製備重組人白細胞介素11的方法

2023-08-12 09:45:41 1

專利名稱：製備重組人白細胞介素11的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體而言，本發明涉及一種製備重組人白細胞介素11 的方法。
背景技術：
白細胞介素 11 (Interleukin-11，IL-11)首先由 Harvard MedicalSchool 的 D. A. Willianms等人於1986年發現。IL-Il是一種多功能的細胞因子，其最基本的功能在於 造血調控作用。它能刺激人的造血紅細胞和巨核細胞前體的分化並誘導巨核細胞的生成和 成熟，最終導致血小板數量的增加。此外，它還具有促進消化道上皮損傷的恢復、調節脂肪 細胞分化等多種生物活性(Du Χ. X. ,Williams D. Α.，Blood, 1997，89 (11)第 3897-3908)。 1990 年 Paul S. R.等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87 :7512-7516)克隆到該細胞因 子的cDNA，結果證明其cDNA序列與其它的細胞因子不同，命名為白細胞介素11。研究發現 白細胞介素11可以明顯促進骨髓內造血細胞增殖，因而具有促血小扳生成的作用。白細胞介素-11由骨髓基質細胞產生，其分子量為23-MkDa，等電點(pi)為 11. 7，前體是含199個胺基酸的多肽，其中N端21個胺基酸是信號肽。成熟的IL-Il含有 178個胺基酸殘基，沒有二硫鍵和糖基化位點。IL-Il主要作用於B細胞、巨核細胞和漿細 胞瘤細胞，對於放/化療患者、血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血、骨髓移植等造血功能 障礙的治療具有顯著療效，故IL-Il具有廣闊的應用前景。由於IL-Il的性能相當特殊，其基因編碼區N端富含脯氨酸，不利於產物的正確 摺疊，等電點極高，因此IL-Il較難實現在大腸桿菌中的非融合表達，常規的表達和復性都 很困難。目前通常都是採用融合表達方法。硫氧還蛋白(Thioredoxin，下文有時簡稱為 "Trx")是一種普遍存在於酵母、細菌、動物、植物體內的蛋白，該蛋白也是目前常用的表達 宿主(例如酵母菌或大腸桿菌)的內源蛋白。國內對重組人白細胞介素11的研製起步於九十年代中期。軍事醫學科學院基礎 醫學研究所苗繼紅等人(中國科學(B輯)，1995，25(6) =616-622)研究N末端缺失8個 胺基酸的IL-Il的表達活性。蘇州醫學院陳永珍等人(《中國免疫學雜誌》，1997，13 (3) 165-166,169)報導了 IL-Il的活性測定的改良方法。與此同時，國內一些科研單位和製藥 企業也展開了 IL-Il的研究工作。由於IL-Il的cDNA結構的特殊性，IL-Il不能在大腸桿菌 中直接表達。又由於IL-Il成熟蛋白前8個胺基酸中含有6個脯氨酸，內部脯氨酸含量也很 高，對其在大腸桿菌中的表達及後處理可能影響很大。為了獲得IL-Il的有效表達，一種方 法是對IL-Il的N端胺基酸做缺失突變或增加胺基酸以避開G-C富含區，但這樣可能影響 IL-Il的生物學活性及改變其免疫原性。另一方法是用融合蛋白的方法表達完整的IL-Il 的cDNA，然後再用專一切割劑將前導肽與IL-Il切割開。目前美國Genetics Institute使 用的是腸激酶，國內許多單位也採用這一切割劑。張穎等(《生物工程學報》，2000，16(3) :353-356)報導了中國人IL-Il的cDNA的 克隆與序列測定，並與國外報導序列(Palu et al,PNAS, 1990,87 :7512)進行了比較。結果表明，中國人胚胎來源的IL-Il的cDNA與文獻報導序列高度同源，僅3個核苷酸有變化，氨 基酸序列沒有變化。將IL-Il的cDNA插入到硫氧還蛋白基因融合表達載體pTRXFUS中，在 大腸桿菌菌株G1724中進行表達。pTRXFUS含有PL啟動子，IL-Il的cDNA插入到其trxA 基因的3'端。合成的融合蛋白在大腸桿菌胞質中以可溶性形式存在，並可正確摺疊，表現 出全部生物學活性。黃巖山等(《生物工程學報》，2001，17(3) =250-253)報導了人白細胞介素11在 畢赤酵母中的表達與純化的研究，作者依次採用SPkpharose FF, Phenyl Sepharose, Sephadex G25三種方法純化，得到rhIL-11的純度達98%。但是至今還沒有人只利用鎳離子螯合親和層析與CM陽離子層析兩種層析方法簡 便地從Trx-rhIL-11融合蛋白來製備rhIL_l 1。

發明內容
本發明的目的是要提供一種製備重組人白細胞介素11的方法。為了實現本發明的目的，本發明提供一種製備重組人白細胞介素11的方法，該方 法包括1)提供融合蛋白，所述融合蛋白從N端到C端依次為硫氧還蛋白-(His)6-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11或(見8)6-硫 氧還蛋白-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11 ；2)用所述蛋白水解酶對所述融合蛋白進行酶切，從而獲得酶切產物，所述酶切產 物包含硫氧還蛋白和重組人白細胞介素11 ；和3)使用鎳離子螯合親和柱層析法對所述酶切產物進行純化，其中所述硫氧還蛋白 和所述重組人白細胞介素11均被吸附到所述柱上，然後對所述柱進行梯度洗脫，從而獲得 重組人白細胞介素11。優選地，在所述步驟幻中使用洗脫液A、B和C進行所述梯度洗脫，其中所述洗脫 液 A 為 20 IOOmM Tris，pH7. 0 8. 5 ；所述洗脫液B 為 20 IOOmM Tris-HCl, 0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5 ；所述洗脫液 C 為 20 IOOmM Tris-HCl，10 50mM 咪唑，0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5。更優選地，所述洗脫液A為50mM Tris, pH8. 0 ；所述洗脫液B為50mM Tris-HCl， 0. 5M NaCl, pH8. 0 ；所述洗脫液 C 為 50mMTris_HCl，30mM 咪唑，0. 5M NaCl, pH8. 0。目前常規的純化方法是使硫氧還蛋白吸附在層析柱上，同時將重組人白細胞介素 11和其他雜質洗脫下來，然後進行進一步的純化。與現有技術相比，本發明的方法將硫氧還 蛋白和重組人白細胞介素11共同吸附在層析柱上，首先使雜質洗脫，然後利用兩者與層析 柱的不同的結合性而將重組人白細胞介素11洗脫下來，從而方便快捷地達到純化重組人 白細胞介素11的目的。在本發明中，所述重組人白細胞介素11優選具有如SEQ IDNO 1所示的胺基酸序 列。另外，在所述步驟1)和2、之間還使用鎳離子螯合親和柱層析法利用洗脫液D、E 和F對所述融合蛋白進行純化，其中所述洗脫液D為50mM Tris,500mM NaCl，30mM咪唑， pH8. 0 ；所述洗脫液E為50mM Tris，pH8. 0 ；所述洗脫液F為IOOmM Tris，IOOmM咪唑(其pH優選為8. 0)。 為了在後續步驟中將IL-Il從融合蛋白上釋放下來，優選在編碼IL-Il的DNA 序列的5』端引入編碼蛋白水解酶識別位點核苷酸序列。所述蛋白水解酶可以為凝血酶、 Kex2-600、脯氨酸內肽酶、腸激酶。腸激酶(EK酶)是優選的，因為該酶能夠在識別位點的 C末端水解融合蛋白。因此，更優選在編碼腸激酶識別位點的核苷酸序列的後面直接跟著 IL-Il的編碼序列，這樣腸激酶可以將最終所需的IL-Il完整、準確地釋放出來。如果採用 人工合成編碼IL-Il的DNA序列，為了便於克隆，在人工合成所述DNA序列時，還需要在該 序列的5』端和3』端引入適當的限制性酶切位點。為了便於日後的純化，可在融合蛋白的 適當位置上插入便於純化的序列，例如優選在所用Trx的N端或C端插入His-Tag。市售的 載體pET3h(+)中不但具有Trx的基因，而且在該基因的下遊還具有His-Tag和腸激酶切 割識別位點。 優選地，所述酶切步驟包括a)配製反應液，其含有lmg/mL融合蛋白；20mM Tris-HCl, pH8. 0 ；1體積％ Tween 20 ；和b)按IU腸激酶切割7mg所述融合蛋白的比例加入腸激酶，在18°C、44rpm下反應 15h 至 18h。在所述步驟幻後還優選使用陽離子交換柱層析法對所述重組人白細胞介素11進 行純化，其中所述陽離子交換介質為快流速CM瓊脂糖凝膠，洗脫液為洗脫液G和H，所述洗 脫液 G 為 20mM NaCl，IOmM PB, pH7. 0 ；所述洗脫液 H 為 300mM NaCl，IOmM PB, pH7. 0。在本文中，術語「PB」 (Phosphate Buffer)為磷酸鹽緩衝液，其根據需要調節至合 適的PH。本領域技術人員可以理解，「PB」前面的濃度是指磷酸鹽的濃度，例如IOmM PB是 指磷酸鹽在緩衝液中的濃度為10mM。在本發明中，所述融合蛋白是將表達載體在宿主菌中表達而獲得的，所述表達載 體含有編碼硫氧還蛋白-(His)6-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11或(His)6H 氧還蛋白-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11的核苷酸序列。優選地，所述宿主 菌為大腸桿菌BL21(DE3)。為了獲得本發明的融合蛋白，優選先構建能夠表達該融合蛋白的表達載體。該表 達載體可以通過將編碼IL-Il的DNA序列插入到受啟動子控制下的Trx基因的下遊而構 建完成。如背景技術部分所述，Trx是一種普遍存在於酵母、細菌、動物、植物體內的蛋白， 該蛋白也是目前常用的IL-Il表達宿主例如酵母或大腸桿菌的內源蛋白。該蛋白可在細 胞內調節蛋白質的摺疊和聚集過程的平衡，Trx能與許多蛋白發生相互作用，增強融合蛋白 的溶解性，從而減少了包涵體的形成(Thomas, J. G.等，Appl Biochem Biotechnol. 66 (3) 197-238)。在本發明中可以使用完整的Trx，也可以使用Trx的一部分或其突變體，所選取 的部分或突變體具有與Trx相同或相似的空間結構和功能。本發明的表達載體可以是酵母菌的表達載體，也可以是大腸桿菌的表達載體。所 述的IL-Il可以是完全人工合成的新DNA序列，也可以為已經公開的編碼IL-Il的DNA序 列。為了將編碼IL-Il的DNA序列插入Trx基因的下遊，優選使用已經含有所述Trx基因 或其部分序列的克隆載體。這種載體也可通過購買得到。例如，pET32a(+)就是這樣一種 載體。pET32a(+)可以高效表達的Trx-Tag的多肽，外源基因插入其多克隆位點後，產生的融合蛋白含有可剪切的Trx-Tag和S-Tag序列，便於檢測和純化。為了大量製備IL-11，需要將構建的重組表達載體轉化適當宿主的感受態細胞，例 如酵母細胞或大腸桿菌細胞，並在適當的培養基中進行發酵，以收穫融合蛋白。在本發明的 一個具體實施例中採用的宿主細胞是可市售得到的E. coli BL21(DE3)。該細胞的胞內和胞 間周質蛋白酶均已失活，這樣當進行外源蛋白的可溶性表達時，不容易被宿主菌的蛋白酶 水解，因而可穩定存在。為了在發酵期間進行有效的控制，通常建議可誘導型的表達載體。pET系列載體就 是這樣一類大腸桿菌表達載體。該載體是利用T7噬菌體RNA聚合酶/啟動子系統構建的 E. coli表達載體，即在E. coliBL21(DE3)或JM109(DE3)的染色體上整合了 T7RNA聚合酶基 因，而且受Iac操縱子調控。所以，當用IPTG誘導時，導致T7RNA聚合酶的合成，從而誘導了 PET載體上的目的基因的表達。T7噬菌體RNA/啟動子具有很強的啟動活性，而且在載體多 克隆位點序列上遊有強核蛋白體結合序列(rbs)，所以pET載體可以高效地表達外源蛋白。所述的發酵培養基根據宿主的不同而異。在選用大腸桿菌為宿主、以PET系列載 體為表達載體的情況下，發酵培養基可以為LB、TB、M9CA等，優選為TB培養基。發酵溫度為 30-40°C，優選為37°C;pH6. 8-7. 2，優選為pH7. O ；溶氧DO彡30%，誘導用的IPTG終濃度為 0. 3-3. OmM，優選為1. OmM ；誘導時間為3_釙，優選為3. 5_4h。在上述適宜的條件下，可使發 酵液濃度達到60g細菌溼重/L發酵液以上，目的融合蛋白表達量在30%以上。臨床前藥效學試驗、毒理學試驗研究表明本發明製備的rhIL-11皮下注射對血 小板計數具有明顯的升高作用，但對全紅細胞計數、血紅蛋白含量及紅細胞壓積、對白細胞 計數未見明顯影響。其安全劑量為50yg/kg/天。因此，本發明製備的rhIL-11用於人體 治療是安全有效的。本發明將rhIL-11與親水性的Trx—段序列融合，該融合蛋白在胞內以可溶形式 表達，避免了工藝複雜且收率較低的包涵體復性步驟。融合蛋白含His-Tag，從而可以通過 鎳離子螯合親和層析法快速、簡便、高效地純化，大大提高了回收率。Trx與rhIL-11間存在 腸激酶切割位點，保證純化的融合蛋白經腸激酶切割後可以釋放完整的rhIL-11。採用腸激 酶將表達出的融合蛋白酶解，並利用一系列的柱層析法將目的蛋白rhIL-11純化出來，純 度可達到99%以上。


圖1為重組表達質粒ρΕΤ-IL-ll的鑑定圖譜。各泳道分別代表M為DNA分子量標 準(GeneRuler Ikb DNA Ladder Plus, fermentas) ； 1 為以含合成 DNA 片段的 pUC18 為模板 的PCR擴增產物；2為重組子ρΕΤ-IL-ll的PCR擴增產物；3為pET3h_Kpn I/EcoR I雙酶 切產物；4為重組子ρΕΤ-IL-ll的Kpn I/EcoR I雙酶切產物；5為重組子pET_IL_ll質粒； 6為pET32a質粒。圖2為工程菌發酵表達的SDS-PAGE電泳分析，其中M為蛋白質分子量標準；1為 誘導前的工程菌；2為工程菌誘導表達後的發酵菌。圖3為rhIL-11各步純化樣品的SDS-PAGE電泳分析，其中M為蛋白質分子量標 準；1為經鎳離子螯合親和層析得到的融合蛋白；2為融合蛋白經EK酶作用後的酶切產物； 3為酶切產物經鎳離子螯合親和層析後的目的蛋白；4為陽離子交換柱CM層析後得到的rhIL-llo圖 4 為 rhIL-11 的 RP-HPLC 圖譜。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
的描述對本發明作進一步說明，但這並非是對本 發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要 不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。實施例1表達rhIL-11的DNA序列的設計本發明表達的人白細胞介素11的胺基酸序列與天然人白細胞介素11相比，缺失 了 N端的第一個胺基酸(即脯氨酸)，其胺基酸序列如SEQ ID N0:1所示。編碼該rhIL_ll 的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。根據SEQ ID NO 2中所列的IL-Il編碼序列，在3，端引入終止密碼TAA,並在5， 端引入腸激酶酶切識別位點的DNA編碼序列GACGACGACGACAAG。將這樣的DNA序列命名為序 列3(見SEQID NO :3)，採用全基因合成的方式委託上海生工生物工程技術服務有限公司人 工合成該序列。為便於以後的亞克隆，將合成基因克隆到PUC18 O^rmentas Life Science 公司)上，用於該合成的DNA序列保存和進一步克隆。重組質粒的構建如無特別說明，以下分子克隆技術操作方法均參照下列文獻進行《分子克隆實驗 指南》(第三版)(黃培堂等譯，[美]薩姆布魯克等著，科學出版社，2002)。DNA操作中所用 的DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自QIAGEN公司。DNA連接試劑盒購自NEB公司。DNA Marker、克隆載體pUC18、限制性內切酶、PCR相關試劑等購自i^ermentas Life Science公 司。表達載體PET3M (+)、大腸桿菌T0P10及BL21 (DE3)均為Novagen公司產品，並且購自默 克化工技術(上海)有限公司。克隆用大腸桿菌宿主為Τ0Ρ10(基因型F-，mCrAA (mrr-hsd RMS-mcrBC) , φ 80，lacZAM15, Δ lacX74, recAl, araA 139Δ (ara-leu) 7697，galU, galK，rps，(Strr) endAl，nupG)，表達用大腸桿菌宿主為BL21 (DE3)(基因型為hsdS gal(A dts857 indlSam7 nin5 lacUV5_T7 genel)。BL21(DE3)帶有 T7RNA 多聚酶基因， 在IPTG的誘導下T7RNA多聚酶大量產生，因而開啟了外源基因的表達，可使外源基因高效 表達。LB培養基配方為蛋白腖，0.5%酵母粉，NaCl ；LB瓊脂糖平板配方為蛋 白腖，0.5%酵母粉，NaCl，2%瓊脂糖。其中蛋白腖和酵母粉購自英國Oxid公司。1.準備目的基因片段合成rhIL-11基因的PCR擴增引物。為了便於進一步克隆，在上遊引物Pl中引入 Kpn I酶切位點GGTACC，在下遊引物P2中引入EcoR I酶切位點GAATTC。引物序列如下上遊弓丨物 Pl :5，ctgggtaccgacgacgacgacaaggggcc 3，下遊弓丨物 P2 :5，tccgaattcttacagccgagtcttcagca 3，以含有rhIL-11編碼序列的pUC18質粒DNA為模板，P1、P2為引物進行PCR擴增， 在1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，用凝膠DNA回收試劑盒回收該片段。用Kpn I/EcoR I雙酶切該回收片段，純化備用。2.準備表達載體片段
用DNA抽提試劑盒提取pET3h(+)質粒DNA，用Kpn I/EcoRI雙酶切，的瓊脂糖 凝膠電泳分離大片段，切下含有大片段的凝膠，用凝膠DNA回收試劑盒回收大片段，電泳驗 證後備用。3.構建重組質粒pET-IL-11將1、2準備好的DNA片段用T4DNA連接酶在16°C連接30min，連接產物轉化大腸 桿菌T0P10感受態細胞，塗布於含有ΙΟΟμ g/mlAmp的LB瓊脂糖平板，37°C培養過夜。4.重組子篩選在轉化菌平板上挑取陽性菌落，在5ml含100 μ g/ml Amp的LB培養基中37°C培養 過夜，用DNA抽提試劑盒提取質粒DNA。分別用Kpn I, EcoR I對所提取的DNA酶切，然後 進行的瓊脂糖凝膠電泳鑑定重組子，陽性重組質粒命名為ρΕΤ-IL-ll。進一步以P1、P2 為引物，對ρΕΤ-IL-ll進行PCR驗證。陽性重組質粒的鑑定結果見圖1。5.質粒ρΕΤ-IL-ll的序列測定將質粒ρΕΤ-IL-ll進行測序驗證，測序結果證明構建的陽性重組質粒pET_IL_ll 中的rhIL-11 DNA序列及其插入位置與理論設計完全一致。工程菌的誘導表達用重組質粒pET-IL-11 DNA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到用於表達rhIL-11融合 蛋白的基因工程菌。挑取菌落，在5ml含ΙΟΟμ g/mlAmp的LB培養基中37°C培養過夜，以 1 %的體積轉接於50ml含100 μ g/ml Amp的LB培養基中37°C培養，剩餘菌液用15%甘油分 裝凍存。當培養至OD6tltl達到0. 5時，加入IPTG到終濃度0. 5mM進行誘導表達，4小時後取 樣進行SDS-PAGE電泳。與未誘導的對照相比，誘導後的重組子均有預期分子量36kDa左右 的表達帶。取陽性菌株以進一步進行表達實驗，表達及傳代穩定後，選此菌株作為工程菌， 命名為BL21 (DE3) -IL-11，置甘油中保存。工程菌中融合蛋白的表達量佔全菌蛋白的30 % 以上。工程菌BL21(DE3)-IL-Il 的發酵取表達Trx-rhIL-11融合蛋白的工程菌BL21(DE3)-IL-Il的甘油菌種(ImL/支)， 接種到500mL的LB液體培養基中，在37°C、250rpm下培養15hr。按7. 5%的接種量將此 種子液接入已滅菌的15L TB液體培養基中(30L B. Braim發酵罐)進行發酵，其中溫度為 37°C、pH7. 0、DO2 >30%。補料根據溶氧及pH變化進行反饋控制，營養物質缺乏時，溶氧 上升，PH也上升，此時進行補料。培養至0D_ = 12時開始誘導表達，加入終濃度為ImM的 IPTG，誘導4h。在此條件下，最終菌體密度為31. 7g細菌溼重/L發酵液，目的融合蛋白表達 量32% (見圖2)。表ITB培養基配方
權利要求
1.一種製備重組人白細胞介素11的方法，該方法包括1)提供融合蛋白，所述融合蛋白從N端到C端依次為硫氧還蛋白-(His)6-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11或(His)6-硫氧還 蛋白-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11 ；2)用所述蛋白水解酶對所述融合蛋白進行酶切，從而獲得酶切產物，所述酶切產物包 含硫氧還蛋白和重組人白細胞介素11 ；和3)使用鎳離子螯合親和柱層析法對所述酶切產物進行純化，其中所述硫氧還蛋白和所 述重組人白細胞介素11均被吸附到所述柱上，然後對所述柱進行梯度洗脫，從而獲得重組 人白細胞介素11。
2.根據權利要求1所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，在所述步 驟3)中使用洗脫液A、B和C進行所述梯度洗脫，其中所述洗脫液A為20 IOOmM Tris, pH7. 0 8. 5 ；所述洗脫液 B 為 20 IOOmM Tris-HCl,0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5 ；所 述洗脫液 C 為 20 IOOmM Tris-HCl，10 50mM 咪唑，0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5。
3.根據權利要求2所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，所述洗脫液 A 為 50mM Tris, pH8. 0 ；所述洗脫液 B 為 50mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，pH8. 0 ；所述洗脫液 C 為 50mM Tris-HCl，30mM 咪唑，0. 5M NaCl，pH8. 0。
4.根據權利要求1所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，所述重組人 白細胞介素11具有如SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列。
5.根據權利要求1所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，在所述步驟 1)和2、之間還使用鎳離子螯合親和柱層析法利用洗脫液D、E和F對所述融合蛋白進行純 化，其中所述洗脫液D為50mM Tris,500mM NaCl,30mM咪唑，pH8. 0 ；所述洗脫液E為50mM Tris, pH8. 0 ；所述洗脫液 F 為 IOOmM Tris, IOOmM 咪唑。
6.根據權利要求1所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，所述蛋白水 解酶識別位點為腸激酶識別位點。
7.根據權利要求6所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，所述酶切步 驟包括a)配製反應液，其含有lmg/mL的所述融合蛋白；20mMTris-HCl, ρΗ8· 0 ；1 體積％ Tween 20 ；和b)按IU所述腸激酶切割7mg所述融合蛋白的比例加入所述腸激酶，在18°C、44rpm下反應15h至18h。
8.根據權利要求1所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，在所述步驟 3)後還使用陽離子交換柱層析法對所述重組人白細胞介素11進行純化，其中所述陽離子 交換介質為快流速CM瓊脂糖凝膠，洗脫液為洗脫液G和H，所述洗脫液G為20mM NaCl, IOmM PB, pH7. 0 ；所述洗脫液 H 為 300mM NaCl, IOmM PB, pH7. 0。
9.根據權利要求1所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，所述融合蛋 白是將表達載體在宿主菌中表達而獲得的，所述表達載體含有編碼硫氧還蛋白-(His)6-蛋 白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11或(His)6-硫氧還蛋白-蛋白水解酶識別位 點-重組人白細胞介素11的核苷酸序列。
10.根據權利要求9所述的製備重組人白細胞介素11的方法，其特徵在於，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
全文摘要
本發明提供一種製備重組人白細胞介素11的方法，該方法包括1)提供融合蛋白，所述融合蛋白從N端到C端依次為硫氧還蛋白-(His)6-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11或(His)6-硫氧還蛋白-蛋白水解酶識別位點-重組人白細胞介素11；2)用所述蛋白水解酶對所述融合蛋白進行酶切，從而獲得酶切產物，所述酶切產物包含硫氧還蛋白和重組人白細胞介素11；和3)使用鎳離子螯合親和柱層析法對所述酶切產物進行純化，其中所述硫氧還蛋白和所述重組人白細胞介素11均被吸附到所述柱上，然後對所述柱進行梯度洗脫，從而獲得rhIL-11。利用本發明的方法可快速、簡便、高效地純化rhIL-11，從而大大提高回收率。
文檔編號C07K1/22GK102140487SQ201010107440
公開日2011年8月3日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者何凱, 葉學君, 張仁懷, 張風豪, 楊立明, 汪猜, 陽勇, 韓為躍 申請人:東莞太力生物工程有限公司