將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的方法及應用與流程
2023-08-12 10:34:11 2
本發明屬於細胞工程
技術領域：
，特別是涉及一種可將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的方法，也包括該方法中所用到的特定小分子化合物組合及該內胚層幹/祖細胞進一步向實質細胞誘導分化的應用。
背景技術：
：幹細胞技術多次被《自然》、《科學》等雜誌評為二十一世紀生命科學領域最具發展前景的技術，是攻克各種傳統醫學治療手段力所不及的重大疾病的一種全新的醫療技術。幹細胞具有自我更新和多向分化潛能，在器官組織再生、疾病模型建立、發育生物學及藥物研發等領域具有廣闊的應用前景。近10年來，幹細胞理論與技術研究取得了飛速的發展，有望成為全新的疾病治療方式，推動醫學治療的範式轉換，引領新的醫學革命。幹細胞有多種不同的分類方法，從發育的角度來看，幹細胞大致分為胚胎幹細胞(embryonicstemcells)(escs)和成體幹細胞(adultstemcells)兩大類。escs來源於囊胚期的內細胞團(innercellmass)(icm)，是一類具有無限自我更新和向人體所有細胞類型進行分化的多能性幹細胞。1998年，thomson在世界上首次建立了人胚胎幹細胞系(hescs)[thomsonja,itskovitz-eldorj,shapiross,waknitzma,swiergieljj,marshallvs,etal.embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.science.1998；282:1145-7.]，由於其能夠產生成體所有細胞類型，理論上能為基礎研究、疾病治療和藥物研發提供理想的細胞來源。多年來利用escs已經產生了多種功能性細胞，包括心肌細胞、神經細胞、血細胞和肝臟細胞等[murryce,kellerg.differentiationofembryonicstemcellsto ；clinicallyrelevantpopulations:lessonsfromembryonicdevelopment.cell.132:661-80.]。然而，escs的使用在國際上面臨著倫理學的爭議，而且escs來源的細胞移植後會產生免疫排斥反應，未分化的escs會形成畸胎瘤等諸多問題，因此大大限制了其走向臨床的應用。而成體幹細胞存在於出生後各個階段的多種組織中，具有一定的自我更新能力並且能夠向其來源組織中的成熟細胞進行分化，如造血幹細胞、間充質幹細胞、肝臟幹細胞和神經幹細胞等。由於其來源於成體組織且只能向固定的方向分化，因此不具有成畸胎瘤的風險，也沒有倫理學的問題，所以是臨床疾病治療的良好種子細胞。但其來源畢竟有限，只能從人體組織中分離獲得，而且分化潛能也很局限只能生成其所在譜系內的一種或幾種成熟細胞類型，體外也很難大規模的擴增，所以其臨床應用也有很大的局限性。多年來，眾多的研究都在致力於尋求更為理想的細胞類型來進行疾病的治療、藥物研發和機制研究。傳統的表觀遺傳學觀點認為譜系的特化、細胞的分化是單向的、不可逆的過程，多能的細胞狀態只能向終末成熟的細胞狀態進行命運特化(waddington』epigeneticlandscape)。而誘導多能性幹細胞(inducedpluripotentstemcells)簡稱ipscs的出現深刻的改變了這一觀念。2006年日本科學家yamanaka利用escs特異性的4個多能性相關的轉錄因子oct4、sox2、klf4、c-myc(oskm)成功的將成纖維細胞轉換為類似escs的多能性幹細胞ipscs，首次證實了終末分化的細胞在多能性相關轉錄因子的作用下可以重新獲得分化多能性，這就是經典的重編程技術[takahashik,yamanakas.inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.cell.126:663-76.takahashik,tanabek,ohnukim,naritam,ichisakat,tomodak,etal.inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.cell.131:861-72.]。ipscs的出現具有裡程碑式的意義：首先，它突破了經典的表觀遺傳全景模式，極大的豐富了細胞命運轉換的理論，引領了細胞命運研究和幹細胞研究的範式轉換，給再生醫學的基礎研究和臨床應用開闢了廣闊前景。其次，ipscs具有escs的無限自我更新和向體內所有細胞類型進行分化的潛能，同時避免了escs研究和應用的倫理學爭議。再次，由於成纖維細胞可取自病人自體因此也避免了escs分化產生的終末細胞移植入體內帶來的免疫排斥問題。最後，病人自體來源的ipscs可以建立個體特異性的疾病細胞模型和個體化的藥物篩選平臺。ipscs的出現不僅給疾病的基礎研究，藥物篩選帶來新的研究模式，而且使多能性幹細胞(pscs)走向臨床應用跨進一大步。利用ipscs已經成功的產生了多種功能性細胞類型，而且ipscs來源的視網膜色素上皮治療致盲性眼病的臨床試驗正在開展。yamanaka也因此項技術而獲得2012年的諾貝爾生理學或醫學獎。儘管ipscs具備多方面的優勢，是一種非常具有治療前景的細胞類型，然而由於同樣具有escs類似的多能性依然難以避免致畸胎瘤的風險，此外ipscs向功能性細胞進行分化的過程中存在隨機性分化的問題，會產生多種非預期細胞類型，這些問題都會對大規模的臨床應用帶來安全性的風險。為了彌補這一缺陷，近年來基於ipscs技術和原理發展而來的譜系重編程(lineagereprogramming)技術日益受到廣泛的重視。譜系重編程主要使用目的細胞譜系特異性的轉錄因子(lineagespecifictranscriptionalfactors)而非多能性的轉錄因子(oskm)在起始細胞主要是皮膚成纖維細胞或血細胞中進行過表達，進而將起始細胞直接轉換為目的細胞。譜系重編程的出現同樣是幹細胞領域具有裡程碑意義的重要事件。首先，由於不經過ipscs的多能性階段，譜系重編程避免了ipscs的致畸胎瘤風險；其次，譜系重編程可以根據使用的轉錄因子和培養條件的不同直接獲得終末成熟的功能細胞或者具有擴增能力的成體幹細胞，而且得到的目的細胞類型相對均一；再次，譜系重編程也具有ipscs的無免疫排斥及個體化的優勢，因此在幹細胞與再生醫學研究和疾病治療上顯示出了更為廣闊的應用前景[sancho-martinezi,baeksh,izpisuabelmontejc.lineageconversionmethodologiesmeetthereprogrammingtoolbox.natcellbiol.2012；14:892-9.]。最後，譜系重編程的出現極大的豐富了細胞命運轉換和重編程理論的內涵，使人們對於細胞命運特化和調控的理解更為全面和深刻，並將這一概念應用到更為廣闊的領域。從2008年首次實現在同一胚層內的胰腺外分泌細胞向內分泌β細胞的譜系重編程[zhouq,brownj,kanareka,rajagopalj,meltonda.invivoreprogrammingofadultpancreaticexocrinecellstobeta-cells.nature.2008；455:627-32.]到2010年開始實現跨胚層的成纖維細胞向神經細胞的轉換[vierbuchent,ostermeiera,pangzp,kokubuy,sudhoftc,wernigm.directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.nature.2010；463:1035-41.]，譜系重編程領域取得了一個又一個的巨大突破。目前使用病毒介導轉錄因子在體細胞中過表達的方式，已在三個胚層的的多種細胞類型中成功的實現了命運轉換。在外胚層中已經將成纖維細胞轉換為多種類型的神經元、神經幹細胞等；在中胚層已經獲得了心肌細胞、心肌祖細胞、造血幹/祖細胞等；在內胚層獲取了胰島細胞、肝細胞、肝幹細胞等。在這一領域尤其是肝系細胞的譜系重編程領域，中國科學家取得了一系列突破。2011年國內恵利建實驗室在國際上首次使用肝細胞特異性的轉錄因子組合成功的將小鼠成纖維細胞轉換為肝細胞[huangp,hez,jis,sunh,xiangd,liuc,etal.inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.nature.2011；475:386-9.]。2013年胡以平實驗室使用轉錄因子組合又獲得了具有自我更新和向肝細胞、膽管細胞進行分化的小鼠肝幹細胞[yub,hezy,youp,hanqw,xiangd,chenf,etal.reprogrammingfibroblastsintobipotentialhepaticstemcellsbydefinedfactors.cellstemcell.2013；13:328-40.]。2015年惠利建和鄧宏魁實驗室分別獨立的使用不同的轉錄因子組合成功的將人的成纖維細胞轉變成功能性肝細胞，為肝病治療、藥物篩選提供了良好的種子來源[duy,wangj,jiaj,songn,xiangc,xuj,etal.humanhepatocyteswithdrugmetabolicfunctioninducedfromfibroblastsbylineagereprogramming.cellstemcell.2014；14:394-403.huangp,zhangl,gaoy,hez,yaod,wuz,etal.directreprogrammingofhumanfibroblaststofunctionalandexpandablehepatocytes.cellstemcell.2014；14:370-84.]。儘管這些年來利用譜系重編程已獲取了人或鼠的多種細胞類型，而且已經彌補了ipscs應用上的多個缺陷，然而目前絕大多數譜系重編程的研究都是依賴於慢病毒或逆轉錄病毒介導的轉錄因子過表達的方式，這些病毒載體進入目的細胞後存在與宿主基因組整合，由此可能導致宿主基因組不穩定，為將來的臨床應用帶來安全性隱患，此外轉錄因子的操作過程複雜、效率較低下，不同實驗室操作規程不一，難以大規模的擴展應用。因此諸多的研究目前致力於尋找更為安全的、高效的方式來替代轉錄因子。與轉錄因子相比，小分子化合物具有明顯的多方面的優勢，小分子化合物可以自由通透細胞、易於合成、經濟高效、無免疫源性、作用於蛋白水平不與基因組整合、可以標準化和規模化生產。通過改變小分子的濃度和作用時間較容易實現蛋白調控的強度和時空控制。近年來眾多的研究都在致力於篩選小分子用於提高ipscs的生成效率，縮短ipscs的生成時間，減少轉錄因子的使用，最終目的都是為了完全使用小分子來替代經典的yamanaka四因子，從而避免病毒在宿主細胞中整合[liw,lik,weiw,dings.chemicalapproachestostemcellbiologyandtherapeutics.cellstemcell.2013；13:270-83.]。2013年國內鄧宏魁實驗室，在這方面取得了突破性的進展，其團隊通過多次的篩選，找到了合適的小分子化合物組合能夠在不依賴任何外源轉錄因子的情況下實現小鼠成纖維細胞向ipscs的重編程，儘管效率只有0.2％並且過程複雜，但這項突破為基於小分子的重編程和譜系重編程帶來了理論及現實的依據[houp,liy,zhangx,liuc,guanj,lih,etal.pluripotentstemcellsinducedfrommousesomaticcellsbysmall-moleculecompounds.science.2013；341:651-4.]。在研究小分子化合物介導ipscs產生的同時，篩選合適的小分子用於調控譜系重編程甚至完全替代譜系特異性轉錄因子，從而產生安全高效可控的目的細胞的研究也在國內外如火如荼的開展[lik,zhus,russha,xus,xut,zhangy,etal.smallmoleculesfacilitatethereprogrammingofmousefibroblastsintopancreaticlineages.cellstemcell.2014；14:228-36.zhus,rezvanim,harbellj,mattisan,wolfear,benetlz,etal.mouseliverrepopulationwithhepatocytesgeneratedfromhumanfibroblasts.nature.2014；508:93-7.zhus,russha,wangx,zhangm,mat,xut,etal.humanpancreaticbeta-likecellsconvertedfromfibroblasts.natcommun.2016；7:10080.]。在這一領域，中國科學家同樣取得了令人矚目的成就，裴剛實驗室近期篩選到合適的小分子組合將阿爾茨海默病病人來源的成纖維細胞重編程為成熟的功能性神經元[huw,qiub,guanw,wangq,wangm,liw,etal.directconversionofnormalandalzheimer'sdiseasehumanfibroblastsintoneuronalcellsbysmallmolecules.cellstemcell.2015；17:204-12.]，而鄧宏魁實驗室則成功的使用小分子組合將小鼠的成纖維細胞轉換為神經元[lix,zuox,jingj,may,wangj,liud,etal.small-molecule-drivendirectreprogrammingofmousefibroblastsintofunctionalneurons.cellstemcell.2015；17:195-203.]，leizhang等完全使用小分子將人星形膠質細胞譜系重編程為功能性神經元[zhangl,yinjc,yehh,manx,leeg,chenxa,etal.smallmoleculesefficientlyreprogramhumanastroglialcellsintofunctionalneurons.cellstemcell.2015；17:735-47.]。這些突破性的進展為完全使用小分子將成體細胞轉換為其他類型的功能性細胞或幹細胞奠定了堅實的理論基礎，也帶來巨大希望。《體細胞重編程技術在肝臟再生中的應用基礎研究》[張文成，2012年博士論文]討論了利用小分子化合物譜系重編程消化道細胞獲得誘導內胚層多能幹細胞(iemsc)，實驗中使用sb431542、vpa、y27632小分子化合物以及成分未公開的1#-6#小分子組合進行了誘導重編程效率的比較。內胚層幹/祖細胞是肝臟、胰腺、胃、腸等內臟器官發育的源泉，獲得內胚層幹/祖細胞，並進行大量的擴增，然後再對其進行誘導分化，獲得大量的功能性肝細胞、胰腺細胞或腸上皮細胞將對多種類型的內胚層器官疾病的治療具有巨大的意義。眾所周知，我國是肝病大國，目前有9700萬的B肝病毒攜帶者，1000萬的C肝病毒攜帶者，近年來酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝病在我國的發展趨勢也明顯升高，其它包括藥物性肝損傷、免疫性肝病等都嚴重影響我國的國民身體健康[wangfs,fanjg,zhangz,gaob,wanghy.theglobalburdenofliverdisease:themajorimpactofchina.hepatology.2014；60:2099-108.]。各種肝病如果缺乏及時有效的治療都將逐漸進展到以肝硬化，肝衰竭和肝癌為代表的終末期肝病(esld)的階段。我國龐大的肝病基礎人群造成了每年數十萬人罹患esld。而對於esld而言，目前的治療手段非常有限，人工肝的治療還未成熟難以大規模開展，內科治療只能採取保守姑息的方式，對於esld目前公認的最有效的治療方式是原位肝移植，但又嚴重受限於肝源的匱乏。據估計我國每年死於esld的人群超過30萬例，給萬千家庭帶來巨大痛苦，給社會帶來沉重的醫療負擔。而功能性肝細胞移植被認為是肝移植的良好替代治療方式，但同樣也受限於來源的匱乏。此外，無論是我國還是世界上其他國家，都擁有龐大的糖尿病人群，而且還呈現逐年增加的趨勢。國際糖尿病聯盟(internationaldiabetesfederation)的分析顯示在不遠的將來糖尿病將影響世界上超過30億的人口。然而目前糖尿病的治療方法同樣有限而且效果不一，尤其是ⅰ型糖尿病(t1dm)只能通過終生注射外源性的胰島素進行治療，長期注射胰島素費用昂貴，還會產生胰島素抵抗，降低治療效果以及帶來感染、低血糖、過敏反應等一系列慢性併發症的風險。而t1dm被認為可通過外源性移植胰島β細胞來治癒並且目前的研究已取得令人矚目的進展[bellinmd,bartonfb,heitmana,alejandror,heringbj.potentinductionimmunotherapypromoteslong-terminsulinindependenceafterislettransplantationintype1diabetes.americanjournaloftransplantation.2012；12:1576-83.]，但外源性胰島或β細胞的缺乏嚴重阻礙了這種治療方式的應用。如果能夠獲得內胚層幹/祖細胞，並進行大量的擴增然後再對其進行誘導分化進而獲得大量的功能性肝細胞、胰腺β細胞或腸上皮細胞將會對肝病的細胞治療，糖尿病的細胞治療甚至腸道疾病的治療帶來巨大的希望。多項研究已經報導從多能性幹細胞escs或ipscs來獲得內胚層幹/祖細胞並將其向肝臟和胰腺進行誘導分化[sneddonjb,borowiakm,meltonda.self-renewalofembryonic-stem-cell-derivedprogenitorsbyorgan-matchedmesenchyme.nature.2012；491:765-8.chengx,yingl,lul,galvaoam,millsja,linhc,etal.self-renewingendodermalprogenitorlinesgeneratedfromhumanpluripotentstemcells.cellstemcell.2012；10:371-84.]，然而由於其來源於多能性幹細胞，同樣難以迴避前述的多能性幹細胞應用面臨的問題。目前國際上多項研究都在致力於使用小分子將人的成體細胞重編程為內胚層祖細胞或者其來源的肝臟細胞和胰腺細胞。2014年丁盛實驗室使用yamanaka四因子oskm在人成纖維細胞中短暫過表達並且結合小分子使細胞首先進入一個不同於escs或ipscs多能性狀態的一個可塑中間態，然後再給予內胚層的誘導條件將成纖維細胞重編程到內胚層祖細胞階段(eps)，接著使用肝細胞的序貫誘導方法最終獲得了類肝細胞樣的細胞[zhus,rezvanim,harbellj,mattisan,wolfear,benetlz,etal.mouseliverrepopulationwithhepatocytesgeneratedfromhumanfibroblasts.nature.2014；508:93-7.]。近期使用類似的方案，他們將人成纖維細胞重編程到內胚層祖細胞階段後，進而向胰腺進行誘導分化，從而獲取了功能性的β細胞[zhus,russha,wangx,zhangm,mat,xut,etal.humanpancreaticbeta-likecellsconvertedfromfibroblasts.natcommun.2016；7:10080.]。儘管這一方式不經過多能性狀態，因此避免了多能性幹細胞的成畸胎瘤性，但其依然需要oskm四因子的始發驅動，因此還是一個部分依賴於轉錄因子的策略，還未做到完全依賴小分子的作用。分析目前整個重編程領域還未實現僅使用小分子來介導譜系重編程獲得上皮源性的內胚層譜系細胞類型包括內胚層祖細胞、肝細胞或胰腺細胞的原因，我們認為存在以下幾個關鍵的科學問題：1、起始細胞的問題：首先，無論是經典重編程ipscs還是譜系重編程，絕大多數都是以成纖維細胞為起始細胞，儘管成纖維細胞在獲取上比其它成體細胞相對容易，通過皮膚活檢即可獲得，因此也是臨床應用的一大優勢，然而對於期望獲得的目的細胞如內胚層祖細胞、肝細胞或胰腺細胞而言，以成纖維細胞為起始存在表觀遺傳的障礙。成纖維細胞來源於中胚層，而目的細胞內胚層祖細胞則屬於內胚層，由中胚層向內胚層的跨胚層轉換是一個巨大障礙，尤其是對於作用較為溫和的小分子而言顯得更為困難。其次，成纖維細胞在組織學分類上屬於間質類細胞，而內胚層祖細胞則屬於上皮類細胞，由成纖維細胞向內胚層祖細胞的轉換需要經歷間質上皮轉換(met)的過程，而met已經被證實是ipscs產生過程中需要突破的首個重要障礙[lir,liangj,nis,zhout,qingx,lih,etal.amesenchymal-to-epithelialtransitioninitiatesandisrequiredforthenuclearreprogrammingofmousefibroblasts.cellstemcell.2010；7:51-63.]，同樣met也是譜系重編程的重要障礙。2、小分子的選擇問題：小分子的選擇與起始細胞的特性密切相關，不同的起始細胞決定了在向內胚層祖細胞的轉換過程所需要的小分子組合也不盡相同。由於目前還沒有完全使用小分子獲取內胚層的任何一種細胞類型的報導來作為參考，因此在小分子的選擇上要經過詳盡的調研和篩選。3、滋養層細胞的使用問題：滋養層細胞可以分泌多種細胞因子，可溶性細胞外基質或microrna等，並且和培養的細胞密切接觸，給細胞的生長和存活提供合適的細胞外微環境。滋養層細胞對於幹/祖細胞的培養和重編程來說通常是必須的，而目前無論是重編程還是譜系重編程最常用的滋養層細胞都是小鼠胚胎成纖維細胞(mefs)、人包皮成纖維細胞(hffs)或間充質幹細胞(mscs)等，這些細胞僅能提供基礎的幹細胞生長環境並不具有譜系特異的支持和誘導作用。技術實現要素：本發明的目的是提供一種將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的方法。本發明中，「幹/祖細胞」的概念為「幹細胞」或「祖細胞」，所指為同一種細胞，因業內命名不統一，統稱為「幹/祖細胞」。本發明所提供的將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的方法，可包括以下步驟：1)將原代分離的消化道來源上皮細胞作為起始細胞，擴增培養所述消化道來源上皮細胞；2)用絲裂黴素-c處理滋養層細胞後清洗，並用酶消化細胞後備用；3)將步驟2)準備的滋養層細胞添加於步驟1)擴增培養的消化道來源上皮細胞中，繼續共培養過夜；4)第2天更換為重編程培養基，每2-3天換一次培養基，培養7-15天，得到誘導內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)克隆。在上述方法中，所述步驟1)中的起始細胞為消化道來源上皮細胞包括胃、十二指腸上皮細胞。從臨床獲取的難易程度考慮，胃上皮細胞更易獲取，因此優選為胃上皮細胞(hgecs)，尤其優選為ncam(神經細胞黏附分子)陽性的胃上皮細胞(hgecs)。步驟1)優選以ncam陽性的胃上皮細胞為起始細胞，用kubota(庫部塔)培養基在37攝氏度，5％co2培養箱條件下培養5天。所述步驟2)中的滋養層細胞為消化道來源的基質細胞，包括胃肌成纖維細胞或小腸肌成纖維細胞，優選人胃肌成纖維細胞(agsemfs)。步驟2)優選用絲裂黴素-c處理人胃肌成纖維細胞(agsemfs)2-3小時，用pbs清洗細胞，用tryple酶消化細胞。步驟3)優選按1～3×105每平方釐米的密度將步驟2)準備的滋養層細胞添加於步驟1)培養到5天的消化道來源上皮細胞中，在37℃、5％co2培養箱中過夜(12-16小時)。步驟4)中所述重編程培養基為小分子化合物組合與基礎培養基和細胞培養基礎添加成分的混合物；所述小分子化合物選自tgf-β信號通路、表觀修飾劑、鈣離子通道激動劑和代謝通路調節劑等功能群；代表性的含有8個小分子化合物的組合(8m)，包括fbp、bayk8644(bay)、bix01294((bix)、sb431542(sb)或a83-01(a83)、vpa、rg108(rg)、pd0325901和ps48中的全部或多個包括sb或a83在內的化合物的組合。所述8m組合為sb43154：vpa：pd0325901：rg108：bix01294：bayk8644：ps48：fbp按摩爾比為50：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的組合；或a83：vpa：pd0325901：rg108：bix01294：bayk8644：ps48：fbp按摩爾比為12.5：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的組合，且按該配比的8m組合在使用中滿足rg使用濃度為0.01～1μm，優選0.04μm。優選的小分子化合物組合為包括4個小分子化合物的組合，為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)組合(簡稱bbrs組合)，或為a83-01(a83)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)組合(簡稱bbra組合)；所述小分子化合物組合中各化合物使用濃度為：sb43152為(1～10μm)，a83為(0.4～1μm)，rg108為(0.01～1μm)，bix01294為(0.1～2μm)，bayk8644為(1～4μm)。bbrs組合為各化合物按sb：rg：bix：bay摩爾比50:1:12.5:50的組合，bbra組合為各化合物按a83：rg：bix：bay摩爾比12.5:1:12.5:50的組合；優選各化合物使用濃度sb43152為2μm，a83為0.5μm，rg108為0.04m，bix01294為0.5μm，bayk8644為2μm。所述基礎培養基為advanceddmem/f12，細胞培養基礎添加成分包括穀氨醯胺(glutamax)和抗生素，其中在advanceddmem/f12中穀氨醯胺的使用濃度為2mm(1×)，抗生素為青-鏈黴素,使用濃度為100u/ml青黴素，0.1mg/ml鏈黴素。所述步驟4)中的重編程培養基配方為：advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，2μm的sb43154或0.5μm的a83-01，0.5mm的vpa，0.5μm的pd0325901，0.04μm的rg108，0.5μm的bix01294，2μm的bayk8644，5μm的ps48，3.5mm的fbp；所列濃度均為使用濃度，即各組分在advanceddmem/f12(溶劑)中的濃度。或，advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，1～10μm的sb43152，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；優選advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，2μm的sb43152，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644；或advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，0.4～1μm的a83-01，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；優選advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，0.5μm的a83-01，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644。具體的，將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的方法，包括以下步驟：1)將原代分離的消化道來源上皮細胞作為起始細胞，用無血清kubota’smedium(庫部塔培養基)在37攝氏度，5％co2培養箱條件下培養5天；2)用絲裂黴素-c處理滋養層細胞2-3小時，用pbs清洗細胞，用tryple酶消化細胞；3)按1～3×105每平方釐米的密度將步驟2)準備的滋養層細胞添加於步驟1)培養了4-5天的起始上皮細胞中，在37℃、5％co2條件下共培養過夜(12-16小時)；4)第2天起，更換為重編程培養基，每2-3天換液一次，培養7-15天後，獲得誘導內胚層幹/祖細胞(hiendopcs,humaninducedendodermalprogenitorcells)克隆。用上述重編程方法獲得的內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)也屬於本發明。本發明還提供了一種對內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)進行傳代的方法，包括以下步驟：1)傳代前準備：在孔板中接種經絲裂黴素-c(10μg/ml)處理的成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)或提前約3個小時將fibronectin(fn，纖連蛋白)、cell-tak(ct，細胞組織粘附劑)膠鋪於孔板中，室溫晾乾；2)配製傳代培養基：advanceddmem/df12+awf(a83-010.5μm+wnt3a50ng/ml+bfgf10ng/ml)或advanceddmem/df12+a(a83-01，0.5μm)；3)手動挑取內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)克隆，並將其劃成小塊，比例約1:3-，將其置於fn+awf、ct+awf或feeder[滋養層細胞，經絲裂黴素-c(10μg/ml)處理的成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)]+a培養基中在37℃、5％co2培養箱中進行傳代培養得到傳代內胚層幹/祖細胞。以上獲得的內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)或傳代內胚層幹/祖細胞在向肝臟細胞、胰腺β細胞和腸細胞誘導分化中的應用也屬於本發明。本發明提供了一種可將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的方法。本發明可將人胃上皮細胞(hgecs)作為起始細胞，從人胃組織肌層分離培養獲取成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)來作為滋養層，用小分子化合物組合在滋養層細胞的支持下將人胃上皮細胞譜系重編程為內胚層幹/祖細胞，並可進一步進行傳代培養和擴增。利用本發明獲得的內胚層幹/祖細胞或其傳代細胞並結合使用相應的誘導分化體系，可獲取成熟的肝臟細胞、胰腺β細胞和腸細胞，期望給肝病、糖尿病以及腸道疾病的細胞治療提供理想的種子來源，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。附圖說明圖1為確定了起始細胞、初始小分子以及滋養層細胞後的本發明的技術路線圖；圖2為相差顯微鏡下培養4-5天的胃上皮細胞(hgecs)和十二指腸上皮細胞(hdecs)形態圖(標尺：100μm)；圖3為相差顯微鏡下傳代培養的胃肌成纖維細胞形態圖(標尺：100μm)；圖4為胃上皮細胞中胃特異性及內胚層祖細胞特異性蛋白表達圖；圖5為人胃上皮細胞(hgecs)向內胚層祖細胞(hiendopcs)重編程的動態過程細胞形態圖(標尺：100μm)；圖6為人十二指腸上皮細胞(hdecs)及其來源的內胚層祖細胞(hiendopcs)形態圖(標尺：100μm)；圖7為分別以人胃上皮細胞(hgecs)(a)或胃腸道肌成纖維細胞(gsemfs)(b)為起始細胞的重編程過程細胞形態圖(標尺：100μm)；圖8為克隆形態全景掃描圖，顯示第7天(a)和第15天(b)的不同克隆(用虛線勾畫大致輪廓)，c、d、e、f為代表性克隆的具體形態；圖9為克隆面積計算中不同大小克隆所佔格子示意圖(標尺：250μm)；圖10為小分子化合物(8m)與各種滋養層細胞、細胞外基質或條件培養基支持下的克隆形成效率柱狀圖(不同的支持條件下重編程的效率)；圖11為msc、mefs和agsemf-cm支持作用下的細胞形態圖(標尺：100μm)；圖12為8個小分子化合物(8m)逐一減去的克隆形成效率柱狀圖；圖13為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)4個小分子化合物逐一減去的克隆形成效率柱狀圖；圖14為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)4個小分子逐一減去的克隆形態圖(標尺：100μm)；圖15a為以sb431542為基礎並和其它三種小分子化合物組合下的克隆形成效率柱狀圖；圖15b為以a83-01為基礎並和其它三種小分子化合物組合下的克隆形成效率柱狀圖；圖16為以sb431542為基礎並和其它三種小分子化合物組合下的克隆形態圖；圖17為小分子化合物優化過程的流程圖；圖18為用螢光原位雜交(fish)進行起始細胞的初步定位染色圖(a:男性來源的hgecs重編程後的fish染色情況；b：女性來源的hgecs重編程後的fish染色情況)；圖19為胃竇部組織cd56(ncam)免疫螢光染色圖(標尺：50μm)；圖20為起始細胞人胃上皮細胞(hgecs)的ncam流式分選及相應亞群的重編程情況示意圖(線條勾畫的是不同克隆的大致輪廓)；圖21為誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)中內胚層祖細胞特異性蛋白的流式水平檢測圖；圖22為誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)中胃特異性及內胚層祖細胞特異性蛋白表達檢測染色圖；圖23為誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)中內胚層祖細胞標誌基因表達分析結果柱狀圖，(a)和胃特異性基因的表達分析結果(b)；圖24為dna甲基化晶片顯示重編程前後全基因組dna表觀遺傳的改變圖(a:hgecs與hiendopcs的聚類分析；b：hiendopcs比hgecs低甲基化基因的go分析)；圖25a為火山圖，顯示hiendopcs與hgecs相比，啟動子區域甲基化水平發生改變的基因數量；b為hiendopcs與hgecs在foxa2和gata4基因啟動子區域的甲基化水平比較圖；圖26為rna深度測序相關性分析圖，顯示hiedops與esc來源的de、pgt、pfg的關係；圖27為pca分析圖，顯示hgecs、hdecs、hgecs來源的hiendopcs、hdecs來源的hiendopcs、escs來源的de、gsemfs在全基因表達譜上的位置關係；圖28為hgecs與hiendopcs微觀形態圖，(標尺:2μm(a-d)，100nm(e))；圖29為hiendopcs在重編程過程中的動力學特徵圖，a為hiendopcs重編程過程中的時期劃分軸向圖，b為不同時期的增殖速率曲線圖，c為phaseⅱ和phaseⅲ期的細胞形態的動態變化圖；圖30為傳代後的hiendopcs在不同支持環境下的細胞形態圖(標尺：100μm)；圖31為hiendopcs在傳代過程中的細胞形態圖(標尺：200μm)；圖32為hiendopcs傳代次數及每代的細胞數量柱狀圖；圖33為hiendopcs向胰腺誘導分化結果，a為hiendopc-pans的三維形態學圖；b為hiendopc-pansdtz染色圖；c和d為hiendopc-pans胰腺特異性蛋白表達圖(標尺：50μm)；e為hiendopc-pans的胰腺特異性基因表達圖；f為hiendopc-pans的胰島素釋放反應圖；圖34為hiendopcs向腸道誘導分化結果，a為hiendopc-ints的形態學圖；b為hiendopc-ints腸特異性的基因表達圖；c為hiendopc-ints的腸特異性蛋白染色圖(標尺：50μm)；圖35為hiendopcs向肝臟的誘導分化結果，a為hiendopc-heps的肝特異性基因表達圖；b為hiendopc-heps的afp和ck18染色圖(標尺：50μm)；c為hiendopc-heps的alb和afp流式水平檢測圖；圖36為hiendopcs向甲狀腺(a)和肺(b)誘導分化的基因表達水平檢測柱狀圖。具體實施方式在確定了起始細胞、初始小分子以及滋養層細胞後，本發明的技術路線(如圖1所示)為：獲取人胃上皮細胞(hgecs)作為起始細胞，從人胃組織肌層分離培養獲取消化道肌成纖維細胞(agsemfs)來作為滋養層，篩選合適的小分子組合併在滋養層細胞的支持下將人胃上皮細胞譜系重編程為內胚層幹/祖細胞。首先，分離培養人胃來源的上皮細胞(hgecs)作為譜系重編程的起始細胞，通過初步篩選，確定八個小分子化合物組合：sb431542+vpa+pd0325901+rg108+bix01294+bayk8644+ps48+fbp，並在人胃來源的肌成纖維細胞(gsemfs)作為滋養層的條件下可以將人胃上皮細胞(hgecs)重編程為內胚層祖細胞(hiendopcs)樣的克隆。以能夠出現內胚層祖細胞樣克隆為標準，然後對重編程的體系—小分子化合物和滋養層細胞進行了優化，最終確定bix01294+bayk8644+rg108+sb431542(bbrs)為最優的小分子化合物組合，而且確定了能夠實現重編程的必需小分子化合物是sb431542。由於滋養層細胞—人胃肌成纖維細胞(gsemfs)的獲取最為便利，因此確立了重編程最優的體系是bbrs+gsemfs，在這樣的體系中重編程的效率為4％-6％；此外，本發明還證實了內胚層祖細胞(hiendopcs)來源於ncam陽性的hgecs，實現了起始細胞的精確定位。其次，還對誘導的內胚層祖細胞(hiendopcs)從內胚層特徵性的基因、蛋白表達水平、表觀遺傳水平、全基因組表達水平、細胞微觀形態水平及細胞增殖能力、內胚層分化潛能對誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)做了全方位鑑定。首先檢測了常見的內胚層祖細胞特徵性的轉錄因子foxa2、sox9、hnf1b、pdx1、gata4，其它幹/祖細胞特徵性蛋白包括cxcr4、epcam、lgr5、ck19以及胃上皮特異性的標誌mμc6、gastrin等在hiendopcs中的表達情況，發現與hgecs相比內胚層標誌性的基因在hiendopcs中明顯上調，而胃特異性的基因則不表達，初步證實了hgecs向內胚層祖細胞重編程成功。表觀遺傳分析也顯示重編程後細胞發生了顯著改變，具備了內胚層祖細胞的分子特徵。對hiendopcs的發育階段進行精確定位，深度測序的結果顯示hiendopcs處於hescs來源的原始消化管(pgt)和前腸後段(pfg)這兩個內胚層發育階段之間，且更接近pfg。此外，hiendopcs具有幹細胞微觀水平的特徵並能進行4-6次的傳代擴增。儘管與escs或ipscs相比，hiendopcs的擴增潛能有限，然而以106起始細胞為起點經過重編程和4-6代的擴增可以獲得約109的細胞，這樣的數量足以進行細胞治療且在有限的傳代次數內細胞的基因組相對穩定，更加安全，也更加有利於未來的細胞治療。由於發育過程中內胚層祖細胞具有向胰腺、肝臟、腸、肺和甲狀腺等內胚層器官進行分化的潛能，因此使用相應的誘導分化條件發現hiendopcs同樣具有形成功能性胰腺β細胞、肝細胞、腸道細胞、肺細胞和甲狀腺細胞的能力。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見：《molecμlarcloning:alaboratorymanμal》(sambrook，j.，rμssell，davidw.，molecμlarcloning:alaboratorymanμal，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質量/質量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助於理解本發明，但是本發明的保護範圍不限於下述的實施例。實施例1、小分子化合物誘導人胃上皮細胞向內胚層祖細胞轉換的體系建立本發明重編程的目的細胞是內胚層祖細胞，考慮到肝臟、胰腺、膽道、胃、腸等從發育的角度來看都來源於內胚層，與內胚層祖細胞發育同源，表觀遺傳相似，重編程障礙相對較小，確定其是良好的起始細胞類型。其次，臨床上胃大部切除術或胃癌切除術等消化道手術後，不可避免的會有部分正常的胃或十二指腸組織被遺棄，而且胃潰瘍或十二指腸潰瘍愈後胃鏡活檢隨診，也可獲得的正常的胃或十二指腸的組織，因此起始細胞的來源也是可行的。本發明建立胃上皮細胞和滋養層細胞的培養體系，然後使用選擇的四大類共八個小分子並且以消化道肌成纖維細胞做滋養層來進行向內胚層祖細胞的重編程。在這樣的條件下成功的在胃上皮或十二指腸上皮細胞中產生了內胚層幹/祖細胞樣的克隆。重編程成功後，進一步對這個體系進行了優化，找到了最優的重編程小分子組合和最少的小分子組合。最後對起始細胞進行了分群，明確了能夠重編程成功的起始細胞亞群。本發明將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的總體思路和策略如下：1、在起始細胞的選擇上，肝臟、胰腺、胃腸等內臟器官都來源於內胚層祖細胞，它們在發育上同源，因此與其它胚層來源的細胞相比，它們之間具有更近的親緣關係，更多的表觀遺傳相似性。此外，它們都是上皮組織類型細胞，在轉換的過程中不需要經歷met的障礙，因此在理論上它們之間的細胞類型轉換也就相對容易。此外，胃腸道組織細胞更新速度較快，大量細胞處於活躍增殖狀態，增殖快速的細胞或祖細胞更易被重編程。胃腸道(gi-tract)是連接內臟各個器官的通道，各種消化道手術都會有大量切除的正常組織被遺棄，同時胃十二指腸組織通過活檢也可獲得。因此以gi-tract來源的人胃上皮細胞(hgecs)為起始細胞向內胚層祖細胞進行重編程，在與以成纖維細胞為起始相比，具有表觀同源性的優勢，上皮源性的優勢，增殖祖細胞的優勢和也具有臨床操作的可行性。2、在小分子的選擇上，確定了四大類功能明確的，能夠正向調控重編程的小分子群，分別是：(1)信號通路抑制劑：tgf-β信號通路抑制劑sb431542(sb)或a83-01(a83)，sb或a83可以替代sox2，與oct4、klf4、c-myc組合就可產生ipscs，另一個是mapk/erk信號通路抑制劑pd0325901(pd)，pd與sb(或a83)組合可將重編程效率提高100多倍，而且大大縮短重編程時間；(2)表觀修飾劑：組蛋白去乙醯化酶抑制劑vpa，vpa甚至可以取代klf4、c-myc兩個轉錄因子，與oct4、sox2組合可以促進ipscs的生成，組蛋白甲基轉移酶抑制劑bix01294(bix)、dna甲基轉移酶抑制劑rg108(rg)都可明顯提高重編程效率；(3)鈣離子通道激動劑bayk8644(bay)，bay與bix的組合則可取代sox2與c-myc；(4)代謝通路調節劑：磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1激動劑ps48、磷酸果糖激酶激動劑fbp，有利於成熟細胞氧化磷酸化的能量代謝向幹細胞無氧糖酵解的途徑轉換，從而提高重編程效率。3、在滋養層細胞的選擇上，為了促進內胚層祖細胞的產生和維持，選擇了與內胚層器官緊密相關的消化道肌成纖維細胞作為滋養層細胞，這些細胞在發育的早期會通過旁分泌的作用影響內胚層器官的發生和支持內胚層祖細胞的擴增。一、胃上皮細胞的分離培養及表型鑑定材料與方法以下所列材料與方法源自實驗的原始記錄。在本發明實際應用中，可以使用商業來源的材料和符合工業應用的方法實施，不受所列實驗的限制。(一)實驗材料(1)實驗組織手術或者活檢來源的胃、十二指腸組織由中國人民解放軍總醫院和307醫院普外科提供，流產胎兒組織由解放軍總醫院提供，所有提供組織的患者均已知情並籤署知情同意書，組織標本使用經解放軍總醫院和307醫院倫理委員會同意。(2)實驗器材雷射共聚焦顯微鏡(zeiss)、恆溫水浴鍋(長風)、低溫離心機(eppendorf)、倒置相差顯微鏡(leica)、手術器械(手術刀柄、刀片、眼科直鑷、彎鑷、剪刀)、雷射共聚焦小皿(nest)。(3)主要試劑及配製1、kubotamedium(km)培養基的配製：一袋rpmi1640(gibco)粉末溶解於1l去離子水中，加入1×青-鏈黴素，10-9mzincsulfateheptahydrate(七水硫酸鋅，sigma)，0.54gnicotinamide(煙醯胺，sigma)，5mginsulin(胰島素，sigma)，10-6mhydrocortisone(氫化可的松，sigma)，2gnahco3(sigma)，5×10-5mbeta-mercaptoethanol(β巰基乙醇，sigma)，30nmselenium(硒，sigma)，游離脂肪酸(sigma)，10μg/mlhighdensitylipoprotein(高密度脂蛋白，sigma)，1gbovineserumalbumin(牛血清白蛋白，購自gibco)，5mgtransferrin(轉鐵蛋白，sigma)，2mmglutamax(穀氨醯胺，購自gibco)。2、無ca2+、mg2+pbs的配製：使用1l去離子水溶解0.24gkh2po4，8.0gnacl，0.2gkcl，1.44gna2hpo4，可根據配製的體積等比例添加試劑。配製完成後0.45μm濾膜過濾後高壓蒸汽滅菌或直接0.22濾膜過濾後使用。3、主要抗體：表1用於人胃上皮細胞(hgecs)免疫螢光檢測的第一抗體一抗公司貨號一抗種屬稀釋比cxcr4(c-x-c基序趨化因子受體4)abcamab77909兔200epcam(上皮細胞粘附分子)neomarkerms-181小鼠免疫球蛋白1200foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)r&daf2400山羊免疫球蛋白100sox9(性別決定區域y基因9)abcamab76997小鼠免疫球蛋白2a50ck19(細胞角蛋白19)abcamab7754小鼠免疫球蛋白2a200lgr5(富含重複亮氨酸g蛋白偶聯受體5)sigmahpa012530兔350gastrin(胃泌素,gast)santacruzsc-7783山羊50muc6(黏膜蛋白-6)abcamab49462小鼠免疫球蛋白150表2用於人胃上皮細胞(hgecs)免疫螢光檢測的第二抗體4、0.075mg/mlⅳ型膠原酶的配製：200mladvancedrpmi1640培養基(購自gibco)中加入20mgⅳ型膠原酶(sigma)和6mgdnasea。5、其它試劑和材料：tryple消化酶(購自invitrogen)、4％(v/v)多聚甲醛(購自sigma)、dnasea(invitrogen)、0.2％(v/v)tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚，購自sigma)、胎牛血清(fbs，gibco)、枸櫞酸鈉緩衝液(購自sigma)、dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，sigma)、免疫組織化學試劑盒(vectorlab)。(二)實驗方法及結果(1)獲取胃上皮細胞胃上皮細胞可直接購買獲得；也可用以下操作分離培養獲得胃竇、幽門部或十二指腸黏膜上皮細胞：1)、提前將配製好的ⅳ型膠原酶放置於室溫或37℃平衡，將pbs置於冰上預冷，準備1000×青-鏈黴素，75％(v/v)酒精消毒手術器械。2)、從醫院獲取新鮮的胃手術後胃竇、幽門或十二指腸組織標本，儘量半個小時內用冰盒運輸到實驗室。3)、在預冷的pbs中加入5×的青-鏈黴素並用其清洗獲取的組織標本4-5次，充分洗去殘餘血汙。4)、鈍性分離清洗後的胃組織黏膜層與肌層，同樣用含5×青-鏈黴素的冷pbs分別清洗黏膜層和肌層，而後進行不同的處理。5)、使用剪刀和手術刀結合將黏膜層剪碎或剁碎，加入適量的ⅳ型膠原酶(0.075mg/ml)37℃水浴消化，每2-3分鐘振蕩一次，8-10分鐘沉降一次分離物，每次冰上沉降2-3分鐘，然後滴管小心收集上清，餘下部分繼續加適量的酶消化。6)、重複步驟5，直至無明顯的大塊組織即終止。7)、在收集的上清中加入預冷pbs，4℃、1200rpm(轉/每分鐘)離心5分鐘，洗滌3-4遍，充分去除細胞中殘留的消化酶。8)、用含有8％(v/v)胎牛血清(fbs)和1×青-鏈黴素的km培養基以合適密度接種細胞，貼壁過夜，次日換為無血清的km培養基進行培養。9)、在培養的過程中每2-3天換液，大概培養4-5天即可開始重編程。結果：將從臨床獲取的胃或十二指腸組織進行分離可得到黏膜層和肌層，黏膜層用於分離胃或十二指腸上皮細胞，肌層則用於分離滋養層細胞—肌成纖維細胞。按照實驗步驟中胃或十二指腸上皮的組織分離方法，通常得到的是接近隱窩部的細胞。使用無血清的上皮細胞篩選培養基庫部塔(kubota’smedium)培養，人胃上皮細胞(hgecs)和十二指腸上皮細胞(hdecs)在培養中都呈現典型的舞蹈樣的上皮形態(如圖2所示)。經過觀察，大約第4-5天細胞的數量達到最多，此後細胞進入逐漸凋亡的狀態。因此，通常以培養到4-5天後的細胞，來作為向內胚層祖細胞重編程的起始細胞。而且經過對幾十例胃和十二指腸不同部位細胞分離培養的觀察和分析來看，發現胃竇、幽門或十二指腸來源的組織無論是在細胞貼附還是生長方面都最好，胃體部或胃底、賁門部組織則幾乎不能貼附或很難培養。又由於十二指腸組織來源相對較少，因此在後續的實驗中除非特別提及，都以胃竇部或胃幽門部組織作為來源，分離獲取胃上皮細胞來作為重編程的起始細胞。(2)肌成纖維細胞的獲得肌成纖維細胞可直接購買獲得；也可用以下貼壁法分離和培養胃腸道肌成纖維細胞：1)、對前述獲得的胃或十二指腸肌層使用手術刀片充分剁碎為小組織塊，越小越好，加入少量的含15％(v/v)胎牛血清(fbs)的高糖培養基或km培養基潤溼組織碎塊，使用1毫升小滴管將組織碎塊均勻塗抹於10cm培養皿中，倒置於37℃培養箱30分鐘。其餘基質細胞分離培養方法如上述。2)、貼附30分鐘後，沿培養皿邊緣加入基質細胞生長培養基，將細胞置於37℃、5％co2的培養箱中培養。3)、經過5-7天培養可見有梭形細胞從組織塊周圍爬出，2周後大量細胞爬出並生長，此時進行細胞傳代、凍存。這樣即可獲得胎兒胃的肌成纖維細胞(fgsemfs)、成人胃的肌成纖維細胞(agsemfs)、胎兒腸肌成纖維細胞(fisemfs)、胎兒橫隔基質細胞(fdcs)。凍存後的細胞可為以後重編程提供滋養層細胞。結果：將得到的胃或十二指腸肌層機械法剁碎成小塊使用組織貼壁法分離培養肌成纖維細胞(gsemfs)。組織貼附約4-7天，可以看到有梭狀的細胞從組織塊中爬出，10-14天可以進行傳代，傳代培養的肌成纖維細胞呈典型的長梭樣的成纖維細胞形態(如圖3所示)。(3)胃上皮細胞的免疫螢光檢測對人胃上皮細胞(hgecs)特性進行免疫螢光鑑定，包括以下操作(一抗、二抗分別如表1和表2所示)：1)、4％(v/v)多聚甲醛固定細胞10-15min，pbs清洗2遍。2)、0.2％(v/v)tritonx-100破膜10分鐘，pbs清洗一遍。3)、二抗種屬來源的血清封閉1小時，pbs清洗一遍。4)、相應一抗孵育4℃過夜，pbs清洗2-3遍。5)、相應二抗室溫避光孵育1小時，pbs清洗2-3遍。6)、dapi室溫避光孵育15分鐘。7)、雷射共聚焦螢光顯微鏡下觀察並攝像。結果：如圖4所示，免疫螢光染色發現人胃上皮細胞(hgecs)低表達內胚層祖細胞標誌ck19、foxa2、cxcr4、sox9、lgr5、epcam等，而高表達胃特徵性標誌muc6和gast。第一部分「胃上皮細胞的分離培養及表型鑑定」成功建立了胃竇或幽門部胃上皮細胞和肌成纖維細胞的分離培養體系，體外培養的人胃上皮細胞(hgecs)呈典型的上皮樣形態。由於隱窩部細胞通常較為原始(與胃成熟細胞類型相比)，可以進行一定程度的增殖。人胃上皮細胞(hgecs)高表達胃特異性標誌，低表達內胚層早期祖細胞標誌，與我們先前的推測一致，因其部分表達內胚層祖細胞的某些標誌，在向內胚層祖細胞的重編程過程中重編程障礙會相對較小，因此是向內胚層祖細胞進行轉換的良好起始細胞來源。但是人胃上皮細胞(hgecs)的胃上皮特徵性的標記在重編程的過程中則必須要丟失。解決了起始細胞的來源和培養問題，而且也初步明確了其特性，下一步將以其為起始細胞進行向內胚層祖細胞的重編程。二、小分子化合物和滋養層細胞誘導胃上皮細胞向內胚層祖細胞轉換材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞人胃上皮細胞(hgecs)和成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)在步驟一中製備並保存。(2)實驗器材倒置相差顯微鏡(leica)、顯微鏡格子線、低溫離心機(eppendorf)、12孔板。(3)主要試劑及配製1、基礎試劑advanceddmem/f-12培養基、advancedrpmi1640培養基、neaa(非必需胺基酸)、tryple消化酶、穀氨醯胺(glutamax)、dispase(離散酶)均購自gibco公司，青-鏈黴素和絲裂黴素-c(sigma)。2、小分子化合物表38個小分子化合物(8m)「使用濃度」是指各化合物以advanceddmem/f-12培養基為溶劑的濃度。3、8m重編程培養基配製配方：advanceddmem/f12+2mm穀氨醯胺(glutamax)+青-鏈黴素(100u/ml青黴素+0.1mg/ml鏈黴素)+sb43154(2μm)+vpa(0.5mm)+pd0325901(0.5μm)+rg108(0.04μm)+bix01294(0.5μm)+bayk8644(2μm)+ps48(5μm)+fbp(3.5mm)。該配方中各組分濃度均為其以advanceddmem/f-12培養基為溶劑的濃度。(二)實驗方法及結果(1)小分子化合物介導人胃上皮細胞(hgecs)或十二指腸上皮細胞(hdecs)向誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)轉換具體方法包括以下步驟：1、起始細胞的擴增：原代分離的人胃上皮細胞(hgecs)或十二指腸上皮細胞(hdecs)作為起始細胞，用kubta培養基(參照文獻進行配製，文獻來源kubota,h.,andreid,l.m.(2000).clonogenichepatoblasts,commonprecursorsforhepatocyticandbiliarylineages,arelackingclassicalmajorhistocompatibilitycomplexclassiantigen.proc.natl.acad.sci.usa97,12132–12137)在37℃、5％co2培養箱條件下培養4-5天，將起始細胞進行擴增。2、滋養層細胞的準備：用絲裂黴素-c(10μg/ml，目的是使滋養層細胞失去有絲分裂的能力))處理滋養層細胞的成人胃肌成纖維細胞(agsemfs，該細胞由胃組織基質層分離獲得，培養擴增後大量凍存，需要時提前復甦備用)2-3小時，pbs洗3-4遍，tryple酶消化細胞，而後洗滌細胞；3、當待人胃上皮細胞(hgecs)或十二指腸上皮細胞(hdecs)培養至第5-6天時，將已處理的胃肌成纖維細胞以適宜密度(密度一般為1～3×105每平方釐米)添加於培養中的人胃上皮細胞(hgecs)或十二指腸上皮細胞(hdecs)中，在37℃、5％co2培養箱中過夜(12-16小時)；4、重編程培養：在添加了胃肌成纖維細胞的第二天更換為8m重編程培養基，每2-3天換一次培養基，連續觀察，一般培養1周或2周以上(7-15天)，得到誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)。結果：(1.1)人胃上皮細胞(hgecs)向誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)的轉換利用8個小分子化合物(8m，如表3所示)，在8m重編程培養基和分離培養的胃腸道肌成纖維細胞(gsemfs)作為滋養層細胞的培養條件下，人胃上皮細胞(hgecs)的形態不斷發生明顯變化，由開始的形態較大的舞蹈樣或多角樣上皮，在第7天開始出現邊界較清晰的小的細胞克隆，在第15天左右，人胃上皮細胞(hgecs)已經被重編程為邊界清晰，細胞小而緊密，形態較為均一，核質比較大的典型內胚層幹/祖細胞樣克隆(g-hiendopcs)，如圖5所示(圖5中下排圖片為上排圖片方框中的放大部分)。(1.2)人十二指腸上皮細胞(hdecs)向內胚層祖細胞(hiendopcs)的轉換同樣，以人十二指腸上皮細胞(hdecs)為起始，在8m重編程培養基和分離培養的胃腸道肌成纖維細胞(gsemfs)作為滋養層細胞的作用下，經過15天的誘導也可形成典型的內胚層幹/祖細胞克隆(d-hiendopcs)(如圖6所示，左幅為十二指腸上皮細胞(hdecs)，右幅為十二指腸上皮細胞重編程產生的內胚層幹/祖細胞(d-hiendopcs)，形態與g-hiendopcs(圖5)幾乎類似。由於十二指腸組織來源有限，通常以人胃上皮細胞(hgecs)作為重編程的起始細胞。(1.3)僅以人胃上皮細胞(hgecs)或胃腸道肌成纖維細胞(gsemfs)為起始細胞向內胚層祖細胞(hiendopcs)的轉換不使用小分子化合物，不能形成內胚層幹/祖細胞樣克隆，但是分別僅以人胃上皮細胞(hgecs)或胃腸道肌成纖維細胞(gsemfs)為起始細胞，在8m重編程培養基中培養15天也均不能形成內胚層幹/祖細胞樣克隆(如圖7所示)，說明小分子化合物(8m)、人胃上皮細胞(hgecs)和胃腸道肌成纖維細胞(gsemfs)的組合是內胚層祖細胞(hiendopcs)形成不可或缺的因素。(2)克隆形成效率的計算具體方法包括以下步驟：1、計算克隆的總數。2、使用顯微鏡格子線計算不同克隆的面積大小：每個顯微鏡微格的面積為0.0625mm2，用克隆所佔的格子數乘以0.0625mm2則是每個克隆的面積。3、綜合克隆的數目和克隆的面積大小來評價重編程的效率。結果：在前述的觀察中已經發現在重編程第7天時已經有小的細胞克隆開始出現，孔板全景掃描顯示這樣的小克隆界限清晰，數量非常多(圖8之a)，在形態上已經接近經典的內胚層幹/祖細胞克隆形態(圖8之c和d)。由於在重編程第15天產生的克隆形態最典型(圖8之e和f)，通常在這個時間點計算克隆形成效率，但第7天至15天克隆的生長速度較快，許多克隆在計算的時間節點融合在一起形成大的克隆(圖8之b)，因此克隆的數目在計算時較少，但是總的面積在增大，為了更加客觀的反應重編程效果，本實驗綜合克隆的總數目以及不同面積下的克隆數目和克隆面積來作為重編程效率計算方法。使用顯微鏡格子線計算不同克隆的面積大小：每個顯微鏡微格的面積為0.0625mm2，用克隆所佔的格子數乘以0.0625mm2則是每個克隆的面積，不同大小的克隆面積計算方法如圖9所示，計算結果參見表4。表4:不同大小的克隆面積計算結果方格數面積a120.750b0.10.006c60.375第二部分在初步選擇的八個小分子(8m)和成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)作為滋養層的條件下成功的將人胃上皮細胞(hgecs)重編程到內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)的階段，由於在重編程的過程中發生的最初的明顯改變是細胞形態，因此將幹/祖細胞克隆的出現作為重編程成功的初始判斷。使用相同的方法同樣可以將人十二指腸上皮細胞(hdecs)重編程為內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)。在重編程過程中，小分子化合物和滋養層細胞是必需的要素。儘管初步實現了我們的設想，但仍然需要找到最佳的重編程方案，儘可能的提高重編程效率，減少小分子化合物數目，而且找到關鍵的小分子將會對解析重編程的機制有著十分重要的提示作用。三、小分子化合物和滋養層細胞重編程體系的優化材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞人胃上皮細胞(hgecs)、胎兒胃肌成纖維細胞(fgsemfs)、成人胃的肌成纖維細胞(agsemfs)、胎兒腸肌成纖維細胞(fisemfs)、胎兒橫隔基質細胞(fdcs)在步驟一中製備；間充質幹細胞(mscs)、小鼠胚胎成纖維細胞(mefs)、成人皮膚成纖維細胞(hffs)來源於包皮組織，由本實驗室分離培養並保存。(2)實驗器材倒置相差顯微鏡(leica)、顯微鏡格子線、12孔板。(3)主要試劑1、基礎試劑：advanceddmem/f-12培養基、advancedrpmi1640培養基、neaa(非必須胺基酸)、穀氨醯胺(glutamax)均購自gibco公司；青-鏈黴素、絲裂黴素-c購自sigma公司；tryple、dispase消化酶購自invitrogen公司；matrigel膠購自bd公司；gelatin購自sigma公司。2、小分子化合物組合(8m)：種類和使用濃度與第二部分相同(見表3)。(二)實驗方法及結果(1)胎兒腸肌成纖維細胞(fisemfs)或成人胃的肌成纖維細胞(agsemfs)條件培養基製備：用濃度10μg/ml的絲裂黴素c處理fisemfs細胞或agsemfs細胞2-3小時，pbs洗3-4遍，然後加上advanced(先進)dmem/f-12培養基培養，每天收集培養基，0.22μm濾器過濾，保存於-80℃。(2)不同的滋養層細胞支持人胃上皮細胞(hgecs)重編程為內胚層祖細胞(hiendopcs)具體方法包括以下步驟：1)、起始細胞人胃上皮細胞(hgecs)的處理與步驟二中的方法相同。2)、各種滋養層細胞的準備與第二部分中的方法相同。3)、重編程方法與第二部分中的方法相同。4)、在重編程第15天計算小分子化合物(8m)與各種滋養層細胞、細胞外基質或條件培養基下支持下的克隆形成效率，進而找到合適的滋養層細胞。結果：在前述的實驗中使用8個小分子化合物(8m)和成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)實現了人胃上皮細胞(hgecs)向內胚層祖細胞(hiendopcs)的轉換。接下來確定更佳的滋養層細胞或實現無滋養層細胞的重編程。使用了多種消化道來源的基質細胞包括胎兒胃肌成纖維細胞(fgsemfs)、胎兒腸肌成纖維細胞(fisemfs)、胎兒橫隔基質細胞(fdcs)以及其它常用的滋養層細胞如間充質幹細胞(mscs)、小鼠胚胎成纖維細胞(mefs)、成人皮膚成纖維細胞(hffs)等，還測試了多種細胞外基質如matrigel膠、明膠等，以及胎兒腸肌成纖維細胞(fisemfs)來源的和成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)來源的條件培養基，分別來進行重編程的比較。在8m重編程培養基條件下，發現fisemfs、fgsemfs、agsemfs等消化道基質細胞和橫隔基質細胞都可以成功的支持hgecs產生hiendopcs，其中又以胎兒腸肌成纖維細胞(fisemfs)的重編程效率最高，其它的支持介質如mefs、hffs、mscs、matrigel、明膠以及條件培養基等則很少或幾乎不能支持重編程(如圖10所示)。以mscs或mefs為支持細胞會產生少量的不典型的上皮樣細胞克隆。在成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)來源的條件培養基(agsemfs-cm)中隨著培養時間的延長，細胞在不斷凋亡(如圖11所示，圖中右上角或左上角圖片為小方框中的放大圖)。由於胎兒組織來源有限，而臨床上成人的胃手術標本最容易獲取，可以得到足量的成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)，而且agsemfs也可以維持較高的重編程效率，因此agsemfs是一類良好的重編程滋養層細胞，後續的實驗中將以其為滋養層細胞來支持重編程。(3)小分子組合的優化—重編程必要小分子的篩選1)、以第二部分篩選的滋養層細胞為支持細胞，在前述的8個小分子化合物(8m)培養條件的基礎上逐個遞減小分子，首先篩選到不可或缺的小分子。2)、再以第1)步篩選的小分子化合物組合為基礎，依次逐個遞減最終找到最佳(重編程效率最高)的小分子化合物組合和最少(保證克隆能夠形成)的小分子化合物組合。(4)統計學分析所有數據均來自於3次及以上獨立重複試驗，除特殊說明外，數據均描述為平均值±標準差。兩組數據間統計學分析用spss軟體進行學生雙尾t檢驗，p<0.05時兩組之間的差異被認為具有統計學意義。結果：在步驟(2)中確定了最合理的滋養層細胞—成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)，以其作為支持細胞，來進行小分子組合的優化。以8個小分子化合物的組合(8m)為基礎然後逐個遞減小分子，當減去pd0325901、ps48、fbp後克隆的形成效率有所提高，說明這些小分子化合物在重編程中起到一定的抑制作用，應該捨去；當減去vpa後，克隆形成的效率沒有明顯變化，表明vpa可有可無，基於簡單化原則，應該去掉；但當減去bix01294、bayk8644、rg108時克隆的形成效率明顯減少，尤其是當sb431542減去後克隆不能產成(如圖12所示)，表明這四個小分子是必要的。在前述必須的4個小分子化合物bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(簡稱bbrs組合)的組合上，誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)同樣可以產生而且效率比8個小分子化合物(8m)條件下更高。然後再以bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(bbrs組合)為基礎再進行優化，當去除bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)任何一個小分子，克隆的形成效率都會明顯下降(如圖13所示)，但克隆的形態與bbrs組沒有明顯差異，當減去sb431542(sb)後則沒有克隆形成(如圖14所示)。因此確定了重編程最佳的組合是bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(bbrs)，在bbrs組合條件下重編程的效率約為4％-6％(如圖13所示)。由於sb431542的作用最為關鍵，因此以sb431542為基礎，再與另外三個小分子(bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg))的任意一個進行組合，發現sb431542是能夠保證克隆形成的最少小分子組合，儘管效率不及最優組合bbrs(如圖15a所示)，但形態都無明顯差異(如圖16所示)。sb431542不可或缺的作用對重編程過程中小分子化合物的作用機制有重要的提示作用。(5)重編程必要小分子化合物的優化在證實了重編程體系中sb431542(sb)是最少的能夠保證重編程成功的小分子化合物後，由於sb431542是tgf-β信號通路抑制劑，發明人嘗試使用另一種tgf-β信號通路抑制劑a83-01(a83)替代sb重複小分子化合物組合的優化實驗，結果a83(使用濃度0.5μm)無論是單獨作用還是與其他小分子組合(簡稱bbra組合)都可以產生和sb類似甚至更好的重編程作用。結果見圖15b，其中bbr分別代表另外三個小分子bix01294(b)、bayk8644(b)、rg108(r)。第三部分通過對滋養層細胞的篩選，確定了多種消化道肌成纖維細胞都可以支持人胃上皮細胞(hgecs)向內胚層祖細胞(hiendopcs)的轉換，尤其是胎兒來源的基質細胞支持作用更強，提示與消化道相關的滋養層細胞對於內胚層祖細胞重編程的獨特支持作用。考慮到細胞來源的充足情況，確定了成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)為滋養層細胞。在agsemfs為支持細胞的基礎上，通過3輪小分子的優化過程篩選到了最佳的重編程小分子組合bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(bbrs)或bix01294、bayk8644、rg108、a83-01(bbra)以及必要小分子sb431542或a83-01(a83)，其篩選過程如圖17所示。後面實施例3中，發明人將以bbrs+agsemfs為例作為重編程條件，對人胃上皮細胞(hgecs)向內胚層祖細胞(hiendopcs)重編程做詳細描述。四、重編程起始細胞的精確定位材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞、組織人胃上皮細胞(hgecs)、成人胃的肌成纖維細胞(agsemfs)、成人胃竇部組織(解放軍總醫院提供)。(2)實驗器材流式細胞分析儀(bd)，雷射共聚焦顯微鏡(zeiss)，倒置相差顯微鏡(leica)。(3)主要試劑基礎試劑：advanceddmem/f-12培養基、neaa(非必須胺基酸)、穀氨醯胺(glutamax)均購自gibco公司；青-鏈黴素、accutase、絲裂黴素-c均購自sigma公司；tryple消化酶購自invitrogen公司。小分子化合物：sb431542、bix01294、rg108、bayk8644均購自stemgent公司。抗體：cd56-pe(ebioscience)、兔抗人cd56(ncam)(abcam)、鼠抗人igg1muc5ac(abcam)；alexa647goatanti-mouseigg2b(γ2b)、alexa568goatanti-mouseigg1(γ1)均購自invitrogen公司。(二)實驗方法及結果(1)螢光原位雜交(fish)—起始細胞的初步定位具體方法包括以下步驟：1)、將男性來源的胃上皮細胞接種到女性來源的滋養層細胞上進行重編程或者反之。2)、重編程成功後對原孔的細胞用甲醇和冰醋酸的混合物(3:1)固定20分鐘，送公司進行x和y染色體的原位雜交。3)、處理完後的細胞在共聚焦顯微鏡下觀察性別染色體分別在hiendopcs和滋養層細胞上的染色情況。結果：由於在重編程體系中涉及到兩種細胞類型，起始細胞—人胃上皮細胞(hgecs)和滋養層細胞—成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)，前述已經證實它們單獨都不能被重編程為誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)，只有兩者組合併在bbrs重編程培養基的培養下經重編程才能成功。為了進一步證實hiendopcs確實來源於胃上皮細胞而不是滋養層細胞，進行了性別錯配結合螢光原位雜交(fish)的實驗：使用男性來源的hgecs作為起始細胞，以女性來源的胃腸道肌成纖維細胞(agsemfs)為滋養層細胞進行重編程，螢光原位雜交(fish)的結果顯示，重編程得到的hiendopcsx和y染色體都是陽性，表明是確實是男性來源，而滋養層細胞則僅是x染色體陽性表明是女性來源(圖18a)；而當以女性來源的hgecs作為起始細胞，以男性來源的胃腸道肌成纖維細胞(agsemfs)為滋養層細胞進行重編程，螢光原位雜交(fish)的結果則顯示hiendopcs僅x染色陽性，表明是女性來源，而滋養層細胞x、y染色體均陽性表明是男性來源(圖18b)。本實驗充分證明了hiendopcs起源於胃上皮細胞而非滋養層細胞。(2)起始細胞人胃上皮細胞(hgecs)表面標誌的確定—cd56標記的流式分選、接種和重編程具體方法包括以下步驟：1)、用accutase(細胞消化液)將人胃上皮細胞(hgecs)消化成單細胞，1000rpm離心5min，棄上清。2)、用pbs洗1遍。3)、用pbs重懸並加入適量cd56-pe，對照組加pe(pe，一種螢光標記染料)同型對照抗體。4)、置於4℃搖床45min。5)、用pbs洗3遍。6)、用適量pbs重懸。7)、用流式細胞儀進行分析並篩選，分別保留cd56陽性細胞和陰性細胞(全程注意無菌)。8)、將cd56陽性和陰性的細胞以同樣的數量接種於提前用絲裂黴素c處理好的成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)上，細胞貼附過夜(12-16小時)後更換為bbrs重編程培養基，進行重編程。對胃竇部組織cd56(ncam，神經細胞粘附分子，是表達於細胞膜上的一種表面蛋白)免疫螢光染色，細胞免疫螢光染色方法同第一部分。結果：通過fish實驗明確證實了起始細胞來源於胃上皮細胞而非滋養層細胞。由於胃上皮細胞屬於原代細胞，細胞類型較為混雜，為了進一步明確起始細胞中哪一類亞群發生了向hiendopcs的轉換，需要對起始細胞進行細分。首先需要明確hgecs的表面標記，由於分離的hgecs主要來源於胃竇部的隱窩，有研究報導ncam是表達於多種內胚層來源組織的一種表面標誌尤其是表達於較原始的細胞上，因此對胃竇部組織進行ncam原位染色，發現ncam(cd56)主要在深部胃組織(即隱窩部分)中有強弱不同程度的表達(如圖19左幅紅色螢光所示),淺部胃組織幾乎不表達，淺部組織主要表達muc5ac(如圖19中間幅綠色螢光所示，圖19右幅為顯示ncam染色和muc5ac染色的合成圖)，因此認為ncam是可以用於起始細胞分群的可靠標誌。以ncam作為分選標記對培養的hgecs進行流式分類，分為ncam陽性和ncam陰性的兩群細胞。然後以ncam陽性和陰性的細胞為起始細胞分別進行重編程。結果顯示ncam陽性的起始細胞能夠重編程成功，而陰性的細胞幾乎不能(如圖20所示)。第四部分通過性別錯配實驗證實起始細胞來源於胃上皮細胞而非滋養層細胞。通過對起始細胞進行細分類，進一步證實了是ncam陽性而非ncam陰性的胃上皮細胞在重編程的過程中發生了細胞類型轉換，從而實現了對起始細胞的精確定位。實施例2、誘導內胚層祖細胞的表型鑑定及分化潛能內胚層祖細胞被認為是肝、胰、腸，胃、肺、甲狀腺等內臟器官發育的起始，而且具有增殖能力，因此是獲取功能性肝細胞、胰腺細胞、腸細胞、肺和甲狀腺細胞的良好種子細胞。之前有多項以胚胎幹細胞(embryonicstemcells)(escs)或誘導多能性幹細胞(inducedpluripotentstemcells)(ipscs)為起始獲取內胚層祖細胞的研究，為本實施例中鑑定重編程獲得的內胚層祖細胞奠定了良好的基礎。在實施例1中我們使用bbrs和成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)的組合成功的在人胃上皮細胞(hgecs)中產生了內胚層幹/祖細胞樣的克隆(hiendopcs)。然而這只是初步的形態改變，還要證實其內胚層祖細胞屬性，使用pcr和免疫蛋白染色的方法鑑定誘導內胚層幹/祖細胞(hiendopcs)特徵性基因表達，基因晶片檢測其全基因組表達，甲基化晶片進行表觀遺傳分析，還測試了其增殖特性，使用電鏡觀察其微觀特性，採用不同的誘導分化體系對其向肝臟、胰腺、腸道、肺和甲狀腺分化的潛能進行了鑑定，來證實通過譜系重編程確實獲得了內胚層祖細胞樣的細胞(hiendopcs)並且挖掘hiendopcs細胞的特有屬性。一、誘導內胚層祖細胞標誌性基因的表達材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)、人胃上皮細胞(hgecs)、誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)、h9人胚胎幹細胞(escs)購自wicell公司。(2)實驗器材實時螢光定量pcr儀(bio-rad)、普通pcr儀(eppendorf)、倒置相差顯微鏡(leica)、實時定量96孔板及封閉膜(bio-rad)、12孔板、雷射共聚焦螢光顯微鏡(zeiss)、細胞免疫共聚焦小皿(nest)。(3)主要試劑抗體同實施例1第一部分、免疫組化試劑盒(vectorlab)、ra和ldn193189均購自sigma公司；a83-01購自stemgent公司；b-fgf、wnt3a、activina、fgf10購自r&d公司。(4)引物序列表5引物序列(二)實驗方法及結果(1)誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)的特徵性蛋白表達分析蛋白免疫螢光染色方法同實施例1。(2)誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)中特異性基因的表達分析提取重編程克隆的rna、反轉錄及實時螢光定量pcr，具體方法包括以下步驟：1)、手動挑取重編程產生的細胞克隆，儘量避免滋養層細胞的混入，然後用rna提取試劑盒(購自qiagen)將挑取的細胞按說明書的要求加入適量裂解液bufferrlt,充分裂解細胞，並繼續按下述步驟來提取rna：2)、加入等體積的70％(v/v)乙醇到裂解液裡，用移液槍吹打混勻。3)、將混勻液包括沉澱加入到spincolumn(離心柱，購自qiagen)並置於2ml收集管中，12000rpm離心30s，棄掉濾液。4)、加入700μl的bufferrw1(rna提取試劑盒提供，購自qiagen)到spincolumn中，12000rpm離心30s，棄掉濾液。5)、加入500μlbufferrpe(rna提取試劑盒提供，購自qiagen)到spincolumn中，12000rpm離心30s，棄掉濾液。6)、加入500μlbufferrpe到spincolumn中，12000rpm離心2min，棄掉濾液，然後再空離1min。7)、將spincolumn移至新的1.5ml收集管中，加入30μlrneasy-freewater(無核糖核酸酶水)到spincolumn膜的中央，12000rpm離心1min，棄去spincolumn，收集管內即為提取的rna溶液。8)、使用分光光度計測定洗脫的rna樣品濃度。9)、按1μg的rna總量吸取相應體積的rna，並加入rna-freewater(無核糖核酸酶水)至16μl，65℃加熱5min，然後快速將離心管轉移到冰上冰浴2分鐘。10)、冰浴結束後加入4μlrna反轉錄試劑盒中的5×rt反轉錄試劑，使用普通pcr儀反轉錄程序為：37℃15分鐘，50℃5分鐘，98℃5分鐘，4℃終止。11)、按需求吸取反轉錄獲取的cdna、三蒸水、sybr，提前於96孔板中加入檢測引物，體系(具體為：cdna加水總共9μl，sybr10μl，引物1μl)配製完成後，封閉膜封閉孔板，放入實時螢光定量pcr儀中，程序：95℃3分鐘，95℃10秒，60℃35秒，65℃5秒，95℃5秒，總共循環45次。(3)胚胎幹細胞(escs)向定性內胚層(de)定向誘導分化提前將生長狀態良好的人胚胎幹細胞h9以適宜密度接種接種於matrigel膠包被的孔板裡，次日更換培養基為de誘導培養基：advancedrpmi1640+1％(w/v)b27(無血清神經細胞添加劑)+activina(激活素a，100ng/ml)+chir99021(3μm，購自stemgent)作用1天，第2天和第3天更換培養基為：advancedrpmi1640+1％b27+activina(100ng/ml)。(4)胚胎幹細胞(escs)向原始消化管(pgt)定向誘導分化向定性內胚層(de)誘導後將培養基更換為pgt誘導培養基：advanced(中文名稱：先進)rpmi1640+2％(v/v)fbs+50ng/mlfgf10(成纖維生長因子10)+cyclopamine(環巴胺，0.25μm)，作用3天即可得到pgt。(5)胚胎幹細胞(escs)向前腸後段(pfg)定向誘導分化向定性內胚層(de)誘導後將培養基更換為pfg誘導培養基：advancedrpmi1640+ra(維甲酸，2μm)+ldn193189(0.25μm，購自sigma)，作用3天即可得到pfg。(三)統計學分析所有數據均來自於三次及以上獨立重複試驗，除特殊說明外，數據均描述為平均值±標準差。兩組數據間統計學分析用spss軟體進行學生雙尾t檢驗，p<0.05時兩組數據之間的差異被認為具有統計學意義。結果：(1)誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)的特徵性蛋白表達分析對重編程後的克隆進行內胚層特異性蛋白的流式分析發現，hiendopcs均一性高表達foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)、sox9(性別決定區域y基因9)、sox17(性別決定區域y基因17)、lgr5(富含重複亮氨酸g蛋白偶聯受體5)、epcam(上皮細胞粘附分子)，如圖21所示(isotype為同種型)。對hiendopcs進行免疫螢光染色發現，如圖22所示，hiendopcs不再表達胃特異性的標誌muc6(黏膜蛋白-6)和gast(胃泌激素)，失去了胃的屬性，而開始明顯表達內胚層幹/祖細胞特異性的轉錄因子foxa2(紅色螢光，表達量96±2.6％)、sox9(紅色螢光，表達量97±1.18％)和其它內胚層幹/祖細胞相關的標誌如cxcr4(綠色螢光，表達量98±0.56％)、epcam(紅色螢光，表達量97±2.7％)、lgr5(綠色螢光，表達量92±4.3％)、ck19(綠色螢光，表達量91±4.2％)。流式水平的檢測與免疫蛋白染色相一致，更加印證了hiendopcs的內胚層祖細胞特徵。(2)誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)中特異性基因的表達分析轉錄水平的結果也顯示與起始細胞人胃上皮細胞(hgecs)相比，內胚層祖細胞(hiendopcs)中內胚層早期發育相關的基因foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)、sox9(性別決定區域y基因9)、gata4(gata結合蛋白4)、hnf1b(肝細胞核因子同源框蛋白b)、pdx1(胰十二指腸同源異型盒基因1)、onecut2(一切除域蛋白家族2)、hoxa3(同源框蛋白a3)明顯上調，甚至與胚胎幹細胞(escs)來源的內胚層早期發育階段-定性內胚層(de)、原始消化管(pgt)、前腸後段(pfg)中早期內胚層基因的表達可比，尤其與pfg的表達模式最為相似(圖23的a幅，圖23a中柱群從左至右依序為hecs、de、pgt、pfg、hiendopcs,p1、hiendopcs,p4和hgecs)。而且hiendopcs不再表達胃特異性標誌muc6、pgc、gif和gast(圖23的b幅，圖23b中柱群從左至右依序為hgecs、hiendopcs和人胃組織)。小結：起始細胞人胃上皮細胞(hgecs)重編程後得到的誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)失去了胃特徵性的標誌如muc6、gif、pgc、gast等，而開始高表達內胚層早期祖細胞標誌性基因如轉錄因子foxa2、sox9、hnf1b、gata4、pdx1、hoxa3和其它內胚層祖細胞的標誌如cxcr4、ck19、lgr5、epcam。轉錄水平和蛋白表達水平都顯示了hiendopcs的內胚層祖細胞特徵。然而，想要全面明確hiendopcs分子特性、發育階段特徵和時空定位，還需對其進行全基因表達或表觀遺傳表達譜的分析。二、誘導內胚層祖細胞表觀遺傳分析和發育階段定位材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)、人胃上皮細胞(hgecs)、十二指腸上皮細胞(hdecs)、誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)、定性內胚層(de)、原始消化管(pgt)、前腸後段(pfg)。(2)實驗器材普通pcr儀(eppendorf)。(3)主要試劑illuminatotalprepkit(伊魯米娜完全預備試劑盒，ambion)、sentrixchiparray(聖翠科斯晶片陣列，humanht-12)、qiaampdnamicrokit(微量dna提取試劑盒，qiagen)、ezdnamethylation-goldkit(脫氧核糖核酸甲基化金試劑盒，zymoresearch)。(二)實驗方法及結果(1)hgecs、hiendopcs、pgt、pfg的rna提取、反轉錄方法同本實施例步驟一。(2)深度測序處理及分析(中科院北京基因組所協作完成)提取的hgecs、hiendopcs、pgt、pfgrna先擴增，按照illuminatotalprep試劑盒提供的步驟從總rna中產生生物醯化的crna，然後使用sentrixchiparray對crna進行雜交，雜交後的處理按照illumina公司提供的方法，使用illuminabeadstudio軟體對數據進行處理，原始數據上傳至geneexpressionomnibusdatabase(accessionnumbergse69706)。(3)dna甲基化處理及分析(中科院北京基因組所協作完成)首先進行dna文庫構建、上機測序和數據分析，收集來自兩個不同標本的hgecs和相應的兩個hiendopcs單克隆，用qiaampdnamicrokit提取基因組dna，用ezdnamethylation-goldkit(zymoresearch，貨號d5005)進行亞硫酸轉化，然後用高通量測序平臺hiseq2500(illumina)進行測序。原始數據提交至geneexpressionomnibusdatabase(accessionnumber：gse69706)。結果：(1)誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)的全基因組dna表觀遺傳分析步驟一對hiendopcs的鑑定局限在內胚層幹/祖細胞的某些特徵性的標記上，為了證實hiendopcs與hgecs確實是兩類不同的細胞，我們又使用全基因組dna甲基化晶片檢測來對hiendopcs與hgecs從表觀遺傳修飾角度進行分析。聚類分析結果顯示hiendopcs與hgecs擁有不同的表觀模式(圖24的a幅)，明確證實了重編程後細胞發生了重大改變。geneontology(go)分析顯示，與hgecs相比，hiendopcs中低甲基化狀態的基因，也就是處於活躍狀態的基因分類主要與胚胎發育或幹細胞發育相關(圖24的b幅)。這正與hiendopcs的內胚層早期屬性和幹/祖細胞屬性相一致。(2)誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)中的特徵性基因的啟動子區表觀修飾甲基化分析顯示，與hgecs相比，在hiendopcs中啟動子區域甲基化發生上調和下調的基因分別有519和857個(圖25之a)，其中內胚層特異性的轉錄因子foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)和gata4(gata結合蛋白4)的啟動子區域甲基化水平在hiendopcs中明顯降低(圖25之b)，說明foxa2和gata4的基因表達處於轉錄激活狀態，這與hiendopcs中foxa2和gata4基因高表達相一致。(3)誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)的發育階段定位在從多個水平證實了hiendopcs的內胚層幹/祖細胞的特徵後，還需要對hiendopcs所處的發育階段進行定位以進一步明確其特徵。由於hiendopcs自然狀態下的陽性對照難以得到，因此以較為公認的胚胎幹細胞(escs)來源的按照發育過程誘導的定性內胚層(de)、原始消化管(pgt)、前腸後段(pfg)等早期內胚層階段作為陽性對照來與重編程獲得的hiendopcs進行全基因組表達譜的比較，rna深度測序顯示hiendopcs處於pgt與pfg之間且更接近於pfg(圖26)。此外，pca主成分分析顯示胃上皮細胞來源的hiendopcs與十二指腸上皮細胞來源的hiendopcs在全基因表達譜上非常相似(pca主成分分析是指將多個變量通過線性變換以選出較少個數重要變量的一種多元統計分析方法)，這與前面發現的它們在細胞形態上極其類似相一致，並且都與它們的起始細胞不同，也與escs來源的定性內胚層(de)、滋養層細胞(gsemfs)明顯不同(圖27)。小結：全基因組dna甲基化水平分析進一步證實了hgecs與hiendopcs明顯的不同，重編程後hiendopcs獲得了內胚層幹/祖細胞的分子特徵，因此hgecs向hiendopcs的轉換確實是重編程的過程。而且rna深度測序明確了hiendopcs在發育階段上處於pgt和pfg之間更接近於pfg，因此實現了hiendopcs的時空定位。三、誘導內胚層祖細胞的微觀特徵材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞人胃上皮細胞(hgecs)、誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)。(2)實驗器材h7650transmissionelectronmicroscope(透射電鏡，hitachi)、h7650electronmicroscopy(電子顯微鏡)、amtxr16mccddigitalcamera(數位相機電耦合器件，amt)、amtcaptureenginesoftwareversion600.259(捕獲工程軟體)、可拆卸96孔板(corning)。(3)主要試劑polybed812epoxyresin(多床環氧樹脂)購自polysciences,inc.,warrington,pa，reynolds』leadcitrate(雷若茲檸檬酸鉛，由軍事醫學科學院國家儀器分析測試中心提供)、aqueousuranylacetate(含水乙酸雙氧鈾，由軍事醫學科學院國家儀器分析測試中心提供)。(二)實驗方法及結果具體方法包括以下步驟：1、hiendopcs和hgecs種植於可拆卸的96孔板中。2、pbs清洗，使用3％glutaraldehyde(戊二醛)與0.1msodiumcacodylate(二甲胂酸鈉，購自sigma)混合、ph7.4的固定液過夜(12-16小時)固定細胞。3、用sodiumcacodylatebuffer(二甲胂酸鈉，購自sigma)清洗3次後，再用1％osmiumtetroxide(四氧化鋨，購自sigma)與0.1sodiumcacodylatebuffer(二甲胂酸鈉緩衝液，購自sigma)混合再固定1小時。4、去離子水清洗後，脫水再埋入polybed812epoxyresin(多床環氧樹脂)中。5、將組織切成70nm的切片，用4％aqueousuranylacetate(含水乙酸雙氧鈾)由軍事醫學科學院國家儀器分析測試中心提供，染色15分鐘再用reynolds』leadcitrate(雷若茲檸檬酸鉛，由軍事醫學科學院國家儀器分析測試中心提供)染7分鐘。6、染色後的切片用h7650透射電鏡觀察。7、使用amtxr16mccd和amt600.259(捕獲工程軟體)進行攝像。結果：如圖28所示(圖中，microvilli(微絨毛，mv)，terminalwebofactinmicrofilaments(肌動蛋白微絲，am)，mitochondria(線粒體，mi)，vacuoles(液泡，v)，endoplasmicreticulum(內質網，er)，nucleus(核，n)，nucleolus(核仁，nu))，在對hgecs和hiendopcs進行電鏡水平的觀察發現，hgecs呈現成熟細胞的特徵包括細胞相對較大，細胞間緊密連接，核質比較小，有許多的肌動蛋白纖維網(圖28之a幅)，胞漿內容物豐富，含有大量的線粒體，微絨毛和空泡(圖28之b幅)。而hiendopcs細胞更小，連接更為緊密，核仁明顯，核漿比更大(圖28之c幅)，胞漿內容物較少，含線粒體較少，少量線粒體和內質網分布於核膜的周圍(圖28之d幅)，並且細胞連接處具有不成熟細胞的指狀突起連接(圖28之e幅)。因此微觀水平的分析顯示，hiendopcs與hgecs明顯不同，hiendopcs呈現幹細胞的微觀特徵，而hgecs呈現終末分化成熟細胞的特徵。小結：電鏡水平的分析進一步證實了hiendopcs屬於幹/祖細胞特徵，而hgecs則具有成熟細胞的特徵，hgecs向hiendopcs轉換是成熟細胞向幹/祖細胞的轉換。四、誘導內胚層祖細胞的增殖和傳代擴增特性材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞成人胃肌成纖維細胞(agsemfs)、誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)。(2)實驗器材倒置相差顯微鏡(leica)、mltraview(超視，perkinelmer)。(3)主要試劑fibronectin(fn，纖連蛋白)、cell-tak膠(ct)均購自bd；無血清細胞快速凍存液(bio-tool)；a83-01(stemgent)；bfgf(鹼性成纖維生長因子b)、wnt3a均購自r&d；絲裂黴素-c(sigma)；advanceddmem/f12、dispase(離散酶)均購自gibco。(二)實驗方法及結果(1)hiendopcs的傳代1、傳代前準備：提前以合適密度在孔板中接種絲裂黴素c處理的agsemfs或提前約3個小時將fibronectin(fn)、cell-tak(ct)膠鋪於孔板中，室溫晾乾。2、配製傳代培養基：advanceddmem/df12+awf(配方：a83-010.5μm+wnt3a50ng/ml+bfgf10ng/ml)或advanceddmem/df12+a(a83-01，0.5μm)。3、傳代時手動挑取克隆，並將其劃成小塊，比例約1:3-4。將其置於fn+awf、ct+awf或feeder(滋養細胞)+a培養基中在37℃、5％co2培養箱中進行傳代培養。(2)hiendopccs的凍存與復甦1、凍存：用5mg/ml的dispase酶將手動挑取的克隆在37℃消化5分鐘，並吹打成小塊，使用培養基將細胞洗滌2次，然後用適量的無血清細胞快速凍存液重懸細胞，置於凍存管中，直接放於-80℃保存。2、復甦：將凍存的細胞42℃快速解凍，使用10倍體積的培養基洗滌，離心，然後用advanceddmem/df12+a(a83-010.5μm)的培養基重懸並接種於前述準備好的滋養層細胞上進行培養。結果：(1)hiendopcs在重編程過程中的增殖特徵在證實了hiendopcs的內胚層祖細胞的分子特徵後，對其增殖特性進行分析。仔細觀察hiendopcs在重編程過程中的動力學特徵，將其分為三個階段：第0-7天有些緊密的、邊緣銳利的是細胞克隆逐漸出現(phaseⅰ)；在7-10天克隆有一個緩慢增殖的過程(phaseⅱ)，克隆由小變大；在第10-15天是克隆迅速增殖的階段(phaseⅲ)，許多小的克隆迅速匯合成面積較大的克隆，在此階段細胞的倍增時間大概為36.1±4.7小時(參見圖29)。(2)hiendopcs的傳代培養條件篩選由於hiendopcs是內胚層祖細胞，因此其必須具備一定的傳代擴增潛能，發明人經過對傳代條件的多次篩選，最終確定在以fibronectin(fn)膠或bdcell-tak(ct)膠作為細胞外基質結合使用advanceddmem/df12+awf(a83-010.5μm+wnt3a50ng/ml+bfgf10ng/ml)的條件下也即fn+awf(圖30a)或ct+awf(圖30b)等無滋養層細胞的條件下，克隆傳代後可以良好生長並維持原始克隆的狀態。在以agsemfs為滋養層，結合advanceddmem/df12+a(a83-010.5μm)也即feeder+a(圖30c)的條件下，也能維持原始的幹/祖細胞克隆形態。hiendopcs也可進行凍存，克隆復甦後使用feeder+a的條件，同樣可維持原始克隆的形態(圖30d，post-thawedcells，凍存復甦後)。(3)hiendopcs的傳代擴增特性hiendopcs在前述的傳代培養條件下，大約可擴增4-6代，傳代過程中細胞形態基本維持不變(圖31，下排圖片為上排圖片方框的放大)。傳到4代之後細胞增殖速度減慢，第6代細胞數量達到頂峰，說明其增殖潛力有限。以每次大約可獲取的106個人胃上皮細胞(hgecs)為起始，經過重編程和大約4-6次的擴增，可以獲得約109數量的幹/祖細胞(hiendopcs)(圖32)。小結：使用相應的傳代條件可以將hiendopcs進行4-6代的擴增。五、誘導內胚層祖細胞分化潛能鑑定材料與方法(一)實驗材料(1)實驗細胞人胃上皮細胞(hgecs)、誘導內胚層祖細胞(hiendopcs)、h9人胚胎幹細胞(escs)購自wicell公司。(2)實驗器材實時螢光定量pcr儀(bio-rad)、普通pcr儀(eppendorf)、正置螢光顯微鏡(leica)、實時定量96孔板及封閉膜(bio-rad)、12孔板、雷射共聚焦螢光顯微鏡(zeiss)、倒置相差顯微鏡(leica)、細胞免疫共聚焦小皿(nest)。(3)主要試劑1、主要抗體：表6用於內胚層祖細胞(hiendopcs)免疫螢光檢測的第一抗體表7用於內胚層祖細胞(hiendopcs)免疫螢光檢測的第一抗體2、主要培養基、添加物及基質膠：advanceddmem/df12、mcdb131(低蛋白、無血清培養基131)、cmrl1066、advancedrpmi1640、glutamax(穀氨醯胺)、neaa(非必須胺基酸)、n2(無血清神經細胞添加劑n2)、b27(無血清神經細胞添加劑b27)均購自gibco；its-x(胰島素-轉鐵蛋白-硒-乙醇胺複合溶液，lifetechnologies)；t3、ascorbicacid(維生素c，sigma)；hm(肝細胞培養基，sciencell)；lanminin(層黏連蛋白)、fibronectin(纖連蛋白，fn)、collagenⅳ(4型膠原)購自bd。3、細胞因子：b-fgf(鹼性成纖維細胞生長因子b)、wnt3a、activina(激活素a)、fgf4(成纖維生長因子4)、hgf(肝細胞生長因子)、osm(抑瘤素m)、fgf10(成纖維生長因子10)、fgf7(成纖維生長因子7)、egf(表皮生長因子)、noggin(頭蛋白)、bmp4(骨形態發生蛋白4、igf(胰島素樣生長因子)、tsh(促甲狀腺激素)、insulin(胰島素)購自r&d公司；nai(碘化鈉，sigma)。4、小分子化合物：dex(地塞米松)、ra(維甲酸)、ldn193189、sant-1均購自sigma；tpb購自emdmillipore；alk5inhibitorii購自enzolifesciences；gammasecretaseinhibitorxx(γ-分泌酶抑制劑xx)購自emdmillipore；r428購自selleckchem；chir99021購自stemgent。5、試劑盒：humanalbuminelisa試劑盒(人白蛋白檢測試劑盒，購自bethyl)。6、其它試劑：1mg/ml的icg(靛氰綠)溶液、蘇木素、periodicacid(過碘酸)、tritonx-100、schiff’s(聚乙二醇辛基苯基醚，sigma)、枸櫞酸鈉緩衝液、4％多聚甲醛。(4)引物序列表8引物序列(二)實驗方法及結果(1)免疫螢光染色方法與前述相同。(2)q-pcr方法與前述相同。(3)向肝細胞的誘導分化具體方法包括以下步驟：1、將colleganⅳ/matrigel/laminin/km按照1:3:1:5的比例進行混合，然後使用適量體積的膠混合液均勻塗抹於孔板中，置於室溫乾燥3-5個小時。2、手動挑取hiendopcs並劃成合適大小的塊接種於上述處理的培養板中，使用加入了8％(v/v)fbs及10umy27632的人胃上皮細胞(hgecs)重編程培養基(配方：advanced(先進)dmem/f12+2mm穀氨醯胺+青-鏈黴素+sb43154(2μm)+rg108(0.04μm)+bix01294(0.5μm)+bayk8644(2μm))培養過夜。3、待細胞團塊充分貼壁後，用分階段法對hiendopcs進行誘導分化。第一階段：km(配方見實施例第一部分)+25ng/mlbmp4+25ng/mlfgf4+50ng/mlwnt3a培養3天；第二階段：hm(商品化培養基，購自sciencell)+20ng/mlhgf+10ng/mlosm+1μmdex培養10-15天。(4)向胰島β細胞的誘導分化具體方法包括以下步驟：1、將matrigel/km按照1:1的比例進行混合，然後使用適量體積的膠混合液均勻塗抹於孔板中，置於室溫乾燥3-5個小時。細胞貼附方法與前述相同。2、將貼附的細胞按照4個階段向胰腺進行誘導分化2.1mcdb131medium(購自gibco)+1.5g/lsodiumbicarbonate(碳酸氫鈉)+2mm(濃度)2mmglutamax(穀氨醯胺)+10mmfinalglucoseconcentration(葡萄糖)+2％bsa(牛血清白蛋白)+0.25mmascorbicacid(維生素c)+50ng/mloffgf7(成纖維生長因子7)+0.25μmsant-1+1μmretinoicacid(維甲酸)(ra)+100nmldn193189+1:200its-x(胰島素-轉鐵蛋白-硒-乙醇胺複合溶液)+200nmtpb，培養2天。2.2mcdb131medium+1.5g/lsodiumbicarbonate+2mmglutamax+10mmfinalglucoseconcentration+2％bsa+0.25mmascorbicacid+2ng/mloffgf7+0.25μmsant-1+0.1μmretinoicacid+200nmldn193189+1:200its-x+100nmtpb，培養2天。2.32天後第二階段細胞用5mg/mldispase(離散酶)在37℃消化5分鐘，然後機械性吹成小塊並轉移到低吸附孔板中更換培養基：mcdb131mediμm+1.5g/lsodiumbicarbonate+2mmglμtamax+20mmfinalglucoseconcentration+2％bsa+0.25μmsant-1+0.05μmretinoicacid+100nmldn193189+1:200its-x+1μmt3(胰島素-轉鐵蛋白-硒-乙醇胺複合溶液)+10μmalk5inhibitorii+10μmzincsulfate(硫酸鋅)+10μg/mlofheparin(肝素)，培養3天。2.4cmrl1066+2mmglutamax+2％bsa+100nmldn193189+1:200its-x+1μmt3+10μmalk5inhibitorii+10μmzincsμlfate+100nmgammasecretaseinhibitorxx(γ-分泌酶抑制劑xx)+2μmr428培養7天或更長。(5)向腸細胞的誘導分化具體方法包括以下步驟：1、rpmi1640medium+2mmglutama+100u/ml青黴素+0.1mg/ml鏈黴素+500ng/mlfgf4(成纖維生長因子4)+500ng/mlwnt3a(wnt信號通路蛋白配體3a)+100ng/mlegf(表皮生長因子)+3μmchir99021(stemgent),培養3天。2、手動挑取第一階段細胞並機械性吹成小塊然後埋入matrigel(人工基底膜)中，37℃、7-10分鐘，待膠凝固後加培養基:advanceddmed/f12+2mmglutamax+100u/ml青黴素+0.1mg/ml鏈黴素+1％n2(無血清神經細胞添加劑n2)+1％b27(無血清神經細胞添加劑b27)+100ng/mlegf(表皮生長因子)+100ng/mlnoggin(頭蛋白)，培養1周以上。(6)向甲狀腺的誘導分化具體方法包括以下步驟：1、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+noggin(200ng/ml)+sb431542(10μm)作用3天。2、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+wnt3a(100ng/ml)+egf(20ng/ml)+bmp4(10ng/ml)+fgf10(10ng/ml)+fgf7(10ng/ml)+tsh(1μg/ml)作用3天。3、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+tsh(1μg/ml)+igf(50ng/ml)+insulin(5mg/ml)+nai(100μm)作用4天。(7)向肺的誘導分化具體方法包括以下步驟：1、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+noggin(200ng/ml)+sb431542(10μm)作用4天。2、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+wnt3a(100ng/ml)，egf(20ng/ml)+bmp4(10ng/ml)+fgf10(10ng/ml)+fgf7(10ng/ml)培養3天。3、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+wnt3a(100ng/ml)+fgf10(10ng/ml)+fgf7(10ng/ml)+dexamethasone(地塞米松)(50nm)作用3天。(8)c肽含量的elisa檢測操作流程按照c-peptide(c肽)elisa試劑盒上的要求進行，具體方法包括以下步驟：1、製備工作液：提前把試劑盒中的試劑按照說明分別稀釋成工作液，室溫平衡20分鐘。2、製備標準品：在5個標準品中每個都加入1ml的去離子水，充分混勻後分裝成小樣，-20℃冰箱保存。3、將標準品和待檢測的細胞上清樣品加入已包被c-peptide抗體的96孔板中，每孔各25μl，每組樣品設三個重複。4、每孔加入緩衝液50μl。5、將96孔板置於微孔搖床上，800rpm室溫孵育1小時。6、棄去96孔板中液體，每孔再加入350μlwashbuffer(洗滌液)，繼而倒掉洗液，濾紙吸乾，如此重複4-5次。7、每孔加入enzymeconjugatesolution(酶結合溶液)200μl。8、孔板置於微孔搖床上，800rpm室溫孵育1小時。9、棄掉液體，每孔加入350μlwashbuffer(洗滌液)，重複步驟6。10、每孔加入底物tmb(四甲基聯苯胺)200μl。11、孔板置於搖床，室溫避光孵育30分鐘。12、每孔加入50μlstopsolution(終止液)，避光，置於搖床震動5秒。13、30分鐘內在酶標儀上450nm波長處測定od值，計算結果。(9)雙硫腙(dtz)染色具體方法包括以下步驟：1.將dtz貯存液(購自sigma)按1:20的比例進行稀釋，然後用0.45μm濾膜過濾後配成工作液。2.用pbs洗滌待染色的細胞。3.將配製好的dtz工作液加入待染色細胞中，37℃孵育10min後顯微鏡下觀察並攝像。(10)統計學分析所有數據均來自於三次及以上獨立重複試驗，除特殊說明外，數據均描述為平均值±標準差。兩組數據間統計學分析用spss軟體進行學生雙尾t檢驗，p<0.05時兩組之間的差異被認為具有統計學意義。結果：體內內胚層祖細胞最終發育形成胰腺、肝臟、腸、肺和甲狀腺等器官。為了證實hiendopcs是內胚層祖細胞，本發明對其測試了向多個方向誘導分化的潛能。(1)內胚層祖細胞(hiendopcs)向胰腺的誘導分化根據經典的胰腺誘導分化方案[pagliucafeliciaw,millmanjeffreyr,gürtlerm,segelm,vandervorta,ryujenniferh,etal.generationoffunctionalhumanpancreaticβcellsinvitro.cell.2014；159:428-39.rezaniaa,bruinje,arorap,rubina,batushanskyi,asadia,etal.reversalofdiabeteswithinsulin-producingcellsderivedinvitrofromhumanpluripotentstemcells.natbiotechnol.2014；32:1121-33.]將hiendopcs向胰腺進行誘導分化。在誘導2周後，hiendopcs來源的胰腺細胞(hiendopc-pans)呈現體內胰島三維的出芽生長形態(圖33a)。dtz(雙硫腙)染色顯示hiendopc-pans呈現紅色，表明細胞胞漿中含有鋅離子，這是胰島β細胞的特徵(圖33b)。對hiendopc-pans進行胰腺特異性蛋白染色顯示胰腺特異性轉錄因子pdx1和nkx6.1、胰島α細胞標誌gcg、胰島β細胞標誌c-pep和pro-ins以及胰島δ細胞的標誌sst都有明顯表達(圖33c和d)。轉錄水平的分析顯示多種胰腺特徵性基因在誘導後表達上調(圖33e)，這與免疫染色結果相一致。為了證實hiendopcs-pans是否具有胰島β細胞最重要的合成和釋放胰島素的能力，檢測了hiendopcs-pans在多種刺激條件下的c肽釋放能力。當使用高糖刺激時，與低糖組相比，c肽的釋放明顯增多。當使用其他的胰島素分泌促進劑kcl、tolbμtamiden作用時，c肽的釋放也明顯增多。而且hiendopcs-pans對刺激的胰島素釋放反應可與escs來源的胰島細胞相當(圖33f)。hiendopcs-pans的糖刺激反應性對於以後的糖尿病高血糖的治療具有十分重要的臨床應用意義。(2)hiendopcs向腸道細胞的誘導分化根據經典的腸細胞誘導方案[spencejr,mayhewcn,rankinsa,kuharmf,vallanceje,tollek,etal.directeddifferentiationofhumanpluripotentstemcellsintointestinaltissueinvitro.nature.2010；470:105-9.watsoncl,mahemm,múneraj,howelljc,sundaramn,polinghm,etal.aninvivomodelofhumansmallintestineusingpluripotentstemcells.naturemedicine.2014；20:1310-4.]對hiendopcs向腸道分化進行檢測。誘導2周後發現hiendopcs來源的腸道類器官(hiendopc-ints)呈現體外腸道原代培養的形態特徵(圖34a)。hiendopc-ints中腸特異性轉錄因子cdx2、小腸細胞標誌vil1、杯狀細胞標誌muc2、小腸內分泌細胞標誌chga、小腸潘氏細胞標誌lyso在誘導之後表達明顯上調(圖34b)。而且在蛋白水平，腸特徵性的標誌vill、muc2、cdx2、lgr5、ecad也都有明顯的表達(圖35c)，證實了hiendopc-ints已經初步具備了腸的特徵。(3)hiendopcs向肝細胞的誘導分化採用經典的肝向誘導方案[gouon-evansv,boussemartl,gadμep,nierhoffd,koehlerci,kuboa,etal.bmp-4isrequiredforhepaticspecificationofmouseembryonicstemcell-deriveddefinitiveendoderm.natbiotechnol.2006；24:1402-11.]將hiendopcs向肝細胞進行誘導分化，發現hiendopcs來源的肝細胞(hiendopc-heps)開始表達原代肝細胞特徵性的多種功能基因包括hnf4a、cebpa、cebpb、tf、aatggt、g6pc、cyp1a1、cyp3a4、cyp3a7、μgt1a1、μgt1a3等(圖35a)。同時hiendopc-heps中afp(甲胎蛋白)、ck18(細胞角質蛋白18)的染色陽性(圖35b)；在流式水平alb(白蛋白)陽性的細胞比例高達90％以上(圖35c)，表明hiendopc-heps初步具備了肝細胞的特徵。(4)hiendopcs向甲狀腺和肺的誘導分化hiendopcs向甲狀腺進行誘導分化[longmireta,ikonomoul,hawkinsf,christodoulouc,caoy,jeanjc,etal.efficientderivationofpμrifiedlungandthyroidprogenitorsfromembryonicstemcells.cellstemcell.2012；10:398-411.]後，hiendopcs來源的甲狀腺細胞(hiendopcs-thyroid)中甲狀腺和肺共有的特異性轉錄因子nkx2.1、甲狀腺特異性轉錄因子pax8、甲狀腺球蛋白(tg)、促甲狀腺激素受體(tshr)表達水平比誘導前有非常明顯的提升(圖36a)。而hiendopcs來源的肺細胞(hiendopcs-lμng)中肺特異性轉錄因子nkx2.1、肺clare細胞標誌cc-10、一型肺泡細胞的標誌水通道蛋白aqp5、二型肺泡細胞的標誌表面活性蛋白spa、spb、spc等表達明顯上調(圖36b)。採用能夠促進向胰腺、肝臟、腸道、甲狀腺和肺的誘導分化策略，對hiendopcs的內胚層分化潛能做鑑定，結果表明hiendopcs向5個方向分化後，相關的基因表達，蛋白表達明顯提高，部分功能也已顯現，更加明確的證實了hiendopcs是內胚層祖細胞，同時提示了hiendopcs對於糖尿病、肝病和腸道疾病等的細胞治療可以提供理想的種子細胞。實施例3、可將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的小分子化合物組合小分子組合4m中單個小分子濃度改變對誘導內胚層祖細胞產生的影響：前述已說明在四個小分子化合物bbrs小分子組合中，在sb43152(sb，2μm)，rg108(rg，0.04μm)，bix01294(bix，0.5μm)，bayk8644(bay，2μm)4個小分子使用濃度下，可以重編程獲得內胚層祖細胞(hiendopcs)，效率4-6％。本實施例用相同的方法對所述4個小分子化合物在不同濃度範圍sb43152(1～10μm)，rg108(0.01～1μm)，bix01294(0.1～2μm)，bayk8644(1～4μm)下對hiendopcs的產生情況進行了驗證(參見表9)，同時用a83-01(a83,0.4～1μm)替換sb後再與其他三個小分子在不同濃度組合rg108(0.01～1μm)，bix01294(0.1～2μm)，bayk8644(1～4μm)下對hiendopcs的產生情況進行了驗證(表10)。表9：不同使用濃度bbrs小分子組合及其重編程獲得hiendopcs效率表10：不同使用濃度bbra小分子組合及其重編程獲得hiendopcs效率參照實施例2的方法對表9和表10組合中所獲得的內胚層祖細胞做了內胚層相關的基因、蛋白、表觀修飾檢測及分化功能鑑定，結果顯示：以上組合獲得的誘導內胚層均能高表達內胚層祖細胞特徵的標誌foxa2、sox9、gata4、hnf1b、hoxa3、pdx1、cxcr4、epcam、ck19和lgr5，不表達胃細胞特徵性的標誌muc6、gast。其具有內胚層祖細胞特徵的表觀修飾特點，在向肝細胞進行誘導分化後能夠表達肝細胞特異性的標誌afp、alb、hnf4a、ck18、cyp3a4等；在向胰腺β細胞分化後開始表達nkx6.1、pdx1、gcg、sst、ins等胰腺特異性標記，並且在刺激的條件下能夠釋放胰島素；在向腸細胞進行誘導分化後表達cdx2、muc2、vil1、chga和lyso等腸特異性標誌；在向肺和甲狀腺細胞進行分化後分別表達各自細胞特異性的標誌。證實了表9-表10小分子在所列濃度範圍內同樣可以獲得內胚層祖細胞。實施例4、製備可將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的重編程試劑盒本發明可將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的重編程試劑盒，包括可將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的小分子化合物組合，具體來講，小分子化合物組合由8個(8m)小分子化合物組成，分別為：fbp(二磷酸果糖)、bayk8644、bix01294、sb431542或a83-01、valproicacid(vpa)(丙戊酸)、rg108、pd0325901和ps48。優選的可將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的小分子化合物組合包括以下4個小分子化合物，其中bbrs組合為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)，bbra組合為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和a83-01(a83)。試劑盒中，各化合物可分別包裝，或按8m組合或bbrs組合或bbra組合將各化合物混合後包裝；化合物分別包裝時，試劑盒中的說明書中記載各化合物的使用濃度，具體濃度數值可參見實施例1和實施例3。試劑盒中還包括基礎培養基advanceddmem/f12和細胞培養基礎添加成分穀氨醯胺(glutamax)和抗生素sp，及其使用說明，其中相對advanceddmem/f12基礎培養基，穀氨醯胺的使用濃度為2mm(1×)，抗生素(如青-鏈黴素)使用濃度為100u/ml青黴素+0.1mg/ml鏈黴素，各成分分別包裝或按所列使用濃度混合後包裝。試劑盒還可將所述小分子化合物組合與所述的基礎培養基和細胞培養基礎添加成分組合形成重編程培養基，重編程培養基的配方為：advanceddmem/f12+2mm穀氨醯胺(glutamax)+青-鏈黴素(100u/ml青黴素+0.1mg/ml鏈黴素)+sb43154(2μm)或a83-01(0.5μm)+vpa(0.5mm)+pd0325901(0.5μm)+rg108(0.04μm)+bix01294(0.5μm)+bayk8644(2μm)+ps48(5μm)+fbp(3.5mm)。優選的重編程培養基配方為：advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，1～10μm的sb43152，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；更優選advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，2μm的sb43152，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644。另一優選重編程培養基配方為：advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，0.4～1μm的a83-01，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；更優選advanceddmem/f12中含2mm穀氨醯胺(glutamax)，青-鏈黴素(100u/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素)，0.5μm的a83-01，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644。試劑盒中，還可包括滋養層細胞及其使用說明，所述滋養層細胞為消化道來源的基質細胞，如胃肌成纖維細胞或小腸肌成纖維細胞。試劑盒中所有細胞、化合物和試劑均可按前述實施例提示的來源商購獲得。試劑盒中還包括使用說明書，說明書中記載試劑盒的實際組成及使用方法，其中包括使用相關試劑將消化道來源上皮細胞重編程為內胚層幹/祖細胞的重編程方法，該方法內容參考實施例中的描述。當前第1頁12