件(pH值、離於濃度和等電點等)，本發明中發明人在實驗初始階段，發現抗原抗體反應較弱，後期經過一系列pH值及反應離子濃度(包括pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.00.05mol/L的碳酸鹽緩衝液等)的調整後，確定了穩定的最佳包被緩衝液(pH9.60.05mol/L的碳酸鹽緩衝液)；②另外包被抗原的濃度過高和過低都會影響ELISA檢測的效果，尤其在臨床患者血清抗體滴度不平衡的情況下，選擇抗原多肽的最佳包被濃度是ELISA檢測的關鍵要素。對此本發明發明人進行了相應的實驗，將所述BiP蛋白抗原表位多肽經多次不同範圍的梯度稀釋後進行反應，具體經過3次梯度稀釋，包被量分別為lng、10ng、100ng、500ng、1000ng;50ng、100ng、200ng;80ng、90ng、100ng、110ng、120ng。最終確定了檢測多肽的最佳包被量(100ng)，以此包被量進行血清抗體檢測，效果最好；③關於一抗(血清)稀釋液和稀釋倍數，通過經驗，確定了以含0.2%酪蛋白(casein)的Tris-HCl緩衝溶液(pH6.0)稀釋100倍後加入(100pl/孔)，效果最佳；再有，關於對血清中抗原抗體非特異性反應的阻止問題，也是臨床ELISA檢測試劑能很好應用的另一關鍵因素。木發明發明人通過所在研究小組以往的經驗，分別採用1%0VA/PBS、1%BSA/PBS、P/。BSA的PBS-T、1%脫脂奶粉/PBS及封閉用正常用兔血清等，通過臨床血清樣木檢測反應背景比對，最終確定運用以含1。/。BSA的0.05yo吐溫的磷酸鹽緩衝液(1%BSAPBS-T)溶液作為封閉液37。C封閉2h，這樣可以使得抗BiP蛋白多肽抗體檢測的特異性能達到最佳。通過以上各種條件的優化，木發明中發明人將含有所述BiP蛋白抗原表位多肽(SEQIDNO.l)按一定濃度，包被在固相的聚苯乙烯微孔板上，然後加入臨床確診的類風溼關節炎患者血清及對照組血清，最終加入過氧化物酶標記的抗人IgG抗體，除以上優化條件外，其他環節與常規單特異性ELISA相同。本發明經過優化建立的單特異性ELISA方法可以很好的檢測臨床RA患者血清的抗IgG抗體，實驗結果顯示，該方法得到的RA患者血清抗BiP蛋白多肽IgG抗體的陽性率高、其疾病檢測的特異性強，符合臨床診斷疾病的要求。與現有技術相比，本發明所述的BiP蛋白抗原表位多肽測定抗BiP蛋白多肽IgG抗體在類風溼關節炎診斷中的價值評定有明顯的優勢，詳述如下德國學者Bmb等於1995年從滑膜總蛋白成分中分離出一種與RA相關的糖蛋白成分(GRP)p68，並發現其抗體對RA的診斷敏感性和特異性分別為64%、99%(B1SPS,peckerC，acomekHJetal.Novel68kDaautoantigendetectedbyrheumatoidarthritisspecificantibodies.AnnRheumDis,1995;54(5):355-360.)。其後很多學者相繼開展了BiP抗體檢測工作，Blass研究組採用從Hela細胞提取純化得到的BiP蛋白進行檢測抗體，也證實有一定的檢測價值，在RA患者中有63%陽性率，其它疾病對照組僅為7%(BlassS,UnionA，RaymackersJetal.ThestressproteinBiPisoverexpressedandisamajorBandTcelltargetinrheumatoidarthritis.ArthritisRheum，2001;44(4):761—771.)。國內，孫曉雲等以Hda細胞為材料，利用間接免疫螢光檢測BiP蛋白在類風溼關節炎患者血清中的陽性率，發現敏感性和特異性分別為67.8%和91.3%(孫曉雲，穆榮，慄佔國.抗p68抗體的檢測及其在類風溼關節炎中的意義.中華風溼病學雜誌，2004,9(8):528-530.)。CorrigallVM研究小組通過大腸桿菌表達的BiP蛋白檢測患者血清抗體，證明BiP抗體在確診RA患者中敏感性和特異性分別為73%、71%,在早期RA患者中的敏感性和特異性分別為66%和65%(Bodman-SmithMD，CorrigallVM，BerglinEetal.AntibodyresponsetothehumanstressproteinBiPinrheumatoidarthritis.Rheumatology(Oxford),2004;43(10):1283-1287.)。本發明人前期以類風溼關節炎患者滑膜組織為材料，通過基因克隆及原核系統表達純化獲得人內質網分於伴侶BiP全長蛋白，並進一步研究了重組全蛋白在類風溼關節炎患者血清抗體檢測中的應用，證實抗BiP抗體在RA患者血清中的陽性率為75.4%(陳巧林，何文智，李想，雷靜，曾令文。人內質網分子伴侶BiP的克隆、表達及其在RA患者血清抗體檢測中的研究，現代免疫學，2007,27(2):104-108)。越來越多的研究表明，BiP很可能作為RA的自身抗原，在關節炎發生中起重要的免疫調節作用。但其在RA發病中的作用機制仍不清楚，對其抗原表位在RA發生中的直接作用尚無報導。通過篩選BiP抗原表位多肽及研究其多肽抗體在RA患者血清檢測中的價值，對於直接臨床診斷應用及直接揭示BiP與疾病發生的關係均具有重要意義。基於以上研究，本發明人採用Standard,Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5種國際關於抗原表位預測的方法，分析了654aa長度的BiP蛋白的抗原決定簇，進一步通過合成多肽及免疫檢測，得到了一條其對應抗體在疾病檢測中敏感性和特異性均很高的抗原表位多肽，該多肽可以很好檢測抗BiP蛋白多肽IgG抗體。本發明人將該多肽作為檢測抗原，用上述建立好的單特異性ELISA的方法檢測類風溼關節炎、乾燥症候群(Sjogren'sSyndrome,SS)、系統性紅斑狼疫(systemiclupuserythematosus,SLE)及正常人血清中的抗BiP蛋白多肽IgG抗體。本發明研究共檢測RA患者79例、SS患者67例，SLE患者34例，正常人306例。結果發現該多肽對類風溼關節炎的抗BiP蛋白多肽IgG抗體測定具有較高的敏感性和特異性，可以達到通過血清學的方法診斷RA的目的，為RA的臨床診斷提供客觀的實驗室依據。根據本發明的第四個目的，本發明還提供了所述的BiP蛋白抗原表位多肽在製備用於診斷類風溼關節炎的藥物的應用。根據上述關於BiP蛋白抗原表位多肽測定抗BiP蛋白多肽IgG抗體在類風溼關節炎診斷中的價值評定結果、BiP蛋白多肽測定抗BiP蛋白多肽IgG抗體初步免疫學方法以及臨床診斷試劑盒的要求，本發明人製備了BiP蛋白多肽IgG臨床診斷用試劑盒。具體採用的是間接固相酶聯免疫吸附分析法(ELISA)，用於定量檢測抗BiP蛋白多肽IgG抗體；所述的BiP蛋白抗原表位多肽包被於微孔板上，可拆分的微孔板(1X8)共12板條，可以完成96個反應的檢測。本領域技術人員所熟知，也可根據上述原理製備成其他類型的基於ELISA的診斷用試劑盒。木試劑盒經過反應後，血清抗體與抗原結合併與標記二抗形成免疫複合物，最後產生酶聯顏色反應，顏色的深淺與樣品中抗體的濃度成一定的比例關係。步驟l:樣品，標準品和質控血清加入微孔板的反應孔內，任何存在的抗體結合在微孔內表面，60分鐘孵育後洗滌除去非反應成分。步驟2:加入HRP過氧化物酶標記山羊抗人IgG，結合抗原抗體複合物，30分鐘孵育後洗滌除去未結合的多餘的酶標記物。步驟3:加入TMB底物，30分鐘孵育後試劑顏色變成藍色，加入終止液(含2MH2S04)終止反應；試劑顏色變成黃色。顏色的深淺與樣品中IgG抗體的濃度成一定的比例關係，樣品的IgG抗體含量可根據其OD值由標準曲線推斷出來，在酶標儀或分光光度計中讀取結果。450nm作為初始波長，600至650nm(優選為620nm)作為參考波長。木發明在國內外首次對BiP抗原表位進行篩選和鑑定，獲得了一條最佳抗原表位多肽，並深入研究了抗該多肽抗體在RA診斷中的意義。本發明為發展RA血清學診斷試劑、探索BiP在RA發生中的作用機制奠定了基礎，並為進一步利用BiP抗原表位多肽進行免疫下預治療研究提供了材料。11圖l為654aa長度的全長BiP蛋白二級結構(親水疏水性等)的分析結果圖；分別用Gamier-Robson和Chou-Fasman法推測二維結構(a-螺旋、(3-摺疊、轉角和無規則巻曲等)，Kyte-Doolittle標準分析親水性(Hydrophilicity)，Karplus-Schulz標準推測柔韌性(Flexible),Janeson-Wolf方法預測抗原性指數(Antigenicindex),Plot-Emini方法分析表面可及性(Surfaceprobability)。圖2為654aa長度的全長BiP蛋白抗原表位趨勢預測結果圖；橫坐標表示的是序列的位置，縱坐標表示的是抗原趨勢指數，>1.0120者為可能的抗原表位，而且抗原趨勢指數越大，抗原表位的可能性越強。該方法準確性為75%。圖3為單特異性酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測抗BiP蛋白多肽IgG抗體原理示意圖。圖中，用抗原(BiP蛋白抗原表位多肽)包被微量板孔，製成固相載體。加樣本(類風溼關節炎及疾病對照組和正常人等)血清到板孔中，其所含的抗體(抗BiP蛋白多肽抗體)特異性地與固相載體中存在的抗原結合，形成免疫複合物。除去多餘物質後，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG抗體，使之與上述免疫複合物反應。洗板，除去多餘的結合物，加入底物(TMB)。該反應產生有顏色產物，顏色強度與特異性抗體含量成正比。圖4為本發明所述的BiP蛋白抗原表位多肽建立的單特異性ELISA法的檢測程序示意圖5為BiP蛋白多肽IgG抗體在不同疾病的陽性率；由圖可見，抗BiP蛋白多肽IgG抗體在RA患者中的陽性率明顯高於SLE、SS患者及正常對照(P均O.Ol)。圖6為自身抗體在RA患者血清樣本中檢測的敏感性和特異性。在RA患者中，抗BiP蛋白多肽抗體的敏感性及特異性均高於RF、CCP、RA33、AKA、APF。因此，抗BiP蛋白多肽抗體在RA臨床血清學診斷中具重要價值。具體實施例方式下面將參照附圖結合多種實施例來說明本發明所涉及的發明主題以及應用本發明中的BiP蛋白抗原表位多肽及其相應的抗BiP蛋白多肽IgG抗體來實施RA臨床診斷等具體實施方式。本發明所用術語"BiP蛋白抗原表位多肽"指具有共同序列GVLSGDQDTGDLVL(即NH3-Gly-Val-Leu-Ser-Gly-Asp-Gln-Asp-Thr-Gly-Asp-Leu-Val-Leu-COOH)的多肽或將上述胺基酸序列經過添加一個或幾個胺基酸且具有抗原表位功能的由此衍生的多肽。實施例1BiP蛋白抗原表位多肽的篩選及鑑定前述的研究工作已經證明，利用基因工程的方法純化出的BiP蛋白融合蛋白能夠特異性地結合類風溼關節炎患者血清中的抗BiP蛋白抗體，然後通過特定的方法可以將其檢出(CorrigallVM，Bodman-SmithMD，FifeMSetal.ThehumanendoplasmicreticulummolecularchaperoneBiPisanautoantigenforrheumatoidarthritisandpreventstheinductionofexperimentalarthritis.JImmunol,2001,166(3):1492_1498.陳巧林，何文智，李想等.人內質網分子伴侶BiP的克隆、表達及其在RA患者血清抗體檢測中的研究，現代免疫學，2007，27(2):104-108)。木發明的實驗中，發明人選取全長BiP蛋白基因序列ORF1962nt(223-2184nt)核酸序列對應的胺基酸序列為對象，採用Standard,Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5種國際關於抗原表位預測的標準方法，全面分析了上述654aa長度的BiP蛋白二級結構(親水疏水性等)，具體見圖l。進一步分析上述654aa長度的BiP蛋白抗原表位預測趨勢，結果見圖2，按抗原趨勢指數排列，得到併合成了共計24條多肽。24條計算分析得到的較好的抗原表位序列(均為從NH3端到COOH端排序)如下AARAEEEDKKEDVGTIDLGTTYSCVGVFKNGEIIANDQGNRITPSYVAFTPEGERLIGDRT額DPSVQQDIKFLPFKVVEKKTKPYIQVDMVLTKMKETAEAYLGKKVTHAVFNDAQRQATKDAGTIAGLNVMRAYGLDKREGEKNILVDNGVFEVVAHLGGEDFDQRVMEHIKLYKKKTGKDVRKDNRAVQFYEGEDFSETLTRAKFRSTMKPVQKVVLEDSDLKKSDIDEIVVLVGGSTRIPKIQQLVKEFFNGKEPSRG證GVLSGDQDTGDLVLVGGVMTKLIIFSTASDNQPTVTIKVTAEDKGTGNKNKITITNDQNRLTPEFAEEDKKLKERIDTRGGKLSSEDKETMEKAVDIEDFKAKKKELEEIVQPPPTGEEDTAEKDEL將上述24條合成的BiP蛋白多肽採用單特異性ELISA方法分別與臨床BiP蛋白IgG抗體檢測陽性的RA確診患者血清反應。具體步驟是上述文獻基因工程方法表達獲得的重組BiP蛋白經凝膠電泳、轉硝酸纖維素(NC)膜後，用脫脂牛奶4'C封閉過夜。NC膜切條，分別與以O.P/。脫脂牛奶的Tris鹽緩衝液(TBS)(pH7.5)1:50稀釋的30例類風溼性關節炎血清及正常人對照血清進行反應，室溫孵育2h。含0.05%吐溫的磷酸鹽緩衝液(PBS-T)(pH7.4)洗膜3次。加入1:500稀釋的生物素標記山羊抗人IgG，室溫1h。同前洗膜3次，加入1:500HRP標記鏈黴卵白素，室溫孵育1h。同前洗膜3次，加入顯色底物，約10min顯色清楚後加入終止液。在蛋白相對分子質量為80000區域出現條帶者為陽性，反之為陰性。將24條合成的BiP多肽分別以包被緩衝液(0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液，.pH9.6)稀釋至1ng/ml，包被酶標板(100ial/孔)，4-C過夜。次日以0.1%PBS-Tween洗板2次，以含1%BSA的PBS-T溶液37'C封閉2h，拍千。將以上篩選得到的抗BiP抗體陽性RA患者血清分別以0.2%casien的Tris-Hcl緩衝溶液(pH6.0)稀釋100倍後加入(100pl/孔)，37。C孵育lh。同上洗板4次後加入PBS1:IOOO稀釋後的HRP標記山羊抗人IgG二抗，37。C孵育半小時。洗板5次後加入TMB顯色，37。C孵育半小時，加入2mol/L的H2S04終止反應，酶標儀測定450nm處的吸光度值(OD值)。每板同時設空白對照、陽性對照及陰性對照(均來自BiP蛋白大規模篩選檢測過的樣本)。採用反應OD值的平均值，比較24條合成多肽與RA患者血清IgG的反應強弱，得到的最強反應活性的多肽認定為RA相關抗體最佳檢測抗原BiP蛋白抗原表位多肽。通過分析及免疫檢測，得到了一條反應最強的抗原多肽第17條，其序列為GVLSGDQDTGDLVL(即NH3-Gly-Val-Leu-Ser-Gly-Asp-Gln-Asp-Thr-Gly-Asp墨Leu陽Va1-Leu-COOH)，可以很好檢測抗BiP蛋白多肽IgG抗體，在24條多肽中其與抗BiP抗體陽性RA患者血清IgG抗體反應最強，OD平均值為1.39±0.05，結果見表l。表124條BiP蛋白合成多肽的序列及其對應的單特異性ELISA檢測結果tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage15同時，為了分析上述篩選得到的SEQIDNO.l多肽抗原性的普遍穩定性，通過對SEQIDNO.l多肽經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有抗原表位功能的由此衍生並重新合成一系列多肽，通過以上免疫檢測步驟，發現均可以很好檢測抗BiP蛋白多肽IgG抗體，均顯示與抗BiP抗體陽性RA患者血清IgG抗體很好的反應，OD平均值結果見表2。表210條BiP蛋白SEQIDNO.l多肽衍生物的序列及其對應的單特異性ELISA檢測結果tableseeoriginaldocumentpage16上表中，序號為1-5的序列是在SEQIDNO.l序列的首末端添加不同數量胺基酸(用下劃線標出)的序列；序號為6和7的序列是在SEQIDNO.l序列取代1個或多個胺基酸的序列(用下劃線標出)；序號為8-10的序列是在SEQIDNO.l序列首末端缺失1個或多個胺基酸的序列。木發明的試驗中發明人利用的是Flechsler等報導的固相合成法(FlechslerI,Beck-SickingerAQStephanHetal.Anchor-linkedintermediatesinpeptideamidesynthesisarecausedbydimericanchorsonthesolidsupports.JPeptSci,1995;l(3):191-200.)合成了該條共14個胺基酸的BiP蛋白抗原表位多肽(SEQIDNO.l)及其對應的衍生物。迄今為止，國內外尚無關於該多肽序列的抗原性、該多肽檢測血清中對應抗體的方法及其作為抗原在類風溼關節炎診斷中意義的研究。實施例2BiP蛋白抗原表位多肽對患者血清中抗BiP蛋白多肽IgG抗體的檢測及其價值評定本發明實驗中針對合成多肽的胺基酸特性及其與抗體反應的情況，經過一系列pH值及反應離子濃度的調整後，我們確定了以pH9.6的0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液為包被緩衝液，具體配置方法是900ml去離於水中加入1.59gNa2C03和2.93gNaHC03，然後調pH至9.6，最後用去離子水定容至1000ml;同時也針對包被抗原濃度進行了相應的實驗，將該BiP蛋白抗原表位多肽SEQIDNO.l進行梯度稀釋後進行反應，結果顯示，用以上pH9.6的自配包被緩衝液將肽稀釋為1ng/ml，每孔加入100^4'C包被過夜後，進行血清抗體檢測，效果最好；關於一抗(血清)稀釋液，通過經驗，確定了以0.2%casein的Tris-Hcl緩衝溶液(pH6.0)稀釋100倍後加入(100H1/L)抗原孔，反應最優；另外，關於對非特異性反應的阻止問題，本發明發明人通過所在研究小組以往的經驗，分別採用1%OVA/PBS、1%BSA/PBS、1%BSA的PBS-T、1%脫脂奶粉/PBS及封閉用正常用兔血清等，最終通過臨床血清樣本檢測反應背景比對，最終確定運用以含1%BSA的0.05%吐溫的磷酸鹽緩衝液(1%BSAPBS-T)溶液作為封閉液，37'C封閉2h，這樣可以使得抗BiP蛋白多肽抗體檢測的特異性能達到最佳。封閉液具體配置方法為900mlPBS中加入10g牛血清白蛋白(BSA)、及0.5g疊氮鈉，然後用HCl調pH至7.2，加入0.5ml吐溫(Tween-20)，最後用PBS定容至1000ml。木研究利用上述的SEQIDNO.l多肽採用上述經過優化而建立好的酶聯免疫吸附法(單特異性ELISA法)對RA、SLE、SS患者及正常人血清中的抗BiP蛋白多肽IgG抗體進行檢測，以評價該多肽抗體在各種疾病中的分布。具體步驟是首先選擇上述篩選到的BiP蛋白多肽(SEQIDNO.l)，以包被緩衝液(0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液，pH9.6)稀釋至1ng/ml，包被酶標板(100一孔)，4°C過夜。次日以0.1%PBS-Tween洗扳2次，以含1%BSA的PBS-T溶液37。C封閉2h，拍幹。患者血清標本(包括RA患者、SS患者、SLE患者及正常人)分別以0.2%casein的Tris-Hcl緩衝溶液(pH6.0)稀釋IOO倍後加入(100nl/孔)，37。C孵育1h。同上洗板4次後加入PBS1:1000稀釋後的HRP標記山羊抗人IgG二抗，37'C孵育半小時。洗板5次後加入TMB顯色，37。C孵育半小時，加入2mol/L的112804終止反應，酶標儀測定450nm處的吸光度值(OD值)。分別對79例RA患者、34例SLE患者、66例SS患者及306份正常人血清IgG進行檢測，每板同時設空白對照、陽性對照及陰性對照(均來自BiP蛋白大規模篩選檢測過樣本)。採用待測標本OD值〉正常標本均數+2X標準差為陽性域值，判斷各組血清檢測結果。以商品化的試劑盒方法檢測以上各血清的RF、CCP、RA33、AKA、APF等抗體。評價抗BiP表位多肽抗體對疾病檢測的敏感性和特異性與現有抗體的比較，分析其RA患者血清中的診斷價值。採用SPSS10.0統計軟體對檢測結果進行分析，P<0.05視為差異有顯著性。檢測原理示意圖見圖3。本發明研究中共檢測類風溼關節炎患者79例、乾燥症候群患者67例，系統性紅斑狼瘡患者34例，正常人306例。1.檢測程序概要如圖4所示，多肽進行包被，100ng/孔，4'C過夜，洗滌，加入含1%BSA的PBS-T溶液150微升，溼盒中37。C2h，洗滌。樣品稀釋液1:100稀釋臨床病人血清，將稀釋的樣本，和立即可用的對照血清，分別加到微量孔內(IOO微升)，在溼盒中孵育60分鐘/37°C。再洗滌，加入己稀釋的酶標記IgG溶液IOO微升，在溼盒中再孵育30分鐘/37°C，洗滌，加入底物溶液100微升，在溼盒中再孵育30分鐘/37°C，加入終止液(100微升)，在450納米處讀數。2.檢測過程2.1將檢測所需數目的微孔條放到微孔板(已包被好多肽SEQIDNO.l並已經封閉完成)框上並準備好一張草籤。2.2在微量孔內分別加入IOO微升的已稀釋樣本或立即可用的對照血清。留一個孔為底物空白使用，例如IgG檢測微量孔孔Al底物空白孔B1陰性對照孔C1標本12.3將樣品於溼盒內37。C(土rC)孵育60分鐘(土5分鐘)。2.4孵育後以洗液緩衝液洗滌板孔(使用自動洗板機或手工洗板)-吸去或甩去洗液-每孔內加入300微升洗液-吸去或甩去洗液-重複洗滌過程4次(共5次！)-將微孔板翻轉過來在紙巾上拍打，使微孔中不再含有液體2.5加入酶標記抗體。於適當孔內(底物空白除外)加入100微升IgG酶標記抗體混合物2.6溼盒內37。C(±rC)孵育30分鐘(土l分鐘)。2.7孵育後，以洗液清洗板孔(洗滌見上)2.8加入底物於每孔內加入100微升底物溶液(包括底物空白孔)2.9溼盒內37。C(±rC)孵育30分鐘(士l分鐘)。2.10終止反應每孔內加入IOO微升終止液，輕微振蕩微孔板以混合溶液。2.11讀取消光度以底物空白為空白對照液，60分鐘內讀取450納米的OD值，參考波長範圍為620納米-690納米(例如650納米)。本實施例主要通過以下幾個方面闡明本發明BiP蛋白抗原表位多肽(SEQIDNO.l)在乾燥症候群患者診斷中的意義1、抗BiP蛋白多肽IgG抗體在類風溼關節炎、千燥症候群、系統性紅斑狼瘡及正常人血清檢測率之間的比較。木發明的研究實驗中，發明人用單特異性ELISA方法檢測了BiP蛋白多肽IgG抗體在類風溼關節炎、千燥症候群、系統性紅斑狼瘡及正常人血清檢測中的陽性率(表3,圖5)。應用統計學比較各組數據，結果顯示，BiP蛋白多肽IgG抗體在類風溼關節炎患者血清檢測中的陽性率顯著高於乾燥症候群、系統性紅斑狼瘡和正常人，p值均O.Ol。tableseeoriginaldocumentpage202、抗BiP蛋白多肽IgG抗體在類風溼關節炎、乾燥症候群、系統性紅斑狼瘡及正常人血清中滴度的比較。由表4可見BiP蛋白多肽IgG抗體在類風溼關節炎患者中的平均滴度明顯高於SS、SLE患者及正常人。tableseeoriginaldocumentpage203、抗BiP蛋白多肽IgG抗體與其它自身抗體在類風溼關節炎的敏感性和特異性的比較。表5，圖6顯示了抗BiP蛋白多肽IgG抗體、RF、AKA、APF和抗CCP、RA33等抗體在類風溼關節炎中的敏感性和特異性。其中採用散射比濁法檢測類風溼因子(RF)，間接免疫螢光法檢測抗角蛋白抗體(AKA)，ELISA法檢測抗環瓜氨酸肽抗體(抗CCP抗體)、抗RA33抗體和抗核周因子抗體(APF)，相應檢測試劑盒及方法由德國歐蒙醫學實驗診斷有限公司等提供。本發明實驗結果顯示抗BiP蛋白多肽IgG抗體特異性和敏感性均明顯高於RF、AKA、APF和抗CCP、RA33等抗體。因此，結合敏感性和特異性，抗BiP蛋白多肽IgG抗體在診斷中的意義可能優於其他自身抗體。表5.自身抗體在乾燥症候群的敏感性和特異性抗體類別陽性例數敏感性(％)特異性(％)抗BiP蛋白多肽抗體5367.195.1RF抗體4050.674.9CCP抗體4759.591.9RA33抗體1822.879.8AKA2329.188.9APF3240.569.8實施例3BiP蛋白抗原表位多肽作為抗原在製備臨床類風溼關節炎診斷試劑盒中的應用本發明人採用間接固相酶聯免疫吸附分析法(ELISA)，將所述的BiP蛋白抗原表位多肽(SEQIDNO.l)包被於微孔板上，製備了BiP蛋白多肽IgG臨床診斷用試劑盒，用於定量檢測抗BiP蛋白多肽IgG抗體，共可以完成96個反應的檢測。具體內容如下1.試劑盒組成材料包被了高度純化BiP蛋白多肽可拆分的微孔板(1X8)12板條1塊；BiP蛋白多肽IgG標準品0/6.3/12.5/25/50/100U/ml各1瓶，每瓶1.5ml;質控血清(含IgG和陰性質控)各1瓶，1.5ml;濃縮的樣品稀釋緩衝液l瓶，20ml;HRP過氧化物酶標記山羊抗人IgG1瓶，15ml;TMB底物1瓶，15ml;終止液(含2MH2S04)1瓶，15ml;濃縮洗滌緩衝液1瓶，20ml2.技術參數(1)樣本血清或血漿(2)樣本量每次實驗100ul未稀釋樣本(3)總孵育室溫下(18-28°C)60分鐘(4)質控範圍0-100U/ml(5)靈敏度lU/ml(6)儲存2-8°C(7)有效期生產後9個月或標明有效期(8)包裝規格96人份3.試劑盒性能(1)特異性高度純化的BiP蛋白多肽抗原被包被於微孔板上，製備的BiP蛋白多肽試劑盒僅用於特異性檢測的抗體。(2)校正BiP蛋白多肽IgG抗體定量檢測系統無國際標準校正。4.免疫分析程序(1)自備材料儀器酶標儀(450nm波長)，漩渦振蕩器，加樣器(10ul，100ul，1000ul)試劑準備蒸餾水，量筒(100ml，1000ml)，裝洗滌液的塑料容器可選擇多通道加樣器，可重複的加樣器(100ul)，數據分析軟體(2)樣品收集，處理和保存使用血清或血漿樣木檢測BiP蛋白多肽IgG抗體，血清或血漿用樣品稀釋緩衝液以l:IOO的比例稀釋(10ul樣本+lml緩衝液)，病人無須禁食，也不用特別的準備，靜脈穿刺，取血採樣，形成凝結後離心去除顆粒。樣品如果不直接使用，2-8'C下可保存5天或-2(TC下可保存6個月，將其分為小部分避免反覆冷凍。膽紅素和溶血素對結果無影響。(3)試劑的準備/儲存除樣品緩衝液和洗滌緩衝液外，全部試劑均為即用型液體；開蓋後試劑2-8'C下可至少保存30天或標籤上的有效期。實驗中不用的板條立即放回帶乾燥劑的包裝中，2-8'C下密封保存，以免變質。洗滌緩衝液的準備蒸餾水50倍稀釋後裝到1000ml容器。稀釋後的緩衝液可在2-8。C下至少保存30天或標籤上的有效期。稀釋緩衝液的準備蒸餾水5倍稀釋後裝到100ml容器。稀釋後的緩衝液可在2-8'C下至少保存30天或標籤上的有效期。(4)技術要點質控血清或樣木必須每次作為未知分析，以檢測實驗的可靠性。加樣和樣本處理使用帶一次性吸頭的微量加樣器取樣；直接加入微孔底部。為避免交叉汙染，每次更換吸頭取樣。對懷疑高濃度的病人樣本應進一步稀釋，並在結果計算時調整。(5)試驗過程不同批號不要混用全部試劑和樣本使用前恢復到室溫。所有病人樣本用樣品稀釋緩衝液以1:IOO的比例稀釋(10ul樣本+lml緩衝液)，混合均勻。標準品和質控血清為即用型，不必稀釋。根據樣品數量加上標準品和質控決定所需的板條，每個樣品，標準品和質控都應做雙份。建議使用的試驗方案tableseeoriginaldocumentpage23每孔加入100ul血清稀釋液、標準品和質控血清，37。C孵育l小時(18-28°C);倒空微孔板，每孔用300ul洗滌緩衝液衝洗3次；每孔加入100ul酶標液，37'C孵育30分鐘；倒空微孔板，每孔用300ul洗滌緩衝液衝洗3次；每孔加入100ul底物TMB，37'C黑暗中孵育30分鐘；每孔加入100ul的終止液，靜止5分鐘；停止反應後30分鐘內，測定結果，450nm作為初始波長，620nm(可以用600至690nm)作為參考波長。(6)結果分析以吸光度和標準品濃度作標準曲線(直線、半對數或對數坐標紙)。由標準曲線可直接確定血清的抗體濃度。(7)實驗參數精度批內樣品平均值(U/ml)CV%115.94.02593.531371.2批間樣品平均值(U/ml)CV%115.73.9258.12.331441.4靈敏度1U/ml對應在稀釋實驗中，高抗體濃度的樣本用樣本緩衝液稀釋並檢測。結果在全部測試範圍內成線性關係。24SEQUENCELISTING(序列表)〈110〉中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院BiP蛋白抗原表位多肽及其篩選方法與應用〈130〉2008-12-25〈160〉1〈170〉Patentlnversion3.41〈211〉14<212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1GlyValLeuSerGlyAspGinAspThrGlyAspLeuValLeu1510權利要求1、一種BiP蛋白抗原表位多肽，其特徵在於，是如下(a)或(b)的多肽(a)、由SEQIDNO.1所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)、在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。2、如權利要求l所述的BiP蛋白抗原表位多肽的篩選方法，其特徵在於，包括以下步驟-A)選取人全長BiP蛋白基因序列開放閱讀框1962nt核酸序列對應的胺基酸序列為對象，採用Standard、Karplus、Emini、Amphiphi、Pellequer五種關於抗原表位預測的標準方法，分析上述654aa長度的BiP蛋白二級結構，確定其抗原決定簇；B)按抗原趨勢指數排列，計算分析得出較好的抗原表位序列，合成候選的若千條多肽，通過免疫檢測，篩選得到與類風溼關節炎患者血清IgG抗體反應最強的抗原多肽，即(a)多肽；C)通過在上述(a)多肽上經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸重新合成一系列多肽，經免疫檢測得到類似於步驟B中獲得的抗原多肽與類風溼關節炎患者血清IgG抗體反應的多肽及其衍生物，從而得到具有抗原表位活性的(b)多肽，即(a)多肽的衍生物。3、一種用於檢測類風溼關節炎患者血清抗BiP蛋白多肽IgG抗體的免疫學方法，其特徵在於將如權利要求l所述的BiP蛋白表位多肽作為抗原，採用單特異性ELISA法檢測類風溼關節炎患者血清抗BiP蛋白多肽IgG抗體。4、根據權利要求3所述的免疫學方法，其特徵在於所述的ELISA法中，包被緩衝液為pH9.6的0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液。5、根據權利要求3所述的免疫學方法，其特徵在於所述的ELISA法中，抗原多肽即所述BiP蛋白表位多肽的包被量為100ng。6、根據權利要求3所述的免疫學方法，其特徵在於所述的ELISA法中，一抗稀釋液和稀釋倍數為含0.2%酪蛋白的Tris-HCl緩衝溶液，pH6.0，稀釋100倍。7、根據權利要求3所述的免疫學方法，其特徵在於所述的ELISA法中，封閉液和封閉條件為含1%BSA的0.05%吐溫的磷酸鹽緩衝液，37'C封閉2小時。8、如權利要求1所述的BiP蛋白抗原表位多肽在製備診斷類風溼關節炎的藥物中的應用。9、含有如權利要求1所述的BiP蛋白抗原表位多肽的診斷類風溼關節炎的試劑盒。全文摘要本發明涉及抗原表位多肽的篩選、免疫學方法的建立以及臨床診斷試劑的應用，尤其是涉及BiP蛋白抗原表位多肽的篩選，得到具有診斷意義的最佳BiP蛋白抗原表位多肽對應的胺基酸序列，以及建立檢測患者血清中最佳BiP蛋白抗原表位多肽IgG抗體的免疫學方法，以及將其作為抗原在製備診斷類風溼關節炎的藥物中的應用。文檔編號C07K7/08GK101445551SQ200810220408公開日2009年6月3日申請日期2008年12月25日優先權日2008年12月25日發明者曾令文,陳巧林申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院