微生物檢測和計數的製作方法
2023-07-11 06:51:06 3
專利名稱：微生物檢測和計數的製作方法
微生物檢測和計數本發明涉及檢測和計數樣品中物種嗜肺軍團桿菌(Legionella pneumophila)存 活微生物的方法。本發明也包括適用於此方法的試劑盒。此方法和試劑盒使存活微生物的 定量更快速。軍團桿菌(Legionella)細菌在潮溼或溼潤環境例如土壤和非海水生生境中普遍 存在。也可以在溫水和冷水設施、空調系統的冷卻塔和加溼器中找到它們。軍團桿菌特別是嗜肺軍團桿菌是病原體，可引起急性細菌性肺炎，通常稱為「軍團 病」，在感染的個體中經常是致命的。嗜肺軍團桿菌的傳統檢測和計數是通過細胞培養進行。此方法可使用平板計數通 過測量可培養的細菌進行，或應用濾過膜方法測量微菌落進行。這些技術通過存活細菌形 成菌落或微菌落的能力評估存活細菌。不幸的是，這些方法通常需要3至10天以形成菌落 或微菌落。當用水裝置仍然在運行時，在這期間存在感染人的不可接受的風險。檢測總軍團桿菌微生物的其他方法包括PCR(聚合酶鏈式反應)技術。PCR應用 DNA聚合酶通過體外酶促複製擴增一段DNA。在技術進行中，生成的DNA作為複製的模板使 用從而導致DNA模板指數擴增的鏈式反應。PCR通過生成百萬或更多拷貝的DNA段使單個 或較少拷貝的一段DNA擴增。一般的這些方法在Diederen等人，J Med Microbiol. 2007 Jan ；56 (Ptl) :94_101 中描述。然而PCR的一個缺點是樣品容易包含聚合反應抑制劑，因此不能一致的提供量化 結果。此外，該技術依賴於之前的DNA純化步驟，所述步驟可導致DNA的損失從而導致低估 存在的軍團桿菌。在一定程度上定量實時PCR克服了這些缺點。然而，該技術不能區分存 活細胞和非存活細胞。另一個技術是螢光原位雜交(FISH)，其中螢光物質標記的寡核苷酸探針滲入細 菌細胞。其中核糖體核酸(rRNA)具有針對探針的正確序列即靶標，探針將與其靶標吸 附，並且在任意後續清洗步驟中不被去除。固定了探針的細菌之後將發射螢光信號。此 螢光信號可通過例如流式細胞術、固相細胞術或表面螢光顯微鏡技術(epifluorescent microscopy)定量。一般的 FISH 技術在 Dutil S et al J Appl Microbiol. 2006May ； 100(5) :955-63中描述。然而，單獨使用FISH技術可檢測存活的嗜肺軍團桿菌總數，但不 幸的是該方法無法專門鑑定能夠分裂並從而形成菌落的嗜肺軍團桿菌細菌。計數存活嗜肺軍團桿菌的另一個方法涉及ChemChrome V6,在 Delgado-Viscogliosi 等，Appl Environ Microbiol. 2005 Jul ；71 (7) :4086_96 中描述。此 方法允許量化嗜肺軍團桿菌，並能夠區分存活和非存活細菌。此方法結合了用抗體和細菌 存活標記(ChemChrome V6)特異性檢測軍團桿菌細胞和應用表面螢光顯微鏡術計數。然而， 儘管此技術可區分存活和非存活細胞，但不能單獨鑑定那些形成菌落的細菌。目前能夠檢測可分裂的嗜肺軍團桿菌細菌的唯一方法是基於微菌落方法 (Scan-VIT)。然而此方法需要大約72小時。Arana 等}^ 『『 Detection and enumeration of viable but non-culturable transconjugants of Escherichia coli during the survival of recipient cells inriver water"頁340-346，J. App. Microbiol.卷83，1997描述了使用特異性標記的直接活 菌計數(DVC)的用途。Piqueres 等人"A combination of direct viable count and fluorescent in situ hybridisation for estimating Helicobacter pylori cell viability"頁 345-349 Res. Macrobiol.卷 157, 2006禾口 Jjemba等人「 In situ enumeration and probing of pyrene degrading soil bacteria" M 287-298 FEMS Microbiol. Ecol. ^55,2006^ 提及DVC-FISH，但是是用於和嗜肺軍團桿菌無關的微生物。EP-A-1852512描述了鑑定和計數幾種病原微生物包括嗜肺軍團桿菌的方法。所述 方法不僅包括直接活菌計數(DVC)和螢光原位雜交(FISH)，而且應用了輔助探針以放大信 號。輔助探針為與特異性標記探針靶向區域的相鄰區域結合的未標記的寡核苷酸。這增強 了原位可及性和因此增強了探針賦予的信號。EP-A-1852512中描述的方法應用了 DNA促旋酶抑制劑例如萘啶酸，其阻止細胞分 裂、增加細胞內rRNA含量和敏感細胞的細胞長度。然而，在實際操作中萘啶酸對嗜肺軍團 桿菌不是可靠的有效DNA促旋酶抑制劑。此外，此文沒有提到由於天然螢光微生物的存在 可能發生的不準確計數問題。提供比已知技術更快速的用於可靠定量樣品中能夠形成菌落的存活嗜肺軍團杆 菌的方法是理想的。此外，優選更準確地定量。根據本發明我們提供了用於在疑為包含所述微生物的樣品中檢測和計數存活微 生物的方法，包括(1)將所述樣品與細胞營養來源和細胞增殖抑制劑接觸，(2)將所述樣品與至少一種螢光標記的寡核苷酸探針接觸，所述探針能夠特異性 與所述微生物核糖體核酸的至少一部分雜交，(3)檢測和定量螢光信號，其中微生物物種為嗜肺軍團桿菌，其中細胞增殖抑制劑選自環丙沙星和頭孢氨苄。一般的各個步驟相繼進行，其中步驟(2)在步驟(1)處理的樣品上進行，之後步驟 (3)在步驟(2)之後進行。本發明方法的步驟1稱為直接活菌計數(DVC)，基於在抗生素或DNA促旋酶抑 製劑存在下培養細菌，所述DNA促旋酶抑制劑阻斷細胞分裂而不破壞細胞代謝。因此活 細菌傾向於伸長而不分裂，從而可以和不改變大小的死細菌區分。因此有可能通過顯微 鏡鑑定活細菌。在進行DVC步驟之前，濃縮和預處理樣品是理想的，例如通過酸和/熱處 理，根據標準方法 T90-431(ISSN 0335-3931)，由法國標準學會(French Association of Normalization(AFNOR))編輯和公布，11，Avenue Francis de Pressense-93571 St Denis La Plaine Cedex, France.我們出乎意料的發現環丙沙星和頭孢氨苄是非常有效的DNA促旋酶抑制劑。環丙 沙星和頭孢氨苄二者均允許嗜肺軍團桿菌細胞在細胞分裂的準備中伸長，但實際上阻斷了 這些伸長細胞的分裂。相比之下萘啶酸不能提供對本方法有效的嗜肺軍團桿菌細胞的足夠 伸長。有利的，我們發現本發明方法能夠鑑定和可靠定量嗜肺軍團桿菌，並且一般在少於24 小時的時間內。這在水衛生控制中提供了顯著的改進。
環丙沙星或頭孢氨苄可以任意有效量使用。一般的在細胞營養來源包含的培養基 中為高達20mg/L濃度或更高。優選的濃度在1和10mg/L之間。優選的細胞增殖抑制劑為 環丙沙星。我們已經發現，當環丙沙星濃度在2和6mg/L之間，特別是在3和5mg/L之間時， 經過12小時的培養可得到最長的細胞伸長。細胞營養來源應當包括任意合適的可應用於DVC方法和適用於嗜肺軍團桿菌的 生長培養基組分。合適的培養基組分可包含培養基、選擇性添加物、細胞增殖抑制劑(環丙 沙星或頭孢氨苄)和生長添加物。培養基提供了允許嗜肺軍團桿菌生長所需的最低營養。其可為任意合適的培養 基，如文獻中所描述的，例如根據標準方法配方(prescription)T 90-431 (如上面給出)， 不含瓊脂和炭。常常需要選擇性添加物以限制幹擾微生物的生長。抗生素的選擇可為任意已知的 適於DVC方法的添加物，例如在標準方法T 90-431 (如上面給出)中描述的。然而各種抗 生素的濃度一般應當適於具體的液體培養基。然而，在沒有完全消除這些其他微生物的情 況下不一定是有害的，因為步驟2通常足夠特異以克服幹擾細菌的影響。儘管生長添加物對允許嗜肺軍團桿菌細菌的生長不是必要的，但生長添加物可以 優化嗜肺軍團桿菌的生長。嗜肺軍團桿菌的(生長)特徵是每120分鐘增長一倍(在最優 條件下)。然而我們已經發現在一些情況下，能夠形成菌落的存活嗜肺軍團桿菌細菌不一 定立刻形成菌落，而是在生長開始前經歷延遲或遲滯期。此遲滯期可為8至超過20小時之 間，由初始的生理狀態決定。在本發明的一個優選的形式中，可通過在細胞營養來源中包括作為生長添加劑的 抗氧化劑縮短嗜肺軍團桿菌的遲滯期。抗氧化劑可直接作用於活性氧族(ROS)或通過其他 方式，例如直接或間接影響微生物代謝以導致ROS的降低。合適的抗氧化劑包括過氧化氫 酶、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉、二甲亞碸、TDPA(3，3'-硫代二丙酸)和丙酮酸鹽等等。優選的 抗氧化劑為丙酮酸鹽。優選的抗氧化劑劑量，特別是丙酮酸鹽，為0. 5和1. 5g/L之間，特別 是約lg/L0細胞營養來源可包括至少一種間接抑制ROS形成和/或降解ROS的化合物，所述 化合物可通過幹擾微生物代謝導致降低的ROS水平。一般的這些化合物包括胺基酸或其 鹽。特別優選的化合物為穀氨酸或穀氨酸鹽。在本發明的另一個更優選的形式中，細胞營養來源可包括穀氨酸或穀氨酸鹽，特 別是鈉鹽。大體上穀氨酸或穀氨酸鹽的量在0. 01和5%重量濃度之間，以鈉鹽計算。特別優選的，細胞營養來源包括丙酮酸或丙酮酸鹽(特別是鈉鹽)和穀氨酸或谷 氨酸鹽(特別是鈉鹽)二者。丙酮酸或丙酮酸鹽和穀氨酸或穀氨酸鹽組合似乎可誘導協同 效應，因為和單獨使用其中任意一種化合物相比，上述組合可得到可培養軍團桿菌的更高 估計(和因此更準確的估計)。此外我們發現此組合在嗜肺軍團桿菌生長中可導致遲滯期 的縮短，特別是在液體培養基中。液體培養基中的這一遲滯期的縮短導致在瓊脂板上獲得 可見菌落需要的時間縮短。理想的丙酮酸鹽和穀氨酸鹽的量如前述。特別優選的穀氨酸鹽比丙酮酸鹽的比率 在1 1和50 1範圍之間，特別的在5 1和20 1之間，更特別的在7 1和15 1 之間。
已知穀氨酸鹽不是抗氧化劑。然而，似乎間接地穀氨酸鹽可降低在生長中自然形 成的ROS的內源產生，或其對大分子的影響(氧化)。沒有理論局限，推測穀氨酸改變了軍團桿菌的代謝以提高丙酮酸鹽的作用，此對 軍團桿菌的代謝幹擾間接抑制了 ROS的形成和/或降解細胞內R0S。本發明的方法使應用的培養基較短，理想的不超過24小時。優選的可將此縮短至 12小時，特別是細菌幹擾低發生和/或嗜肺軍團桿菌細菌高發生時。樣品可從任意合適的地點收集。這可為例如冷卻系統的再循環水的水樣品。然而， 理想的樣品可以氣霧形式從水中得到。一般的氣霧位於冷卻塔或空調中。理想的在根據本 發明方法檢測前，水從氣霧中冷凝。培養模式可為如文獻中定義的描述DVC的程序。這樣的方法可包含樣品過濾和之 後在用培養基浸透的墊(pad)上過濾培養。優選的根據本發明，樣品或濃縮的樣品直接在 培養基中培養，之後過濾。這樣我們可以降低在培養過程中損失細菌的風險，並在培養中提 供更好的條件，例如氧轉移或樣品的搖晃。本發明方法的步驟2可應用標準FISH實驗方案。在FISH程序的第一部分，可通過處理細胞外膜(external membrane)或外膜 (envelope)固定細胞以使寡核苷酸探針可滲透細胞。一般的這可通過使用固定液進行，固 定液為可在25°C和水混合的醇或醛的水溶液。合適的醇或醛包括甲醛、多聚甲醛、乙醇和/ 或甲醇。一般的甲醛或多聚甲醛溶液可為高達10%重量濃度，優選的在1和5%之間。通 常醇為至少50%重量濃度，一般在60和90%重量濃度之間。優選的此處理可通過一種或 多種這些溶液的相繼處理進行。優選的處理可包含1和5%之間的甲醛或多聚甲醛溶液，和 之後的2或3種在50%和90%之間的濃度遞增的乙醇或甲醇溶液。該FISH程序而後通過應用包含至少一種螢光標記的寡核苷酸探針的雜交緩衝液 進行雜交程序，所述探針包含連接螢光標記的寡核苷酸，其中寡核苷酸能夠靶向細胞內的 特異序列。寡核苷酸探針穿透細胞外膜並結合寡核苷酸對應的靶序列。結合應理解為在互 補核酸片斷間形成氫鍵。在FISH技術中寡核苷酸探針是與微生物內核糖體靶序列的某區 域互補的，並能與其結合。一般的探針包含15和30鹼基之間長度的單鏈脫氧核糖核酸片 斷，並針對微生物特異的特異靶區域。寡核苷酸探針應當理想的為嗜肺軍團桿菌的特異核糖體ARN 16S探針。可應用特 異靶向微生物物種嗜肺軍團桿菌的任意寡核苷酸探針。優選的探針選自Grimm等人，1998 描述的具有5'至3'鹼基序列為ATC TGA CCG TCC CAG GTT的PNE 1探針、Grimm等人， 1998和Declerck等人，2003描述的具有5'至3'鹼基序列為ATCTG ACCGT CCCAG GTT的 LEGPNE 1探針(SEQ ID No 22)和Yamamoto等人，1993描述的具有5『至3'鹼基序列為 AGCTT TCATC CAAAG ATA 的 LP2 探針(SEQ ID No 23)。也可理想的可選的應用與3種探針PNE 1探針、LEGPNE 1探針或LP2探針中任一 種探針具有至少70%、優選的至少80%和更優選的至少90%同一性序列的探針。為了克服錯誤鑑定天然螢光微生物的風險，本發明的一個優選的形式應用2種核 酸探針。第1種探針靶向軍團桿菌屬的所有微生物，第2種探針設計為特異雜交嗜肺軍團 桿菌種的微生物。每種探針標記不同的螢光染料。具有天然螢光的微生物僅在特異波長或 窄範圍波長下發出螢光，因此使用具有在不同波長下發出螢光的不同染料的2種探針能夠消除非特異性嗜肺軍團桿菌的天然螢光微生物。在本發明的此優選形式中，第1種探針與屬於軍團桿菌屬的微生物雜交，所 述微生物包括但不局限於長灘軍團桿菌(Legionella longbeachae)、約旦軍團桿菌 (Legionella jordanis)、茴香軍團桿菌(Legionella anisa)和嗜肺軍團桿菌。此第1種探 針可包含可與任意軍團桿菌屬內的細菌的靶核糖體序列結合的核苷酸。一般的第1種探針 可為選自Manz等人(Manz等人1995)描述的具有5'至3'鹼基序列為CTGGT GTTCC TTCCG ATC的LEG705探針(SEQ ID n° 7)、Manz等人(Manz等人1995)描述的具有5'至3'鹼 基序列為 TCGGA CGCAG GCTAA TCT 的 LEG226 探針(SEQ ID n° 8)、Leskela 等人(Leskela 等人2005)描述的具有5'至3'鹼基序列為CCTCC TCCCC ACTGA AAGT的Legallll探針 (SEQ ID n° 9)、Leskela等人(Leskela等人2005)描述的具有5'至3'鹼基序列為CACTG TATGT CAAGG GTAGG 的 Legal 122 探針(SEQ ID n° 10)和 Buchbinder 等人(Bushbinder 等 人2002)描述的具有5'至3'鹼基序列為AAGGC ATATT CCTAC GCG的Legl20v探針(SEQ ID η ° 11)的任意探針。也可理想的可選的應用與3種探針LEG705探針、LEG226探針、Legallll探針、 Legal 122探針和Legl20v探針中任一種探針具有至少70%、優選的至少80%和更優選的至 少90%同一性序列的探針。第2種探針僅可雜交嗜肺軍團桿菌特異物種，可為具有此特徵的任意上述核苷酸 探針，例如3種探針PNE 1探針、LEGPNE 1探針或LP2探針中的任一種。可使用已知與FITC (例如Syto9、Alexa 488等等)或Cy3 (例如羅丹明、Alexa 583 等等)的合適發射/激發光譜相容的任意螢光染料。步驟3涉及使用顯微鏡定量相關細菌。這可人工或自動化進行，例如使用表面熒 光顯微鏡。優選的檢測和計數經原位雜交標記和在濾膜上固定的細菌需要使用裝備表面熒 光系統的顯微鏡。合適的檢測裝置包括ChemScan RDI 和 ScanVIT-Legionella TM(Vernicon AG, Munich,Germany)。可使用chemscan (AESChemunex開發的固相細胞儀)檢測和計數標記的 細菌。然而，此系統僅可使用1套發射/激發鏡(488nm)，因此限制我們的實驗方案僅使用 1種標記探針。根據應用至少2種探針的本發明的上述優選方面，特別優選ScanVIT-Legionella TM,因為此技術允許使用2種不同的螢光信號以消除非嗜肺軍團桿菌的天然螢光微生物。根據本發明的方法使準確和快速定量測定嗜肺軍團桿菌的存在更容易。所述方法 適用於檢測選自工業冷卻水、飲用水和天然水來源的樣品中的嗜肺軍團桿菌。本發明還包含在疑為包含所述微生物的樣品中快速檢測和計數物種嗜肺軍團杆 菌存活微生物的試劑盒，包含(1)細胞營養來源，(2)細胞增殖抑制劑，(3)能夠與所述微生物核糖體核酸的至少一部分特異性雜交的至少一種螢光標記 的寡核苷酸探針，(4)檢測和定量螢光信號的方法，其中細胞增殖抑制劑選自環丙沙星和頭孢氨苄。
在一個優選的形式中試劑盒可包含以下溶液可脫水以用於長期貯藏的培養基組 分(如上面定義的)；用於固定細菌外膜的溶液，例如甲醛；雜交溶液，例如上述，應當在使 用前立刻配製；清洗溶液，例如上述，應當在使用前立刻配製；核酸螢光染料，例如DAPI，可 脫水以用於長期貯藏；抗褪色封固劑。優選的試劑盒可包含濾器。更優選的試劑盒可另外包 含生理緩衝液；濃度在50和90%變化的乙醇溶液；和無菌水。試劑盒可還包含Eppendorf 管，例如 2ml (的 Eppendorf 管)。試劑盒還可包含任意有關本發明第一個方面描述的實施方案。試劑盒適用於以本發明的方法使用，使嗜肺軍團桿菌的計數更快速和可靠。以下實施例舉例說明本發明。實施例1將終濃度IO6細菌/ml的嗜肺軍團桿菌懸浮液分成相同體積的2份懸浮液。僅第 一份懸浮液(Si)用3. 7% (v/vl)甲醛固定，在環境溫度(20至22°C )下固定30分鐘。之 後將2份懸浮液用ρΗ7· 4的PBS離心(6，OOOxg, 5分鐘，20°C )洗3次。將2份懸浮液根據表1最終混合。表 權利要求
用於在疑為包含存活微生物的樣品中檢測和計數所述微生物的方法，包括(1)將所述樣品與細胞營養來源和細胞增殖抑制劑接觸，(2)將所述樣品與至少一種螢光標記的寡核苷酸探針接觸，所述探針能夠特異性與所述微生物核糖體核酸的至少一部分雜交，(3)檢測和定量螢光信號，其中微生物物種為嗜肺軍團桿菌，其中細胞增殖抑制劑選自環丙沙星和頭孢氨苄。
2.根據權利要求1的方法，其中步驟1)的細胞營養來源包含生長添加物，所述生長添 加物包含抗氧化劑，優選丙酮酸(或其鹽)。
3.根據權利要求1或權利要求2的方法，其中步驟1)的細胞營養來源包含穀氨酸(或 其鹽)。
4.根據上述權利要求中任一項的方法，其中步驟1)的細胞營養來源包含穀氨酸(或其 鹽)和丙酮酸(或其鹽)。
5.根據上述權利要求中任一項的方法，其中寡核苷酸探針選自PNE1探針、LEGPNE 1 探針和LP2探針。
6.根據上述權利要求中任一項的方法，其中步驟(2)中所述樣品與至少第1探針和第 2探針接觸，其中第1探針能夠特異性與所述微生物核糖體核酸的至少一部分雜交，第2探 針能夠特異性與所述微生物核糖體核酸另外的至少一部分雜交。
7.根據上述權利要求中任一項的方法，其中步驟(2)中所述樣品與至少第1探針和第 2探針接觸，其中第1探針能夠特異性與全部屬於軍團桿菌屬的核糖體核酸的至少一部分 雜交，其中第2探針能夠特異性與全部屬於嗜肺軍團桿菌物種的核糖體核酸的至少一部分 雜交。
8.根據權利要求7的方法，其中第1探針選自LEG705探針、LEG226探針、Legallll探 針、Legall22探針和Legl20v探針。
9.根據上述權利要求中任一項的方法，其中步驟(3)使用表面螢光顯微鏡自動化進行。
10.根據上述權利要求中任一項的方法，其中樣品的來源任選自工業冷卻水、飲用水和 天然水。
11.在疑為包含嗜肺軍團桿菌物種存活微生物的樣品中更快速的檢測和計數所述微生 物的試劑盒，包含(1)細胞營養來源，(2)細胞增殖抑制劑，(3)至少一種能夠與所述微生物核糖體核酸的至少一部分特異性雜交的螢光標記的寡 核苷酸探針，(4)檢測和定量螢光信號的方法，其中細胞增殖抑制劑選自環丙沙星和頭孢氨苄。
全文摘要
用於在疑為包含存活微生物的樣品中檢測和計數所述微生物的方法，包括(1)將所述樣品與細胞營養來源和細胞增殖抑制劑接觸，(2)將所述樣品與至少一種螢光標記的寡核苷酸探針接觸，所述探針能夠特異性與所述微生物核糖體核酸的至少一部分雜交，(3)檢測和定量螢光信號，其中微生物物種為嗜肺軍團桿菌，其中細胞增殖抑制劑選自環丙沙星和頭孢氨苄。本發明還包括試劑盒，包含(1)細胞營養來源，(2)細胞增殖抑制劑，(3)至少一種能夠與所述微生物核糖體核酸的至少一部分特異性雜交的螢光標記的寡核苷酸探針，(4)檢測和定量螢光信號的方法，其中細胞增殖抑制劑選自環丙沙星和頭孢氨苄。
文檔編號C12Q1/68GK101990579SQ200980112296
公開日2011年3月23日 申請日期2009年3月20日 優先權日2008年4月4日
發明者A·杜克裡特, S·杜坎, Y·弗維特 申請人:巴斯夫歐洲公司;科學研究國家中心