具有寬的手性選擇性的新手性柱的製作方法

2023-07-11 03:58:26 1

專利名稱：具有寬的手性選擇性的新手性柱的製作方法
技術領域：
本發明涉及手性化學領域。更具體地，本發明涉及對映異構體的分離，所述對映異構體即其中原子或基團的排列使得2個分子不可重疊的異構體。
本發明人研究出了新的一類手性柱，其可以拆分大量的外消旋化合物。這些柱是穩定的，可以和很多的流動相溶劑一起使用。
背景技術：
立體異構體是僅僅原子的空間定向彼此不同的分子。立體異構體一般分為非對映體或對映體；後者包括彼此互為鏡像的分子，而前者則不是。表徵特定立體異構體的原子的特定排列稱作其光學構象，特定地由已知的次序規則來表示，例如+或-(也作D或L)和/或R或S。
儘管只是定向不同，但立體異構現象的實際作用是很重要的，例如許多化合物的生理和藥理活性受到了其所包括的特定構象的強烈影響。的確，許多化合物只有當以給定的立體異構體形式使用時才有廣泛應用。
活體通常只產生一對對映體中的一種。因此在澱粉的酵母發酵中僅產生(-)-2-甲基-1-丁醇；在肌肉收縮中僅產生(+)-乳酸；果汁僅包含(-)-蘋果酸，由金雞納樹僅能獲得(-)-奎寧。在生物系統中，立體化學專一性是一種規律而不是異常現象，因為在這些系統中很重要的催化酶是有旋光活性的。例如糖(+)-葡萄糖在動物代謝中發揮重要作用，而且在發酵工業中是基本原料；但是，其光學對應體、或對映體(-)-葡萄糖既無法被動物代謝，也不能用酵母來發酵。這方面的其他例子包括黴菌-灰綠青黴菌，其僅消耗酒石酸的對映異構體混合物的(+)-對映體，而剩下完整的(-)-對映體。同時，氯黴素僅有一種對映體是抗生素；(+)-麻黃鹼不僅不具有任何藥物活性，而且它會干擾其對映體的藥物活性。最後，在香精的領域裡，對映體(-)-香芹酮提供了具有特徵性氣味的留蘭香油，而其光學對應體(+)-香芹酮提供的則是黃蒿子類的香精。
因此，儘管酶和其他生物學受體分子具有手性結構，但可以通過不同的方法來吸收、活化和降解外消旋化合物的對映體。這種現象導致了在許多情況下，外消旋藥物的兩種異構體具有不同或者甚至相反的藥理活性。為了認識這些不同效果，通常需要分別研究每種對映體的生理活性。在藥學工業中的這種以及其他因素顯著地促成了對對映體純化合物的需求，因此需要進行手性色譜法。
因此，需要並且通常必須分離立體異構體，以獲得具有旋光活性的化合物的有用類型。
關於這一點，當非對映體包括具有不同物理性質例如熔點、沸點、在給定溶劑中的溶解度、密度、折光率等等的非對映體時，分離一般不是問題。這樣，通過常規方法例如分餾、分步結晶或色譜法一般就可以把非對映體彼此分開。
另一方面，對映體則存在特別的問題，因為它們的物理性質是相同的。因此它們不能根據規則-特別是外消旋物的形式時-通過普通方法來分離；不能通過分餾分離，因為它們的沸點相同；不能通過常規的結晶分離，因為(除非溶劑是旋光活性的)它們的溶解度相同；不能通過常規的色譜分離，因為(除非吸附劑是旋光活性的)它們都相同地保留在吸附劑上。下列事實進一步加重了分離對映體的問題常規的合成技術幾乎總是產生對映體的混合物。當混合物包含等量具有相反光學構象的對映體時，我們稱之為外消旋化合物。把外消旋化合物分離成各自的對映體一般稱之為拆分；其是相當重要的一種方法。
對可以拆分大量外消旋化合物的手性柱(通用手性柱)有較高的需求。在許多實驗室，特別是製藥工業中一般都需要它們。在本發明之前，Daicel柱、大環抗生素柱和Whelk-O柱是這種類型的通用手性柱的工業領先者。本發明人發展出了一類新的基於使用脯氨酸及其類似物的通用手性柱。
此外；而且重要的是，本發明的柱具有拆分至少相似或更高百分比的受試化合物的能力。此外，本發明的柱為一些受試化合物提供了更好的分離，其可以拆分某些不能用上述列舉的常規使用的商業性柱拆分的化合物。
本發明的柱是穩定的，而且可以與大量的流動相溶劑一起使用。因此，本發明的柱作為通用手性柱應當會發現重要的應用。
過去，人們製造了大量的手性柱；但是僅有一些顯示了較寬的手性選擇性。如上所述，成功的例子包括通用的Daicel柱、Chirobiotic柱和Whelk-O1/2柱。製備Daicel柱，包括用糖類衍生物塗敷於矽膠上。製備Chirobiotic柱，包括將大環糖肽固定於矽膠上。Whelk-O1/2柱包含富電子和缺電子的芳香化合物。這些柱具有較寬的手性選擇性，已經成功地應用於拆分相當數量的外消旋化合物。它們具有不同的選擇性和穩定度曲線。在一些情況下它們的選擇性互相補充，而在另一些情況中它們互相重複。一些柱更適合於反相的情況，另一些則適合正相的情況。每個柱都有它自己的長處和缺點。儘管有這樣的進展，仍然有很多不能用商業銷售的柱分離或很好地分離的化合物。因此，仍然存在對發展具有相對較寬的手性選擇性的新柱的顯著需求。
發明簡述本發明涉及一種手性選擇器，其在對映體分離領域是改進的。因此，本發明的一個實施方案是具有基於多個脯氨酸的手性選擇器的通用手性柱。
本發明的另一個實施方案是由具有2或更多脯氨酸的肽製成的手性固定相，包括具有2，3，4，5，6，或10個脯氨酸的手性選擇器。在本發明的範圍內也包括脯氨酸的類似物和異構體，以及本發明的手性選擇器化合物的類似物和異構體。
本發明的另一個實施方案是下列通式的手性固定相(或柱)， 其中n是2或更大的任意整數，及其類似物和異構體。本發明的另一個實施方案是，其中n是2-10的任意整數。
所得到的對分析物的分離與在Daicel AD、Chirobiotic AD和Whelk-O2柱上所完成的是等同的，或者更好。本發明的基於多個脯氨酸的手性柱顯示了作為更好的通用手性柱的前途。
附圖簡述附

圖1顯示的是胺基酸L-脯氨酸和其相關的固定相Fmoc-Pro-(Me)Ahx-APS(CSPI)，Fmoc-Pro2-(Me)Ahx-APS(CSP2)，Fmoc-Pro4-(Me)Ahx-APS(CSP3)；和Fmoc-Pro6-(Me)Ahx-APS(CSP4)的結構。CSP2-4是本發明化合物的實施方案。
附圖2顯示的是本發明一個實施方案的合成，Fmoc-Pro4-(Me)Ahx-APS手性固定相(CSP3)Fmoc-Pro4-(Me)Ahx-APS手性固定相(CSP3)的合成(a)Fmoc-(Me)Ahx-OH，DIC；(b)(1)哌啶；(2)Fmoc-Pro-OH，HATU；(c)AcOH；(d)氨基丙基-矽膠，HATU。
發明詳述本發明人發展出了與作為工業標準或工業模型的Daicel柱和Whelk-O2柱相比具有相對較寬的手性選擇性的新手性柱。此外，本發明的手性柱在很多流動相的情況中是穩定的。
本發明的手性柱的成功率與過去數十年發展的最好的商業銷售的通用手性柱是相當的。對於根據其可用性而選擇的22種外消旋化合物，我們的Pro4柱(CSP 3)拆分了17種化合物；我們的Pro2柱(CSP 2)拆分了16種化合物；我們的Pro6柱(CSP 4)拆分了15種化合物。相比之下，Daicel OD柱拆分了18種，Daicel AD拆分了16種，Whelk-O2柱拆分了15種化合物。單脯氨酸柱(CSPI)的有效性要低得多，因為它們僅能拆分22種受試化合物中的6種。用單脯氨酸柱完成的拆分也是非常適當的。
在許多方面，脯氨酸是一種獨特的胺基酸(附圖1)。與在其他α-胺基酸中含有的主要是氨基不同，它包含的是仲胺。由於其環結構，限制了圍繞氮-α-碳鍵的旋轉。同樣由於其環結構，理論上脯氨酸不適合於α-螺旋或β-片狀構象；相反，脯氨酸形成了其自身獨特的螺旋狀構象(聚脯氨酸I和聚脯氨酸II)。與其他的寡肽相比，聚脯氨酸中的醯胺鍵是立體阻礙的。聚脯氨酸明顯不同的構象和結構特徵暗示，它們與在手性色譜中已經研究的其他短的寡肽相比表現可能非常不同。
本發明人發現了，基於脯氨酸的手性選擇器，包括基於四脯氨酸的手性固定相3(附圖1)、基於二脯氨酸的手性固定相2，基於六脯氨酸的手性固定相4的實施方案，具有相對較寬的手性選擇性，而單-脯氨酸固定相1在很大程度上是無效的。
將本發明的手性選擇器1固定在矽膠上是通過連接基來實現的。本發明的連接基的一個例子是N-烷氨基。第二個例子是N-甲氨基。另一個例子是6-N-甲氨基己酸。由於N-甲基或N-烷基，這些連接基和脯氨酸殘基之間的醯胺鍵具有更大的立體位阻。本領域的普通技術人員可以根據所要測試的分析物來選擇具體的連接基。例如，當用6-甲氨基己酸固定選擇器Fmoc-Pro-Pro時，它可以從約22種受試的分析物中拆分出約16種。對於相同的手性選擇器，當用6-氨基己酸固定時，它僅能從相同組的分析物中拆分出4種來。
此外，本發明的固定相化合物可以包含各種本領域已知的各種封端基團。
在本發明中使用的術語脯氨酸，應當理解為也包括脯氨酸的類似物和異構體。例如包括所有的立體異構體。
此外，包括類似物。其中所包括的類似物的例子是在例如D-脯氨酸、羥脯氨酸和2-哌啶酸中具有如下骨架結構特徵的那些 其中n是整數(例如1，2，3，4，5等等)，X是雜原子例如O，S，N；並且其他非指定的原子可以是碳或雜原子。
本發明的這些共價結合柱在通常的有機溶劑包括CH2Cl2和CHCl3中是穩定的。因此在方法的研究中可以較寬範圍地選擇流動相條件。對於一些分析物，本發明試圖用CH2Cl2/己烷作為流動相來拆分，也可以實現有效的分離(實施例6)。當一些外消旋分析物僅能溶解在一些溶劑中並且一些化合物可以更好地溶解一些溶劑中時，較寬的溶劑選擇就具有了益處。
從分析物可能的相互作用方式來看，本發明的手性選擇器的例子是與分析物形成了有吸引力的氫鍵，它們也可以與分析物具有有吸引力的極性相互作用。此外，在分析物和手性選擇器之間的空間相互作用也是重要的。
下列的實施例和試驗部分實際上純粹是為了舉例示範。因此，該部分不應當被認為是對本發明的限制。
實施例在本部分的上下文中，使用了各種縮寫，包括如下DIC，二異丙基碳二亞胺；HATU，六氟磷酸O-(7-氮雜苯並三唑基-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲；DIPEA，N，N-二異丙基乙胺；DMF，N，N-二甲基醯胺；DCM，二氯甲烷；DMAP，4-(二甲基氨基吡啶)；NMM，N-甲基嗎啉；Fmoc，9-芴甲氧羰基；(Me)Ahx，6-甲基氨基己酸；Fmoc-(Me)Ahx-OH，6-[(9H-芴基-9-基甲氧基)羰基]甲基氨基己酸；Fmoc-Ahx-OH，6-[(9H-芴基-9-基甲氧基)羰基]氨基己酸；Fmoc-Pro-OH，N-α-Fmoc-L-脯氨酸。
一般的輔助材料和設備胺基酸衍生物是購自NovaBiochem(San Diego，CA)。其它所有化學品和溶劑購自Aldrich(Milwaukee，WI)，Fluka(Ronkonkoma，NY)或Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)。HPLC級Kromasil矽膠(粒徑5μm，孔徑100，表面積298m2/g)購自Akzo Nobel(EKA Chemicals，Bohus，Sweden)。來自Fisher Scientific的Selecto矽膠(32-63μm)用於目標化合物的快速柱色譜純化。用EM矽膠60F-254TLC平板(0.25mm；E.Merck，Merck KGaA，64271Darmstadt，德國)來完成薄層色譜法。通過Atlantic Microlab，Inc.(Norcross，GA)進行元素分析。用Beckman分析梯度系統(System Gold)完成HPLC分析。用ShimadzuUV 201色譜儀(單元格容積3mL；單元格通過長度10mm)獲得UV光譜。
實施例1手性固定相Fmoc-Pro-(Me)Ahx-APS(CSPI)的製備向0.80g的(Me)Ahx-APS矽石(表面(Me)Ahx濃度是0.64mmol/g)中加入在8mL DMF中的Fmoc-Pro-OH(3份當量，0.52g)，HATU(3份當量，0.58g)和DIPEA(3份當量，0.20g)的混合物。攪拌6小時後，過濾收集所得到的矽石，並用DMF、甲醇和DCM洗滌，以得到所需的手性固定相。根據Fmoc分裂法確定表面Pro濃度是0.57mmol/g。用標準勻漿填充法將所得到的手性固定相裝入50×4.6mmHPLC柱中。
實施例2手性固定相Fmoc-Pr02-(Me)Ahx-APS(CSP2)的製備向0.80g的(Me)Ahx-APS矽石(表面(Me)Ahx濃度是0.64mmol/g)中加入在8mL DMF中的Fmoc-Pro-OH(3份當量，0.52g)，HATU(3份當量，0.58g)和DIPEA(3份當量，0.20g)的混合物。攪拌6小時後，過濾收集所得到的矽石，並用DMF、甲醇和DCM洗滌。根據Fmoc分裂法確定表面Pro濃度是0.55mmol/g。然後用在包含10mL 20％(V/V)哌啶的DMF中的矽石處理1小時來除去Fmoc保護基。過濾收集脫保護的矽石Pro-(Me)Ahx-APS，並用DMF、甲醇和DCM洗滌。然後在相同順序的反應後將另一個模塊Fmoc-Pro-OH結合到所得的矽石上，在矽膠上得到所需的手性選擇器。根據Fmoc分裂法確定表面Fmoc濃度是0.52mmol/g。用標準勻漿填充法將所得到的手性固定相裝入50×4.6mm HPLC柱中。
實施例3手性固定相Fmoc-Pro4-(Me)Ahx-APS(CSP3)的製備向用DCM(20mL，30分鐘)預溶脹的Rink酸性樹脂(100-200目，3.0g，0.43mmol/g)中加入在DCM-DMF(1∶1V/V，10mL)中的Fmoc-(Me)Ahx-OH(1.42g，3.87mmol)，DMAP(0.16g，1.29mmol)，NMM(0.39g，3.87mmol)，和DIC(0.49g，3.87mmol)的混合物。攪拌6小時後，過濾收集樹脂，並用DMF、DCM和甲醇(20mL×3)洗滌。用在DMF中的20mL 20％(V/V)哌啶處理30分鐘來除去Fmoc保護基。收集脫保護的(Me)Ahx-O-Rink樹脂，並用DMF、DCM和甲醇(20mL×3)洗滌。
向(Me)Ahx-O-Rink樹脂中加入在20mL無水DMF中的Fmoc-Pro-OH(1.31g，3.87mmol)，HATU(1.47g，3.87mmol)，和DIPEA(0.50g，3.87mmol)的混合物。攪拌3小時後，過濾該樹脂，並用DMF、DCM和甲醇(20mL×3)洗滌。
然後除去Fmoc基，通過與上述完全相同的方法結合第二、第三和第四模塊Fmoc-Pro-OH，得到所需的Fmoc-(Pro)4-(Me)Ahx-O-Rink樹脂。
然後用在DCM(20mL，10分鐘)中的1％TFA處理該樹脂，以從樹脂中釋放Fmoc-(Pro)4-(Me)Ahx-OH。將該斷裂反應再重複幾次以確保完全反應。通過在矽膠上(流動相在DCM中的5％甲醇)的快速色譜法純化所得到的粗品，得到所需的Fmoc-(Pro)4-(Me)Ahx-OH白色固體(0.90g，92％)。1H NMR(CD2Cl2)δ1.2-1.7(m，6H)，1.9-2.4(m，18H)，2.80(s，3H)，3.2-3.6(m，10H)，4.2-4.7(m，7H)，7.1-7.6(m，8H)，9.6(br，1H)。ESI-MSm/z 756.0(M+H+)。
取在8mL的無水DMF中的Fmoc-(Pro)4-(Me)Ahx-OH(0.90g，1.19mmol)，HATU(0.45g，1.19mmol)，和DIPEA(0.15g，1.19mmol)的混合物加入到0.7g的3-氨基丙基矽膠(APS)中。APS是由Kromasil矽膠(5μm球形矽石，100，298m2/g)和3-氨基丙基三乙氧基矽烷製成的。根據氮的元素分析數據(C，3.11；H，0.83；N，0.93)，表面氨基濃度是0.66mmol/g。混合物攪拌4小時後，過濾收集固定相，並用DMF、DCM和甲醇(10mL×3)洗滌。根據Fmoc分裂法確定表面Fmoc濃度是0.27mmol/g。用標準勻漿填充法將所得到的手性固定相裝入50×4.6mm HPLC柱中。
下列的實施例顯示的是不同的色譜測定。其中保留因子(k)等於(tr-t0)/t0，其中tr是保留時間，t0是空載時間。分離因子(α)等於兩個對映體的保留因子k2/k1的比。分離因子為1則說明沒有分離。分離因子越大，分離得越好。用1，3，5-三-叔丁基苯作為空體積標記來測定空載時間。流速1ml/分鐘，在254nm UV檢測。
實施例4本實施例比較了用手性柱進行的外消旋化合物的色譜分離，包括本發明的實施方案(Pr02(CSP2)、Pro4CSP3)、Pro6(CSP4))。在下列表格中，k1是保留最少的對映體的保留因子，分離因子(α)如前定義。本實施例也顯示了，單-脯氨酸手性柱完成得不充分。
此外，本實施例顯示了本發明的實施方案與已知的商業化柱的比較。
表1用手性柱進行外消旋化合物的色譜拆分。k1是保留最少的對映體的保留因子。流動相是特定比例的IPA和乙酸的己烷溶液。


實施例5用於示範目的本發明的固定相化合物和矽石載體的具體實施方案本實施例列舉了本發明的聚-脯氨酸化合物，包括具有不同封端基團的實施方案。封端基團與離載體更遠的氮原子結合。在本實施例中需要注意的是，對於一些分析物來說一些封端基團例如特戊醯(PIV)(CSP-6)要比其它的例如TAPA更有效。總的來說，一些可以在本發明中使用的不同的封端基團例如Piv、Fmoc、Boc、Cbz、Aca、Dmb、Tpa都能很好地運行。不具有封端基團的CSP-5對於一些分析物是無法運行的。


表2封端基團的影響
實施例6本實施例比較了在兩種流動相系統中用本發明的一個實施方案—Fmoc-Pro-Pro-Pro-Pro-N(Me)Ahx-APS(CSP-3)進行外消旋化合物的色譜分離的比較。相應地，本實施例有助於證明在不同流動相系統中本發明的手性固定相的適應性。
表3.在兩種流動相系統中用Fmoc-Pro-Pro-Pro-Pro-N(Me)Ahx-APS(CSP-3)進行外消旋化合物的色譜分離
上面對本發明進行了描述，對於本領域技術人員顯而易見地，對本發明可以做出各種的變更或變化而不脫離本發明的範圍或精神。從對所公開的本發明的說明書和實施出發，本發明的其它實施方案對於本領域的技術人員也是顯而易見的。因此，所附屬的內容應當認為僅僅是舉例說明，而不是限制本發明的範圍和精神。
除非另有說明，表示各成分的量、性質例如分子量，反應條件、實驗結果和在說明書和附屬內容中所列出的所有數字都應當理解為是由術語「約」修飾的。因此，除非有相反的特定說明，數字都是近似值，其取決於本發明設法要獲得的所需的性質。
參考文獻下列參考文獻都以其整體引入本文作為參考。
(1)Stinson，S.C.Chemical Engineering News 1995，73，44-74.
(2)Okamoto，Y.；Kawashima，M.；Hatada，K.Journalof theAmerican Chemical Society 1984，106，5357-5359.
(3)Yashima，E.；Yamamoto，C.；Okamoto，Y.Journal oftheAmerican Chemical Society1996，118，4036-4048.
(4)Berthod，A.；Chen，X.；Kullman，J.P.；Armstrong，D.W.；Gasparrini，F.；D′Acquarica，I.；Villani，C.；Carotti，A.AnalyticalChemistry 2000，72，1767-1780.
(5)Ekborg-Ott，K.H.；Wang，X.；Armstrong，D.W.MicrochemicalJournal 1999，62，26-49.
(6)Welch，C.J.Journalof Chromatography A 1994，666，3-26.
(7)Dobashi，A.；Dobashi，Y.；Kinoshita，K.；Hara，S.AnalyticalChemistry 1988，60，1985-1987.
(8)Billiot，E.；Warner，I.M.Analytical Chemistry 2000，72，1740-1748.
(9)Wang，Y.；Li，T.Analytical Chemistry 1999，71，4178-4182.
(10)Poole，C.F.；Poole，S.K.Chromatography today；ElsevierNew York，1991.
(11)Creighton，T.E.Proteins.Structures and Molecular Properties.第二版；W.H.Freeman and CompanyNew York，1993.
(12)Carpino，L.；El-Faham，A.；Minor，C.A.；Albericio，F.Journal of the Chemical Society，Chemical Communications 1994，201-203.
權利要求
1.下列結構式的手性固定相化合物 其中n是2或更大的任意整數，及其類似物和異構體。
2.權利要求1的手性固定相化合物，n是2到10的任意整數。
3.權利要求1的手性固定相化合物，其中載體是矽石載體。
4.權利要求1的手性固定相化合物，其中連接基是N-烷氨基。
5.權利要求4的手性固定相化合物，其中連接基是N-甲氨基。
6.權利要求4的手性固定相化合物，其中連接基是6-甲氨基己酸基。
7.權利要求1的手性固定相化合物，其中封端基團是Piv、Fmoc、Boc、Cbz、Aca、Tapa、Dmb、或Tpa基。
8.權利要求1的手性固定相，其中連接基是如下通式 其中n是整數，R是烷基，包括甲基。
9.權利要求1的手性固定相化合物，其中連接基是如下通式
10.權利要求1的手性固定相化合物，其中封端基團是Piv、Fmoc、Boc基。
11.下列通式的權利要求1的手性固定相化合物 及其類似物和異構體。
12.下列通式的手性選擇器 其中n是2或更大的任意整數，及其類似物和異構體。
13.一種通過液相色譜法分離對映體混合物的方法，包括提供外消旋混合物；提供一種手性柱，包括光學活性的多-脯氨酸化合物或其類似物或異構體；和將混合物引入到該手性柱中。
14.權利要求13的方法，其中光學活性的多-脯氨酸化合物是如下通式 其中n是2或更大的任意整數，及其類似物和異構體。
15.權利要求13的方法，其中光學活性的多-脯氨酸化合物是如下通式 及其類似物和異構體。
16.下列通式的權利要求1的手性固定相化合物Fmoc-Pro-Pro-(Me)N-(CH2)5CO-NH(CH2)3矽石(CSP2)；Fmoc-Pro-Pro-Pro-Pro-(Me)N-(CH2)5CO-NH(CH2)3矽石(CSP3)；Fmoc-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-(Me)N-(CH2)5CO-NH(CH2)3矽石(CSP4)；及其類似物和異構體。
全文摘要
本發明涉及具有基於多個脯氨酸基的手性固定相的通用手性柱。
文檔編號C07K17/14GK101052656SQ200480043803
公開日2007年10月10日 申請日期2004年6月15日 優先權日2004年6月15日
發明者T·李 申請人:範德比爾特大學