凍存自體角膜緣幹細胞的無飼養層構建角膜上皮方法
2023-07-12 20:58:21 1
專利名稱：凍存自體角膜緣幹細胞的無飼養層構建角膜上皮方法
技術領域：
本發明屬於幹細胞與組織工程技術領域，具體涉及體外分離克隆角膜緣幹細胞，並在體外不同條件下保存，解凍後用於角膜上皮及人工角膜的無飼養層構建的方法。
背景技術：
正常的眼球表面覆蓋有角膜、角膜緣、結膜三種上皮，它們在細胞表型上完全不同，與其前表面的淚膜構成了完整的眼表。其中，角膜緣上皮基底層的角膜緣幹細胞不僅在保持角膜上皮完整性方面具有重要的作用，而且具有如下特徵(1)可增殖性；(2)自我更新能力；(3)可產生大量的終未分化狀態和功能的子代細胞；(4)在組織受損後具有再生更新能力(1.CotsarelisG et al.Cell，1989；57201.2.Kruse FE，et al.Eye.1994；8170.3.Schemer，et al.J.Cell Biol，1986；10349-62)，。
在臨床上，各種化學或熱燒傷，stevens-Johnson綜合症，眼表類天皰瘡，佩帶角膜接觸鏡以及嚴重的微生物感染等都可導致角膜緣幹細胞完全缺失，破壞角膜上皮完整性而致盲。目前的治療措施是根據角膜緣幹細胞理論的指導，手術移植帶有角膜緣幹細胞的組織來補充和更新角膜緣幹細胞(4.Kenyon，KR.Et al.ophthalmology.1989；96709. 5.Tseng，SC.Mol.Biol，Rep，1996；2347-58.6.Dua HS.Et al.Br，J，ophthalmology2000；84273.)。手術時要求切取供體角膜的2～3個鐘點位跨度的角膜緣組織，才能有足夠數量的角膜緣幹細胞用於角膜上皮的重建。這樣的取材有造成供體眼角膜緣幹細胞缺失的危險，加之在異體角膜緣組織的移植中，要求應用免疫抑制藥物來防止移植後的免疫排斥反應，對病人有一定程度的毒副作用。使得眼科醫生將目光轉向自體角膜緣幹細胞體外大量擴增培養後用於移植的研究上。目的在於實現從一小片活體角膜緣組織材料中獲得少量細胞經體外培養擴增後獲得大量細胞的願望，並將之與支架材料一同移植用於角膜上皮重建與治療。(7.Friend J，et al.Invest ophthalmol Vis Sci，1982；2341-49.8.He YG.Et al.Curr Eye Res.1991；985-63.9.Lindberg K，et al.Invest ophthalmol Vis Sci，1993；342672-2679.10.Koizumi N，et al.Archophthalmol 2001；119298-300.11.Tsai RT，et al.N.Engl J.Med.2000；34386-93.12.Koizumi N，et al.Invest ophthalmol Vis Sci，2002；432114-2121.)。以上工作為那些角膜緣幹細胞缺失而導致的眼表疾病的治療提供了一個新的措施，但是，培養的角膜緣幹細胞及其移植片只能培養結束後就立即應用於臨床，需要患者的身體狀況與培養結束後細胞的最佳生長狀態相吻合，否則，就會導致整個操作和手術失敗。如果能夠將患者的自體角膜緣幹細胞在體外保存一定時間，並保證其增殖能力不衰退，在需要的時候可以繼續培養用於角膜上皮的重建，將極大地有利於其臨床應用。另外，目前用於角膜緣幹細胞體外擴增培養的是一個被稱為3T3的培養系統，在這一系統中，能保持角膜緣幹細胞克隆化生長並處於一種相對不分化狀態中(13.Pellegrini G.et al.J cell Biol，1999；145769-782.14.TsengSC，et al，Curr Eye Res 1996；15973-984.)。但是，在採用3T3細胞做飼養層培養和構建角膜緣上皮植片時，由於3T3細胞是來自胎鼠的成纖維細胞，其在臨床應用有將異種動物疾病傳播給人類的危險，由於患者的顧慮大而限制其廣泛使用。因此，如果體外能夠保存自體角膜緣幹細胞並將體外保存的自體角膜緣幹細胞無飼養層構建角膜上皮植片，能夠很好地解決上述矛盾，在組織工程角膜上皮的臨床應用上具有重要的意義。
發明內容
本發明的目的在於，提供一種凍存自體角膜緣幹細胞無飼養層構建角膜上皮的方法，將自體角膜緣幹細胞體外長期保存，並用保存的角膜緣幹細胞採用無飼養層的方法構建角膜上皮植片，實現臨床上角膜緣幹細胞缺損後的角膜上皮自體重建。
實現上述發明目的的技術方案是，凍存自體角膜緣幹細胞的無飼養層構建角膜上皮方法，其特徵在於，將自體角膜緣幹細胞體外長期保存，並用保存的角膜緣幹細胞採用無飼養層的方法構建角膜上皮植片，實現臨床上角膜緣幹細胞缺損後的角膜上皮自體重建；包括以下步驟1)首先採用dispase冷消化角膜緣上皮組織，使之與上皮基底膜很好地分離，獲取含較多角膜緣幹細胞的角膜上皮細胞，在鋪有明膠的六孔塑料培養板上培養擴增出角膜緣幹細胞，對角膜緣幹細胞的分子標記進行免疫組化檢測當CK19、P63和PCNA陽性，CK3/K12陰性時，證明所獲得的細胞為角膜緣幹細胞；2)將角膜緣幹細胞用酶消化後，加入冷凍保護液後置於不同的環境溫度中凍存，保護液配方DMEM/F12+10％DMSO+10％FBS，凍存時記錄角膜緣幹細胞的來源，以便進行對應的角膜自體移植，凍存後的角膜緣幹細胞仍具有角膜緣幹細胞特性，體外可繼續擴增；3)將已去上皮的人羊膜粘附到一個特製的支架上，放入六孔板中，37℃乾燥30min～60min後，使羊膜與六孔板底和支架粘附牢固，取凍存的角膜緣幹細胞解凍後製備成濃度為1×106個細胞/ml的角膜緣上皮細胞懸液，用微量吸管仔細滴加到羊膜上皮基底膜上，加入無飼養層的角膜上皮培養液，角膜上皮培養液配方為DMEM/F12基礎培養液，添加20％ FBS，20ng/mlEGF，5ug/ml insulin，0.5％DMSO和100Iu/ml青黴素100ug/ml鏈黴素，移入CO2培養箱培養，培養至8～10天，將支架從培養板底剝離，繼續懸浮培養5～7天，待細胞成復層生長即停止培養，即得到準備移植的人工角膜上皮植片。
上述不同的環境溫度下凍存角膜緣幹細胞保存時間為4℃條件下冰箱保存時間為12-48h；-20℃條件下冰箱保存時間為7d，-80℃條件下冰箱保存時間1-1.5個月，-196℃液態條件下保存時間大於6個月。
採用本發明構建的人工角膜上皮植片，自體移植到角膜緣幹細胞缺失的角膜表面，可成功重建角膜緣幹細胞缺損的角膜上皮，在臨床上用於角膜上皮缺損重建與康復，具有廣泛的應用潛力。
圖1為山羊角膜緣幹細胞圖；圖2為解凍後培養的山羊角膜緣幹細胞圖；圖3為解凍後培養的人角膜緣幹細胞圖；圖4為細胞在形成與在體時相似的3～5層細胞結構圖；圖5為在羊膜上的角膜緣幹細胞間形成完整的橋粒結構圖；圖6為人工角膜上皮植片圖；圖7為角膜緣幹細胞缺失的病理模型圖；圖8為角膜上皮植片移植後復明效果明顯的圖片。
具體實施例方式
以下結合附圖和發明人依照上述技術方案完成的實施例對本發明作進一步的詳細描述。
實施例1角膜緣幹細胞的保存與無飼養層構建角膜上皮(以關中奶山羊為例)關中奶山羊獸用846合劑(解放軍農牧大學獸藥廠)2.4ml麻醉，雙抗生理鹽水(自製)衝洗結膜囊和角膜表面，鹽酸利多卡因5ml(上海禾豐製藥有限公司)5ml，布比卡因(上海禾豐製藥有限公司)5ml球後麻醉。鋪無菌洞巾，開瞼器(江蘇六六視覺有限公司)開瞼，在眼科手術顯微鏡(江蘇六六視覺有限公司)下，無菌切取上側角膜緣上皮(帶少量角膜緣基質)，置1.2IU dispase(Gibco Lot No.1126857)中冷消化14-16h，移入DMEM/F12(Gibco Lot No.1107011)+10％NBS(北京元亨聖馬生物技術研究所產品)培養液中終止消化，將已消化好的上皮層與基底層剝離，上皮層用吸管反覆吹打離散細胞，1000r/min離心兩次，每次5min，收集細胞。
細胞以1×105個細胞/ml接種於鋪有0.1％明膠(Sigma，Lot50K02505)的六孔塑料板(CELLSTAR Lot02030151)中，加入含有20％FBS，20ng/mlEGF(表皮細胞生長因子，Sigma，Number E 9644)，5ug/ml insulin(胰島素，購自北京鼎國生物技術有限責任公司，Sigma分裝，原產品編號為15500)，0.5％DMSO和100Iu/ml青黴素(哈藥集團製藥總廠，批號B01124412)100ug/ml鏈黴素(華北製藥股份有限公司，批號01072)的DMEM/F12培養液，5％CO2，飽和溼度CO2培養箱(WTB CO2培養箱，美國)37℃培養，每2天換一次培養液，培養至7～9天，形成密集的單層(圖1)。傳代應在80％～90％細胞開始匯合時進行，用0.125％胰蛋白酶(1∶250，華美生物工程公司)+0.01％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)消化細胞，以1×105個細胞/ml的濃度傳代。本發明所用的凍存細胞為2～4代角膜緣幹細胞，加入冷凍保護液(DMEM/F12+10％DMSO+10％ FBS)，分別在4℃，-20℃、-80℃冰箱和-196℃液態氮中保存。凍存時記錄好角膜緣幹細胞的來源，以便於以後進行對應的角膜自體移植。
在不同時間內解凍上述條件下保存的細胞，臺盼藍染色檢測細胞的活力，那些有85％細胞仍然存活的，經體外可繼續擴增，細胞形態與凍存前基本相似的細胞(圖2)，免疫組化檢測角膜緣幹細胞分子標記CK19(角蛋白19，Sigma，sigma-aldrich.com，Product Number C 6930)、P63(Santa CruzBiotechnology，Inc.4A4sc-8431)、PCNA(武漢博士德生物工程有限公司SA2024)、CK3/K12(United States Biological Inc.Lot No 3051563)，具體操作按北京中山生物試劑有限公司免疫組化染色試劑盒(SP-9000/9001/9002)說明書進行。那些細胞分子標記仍為CK19、P63和PCNA陽性，CK3/K12陰性的細胞，可以認為仍具有角膜緣幹細胞特性。在4℃可保存12-48h、-20℃保存1-7d、-80℃保存1-1.5個月、-196℃液態氮保存至少6個月以上，設想可長期保存。可以滿足在不同的實驗條件下，對角膜緣幹細胞的運輸、保存和增殖的要求。
將已去上皮的羊膜粘附到一個特製的支架(硝酸纖維素膜Sigma，sigma-aldrich.com改制而成)上，放入六孔板中，37℃乾燥30min～60min，使羊膜和支架與六孔板底粘附牢固後，取上述任一條件下保存的角膜緣幹細胞製備成濃度為1×106個細胞/ml角膜緣上皮細胞懸液，用微量吸管仔細滴加到羊膜上皮基底膜上，勿使細胞流出羊膜表面，37℃恆溫操作臺上靜止20min，加入少量培養液(DMEM/F12基礎培養液添加20％FBS，20ng/mlEGF，5ug/ml insulin，0.5％DMSO和100Iu/ml青黴素100ug/ml鏈黴素)，移入CO2培養箱中過夜，第二天待細胞粘附於羊膜上開始增殖時，再向每孔加入2ml培養液培養。隔日換一次培養液，培養至8～10天，輕輕將支架從培養板底剝離，加入培養液使羊膜與支架懸浮於培養液中。繼續培養5～7天，細胞成復層生長，表面有細胞開始脫落時，停止培養。固定後，用於組織學和電鏡檢查，結果組織學檢查可見羊膜上細胞形成與在體時相似的3～5層細胞結構(如圖4)，PAS染色未見杯狀細胞，透射電鏡觀察可見細胞間形成較完整的橋粒結構(如圖5)，細胞與羊膜間形成半橋粒結構，說明細胞在羊膜上已建立基底膜。
將解凍後的細胞在人羊膜支架上擴增培養後，移植構建的人工角膜上皮植片(如圖6)到角膜緣幹細胞缺失的病理模型(如圖7)山羊角膜表面後，復明效果明顯(如圖8)。說明本發明所構建的組織工程角膜上皮在臨床上具有廣泛的應用潛力。
實施例2人的角膜緣幹細胞的保存與無飼養層構建角膜上皮取患有角膜緣缺損病人同側或對側2-4mm2大小的角膜緣上皮，在200×10-3U/L青黴素和質量濃度為200mg/L鏈黴素生理鹽水中浸泡15-20min，帶入無菌室。PBS(-)衝洗數遍。體視顯微鏡(Leica公司)下，進一步板層分離角膜上皮後，置1.2IU dispase中冷消化12-14h，放入PBS(-)洗一遍，移入DMEM/F12+10％NBS培養液中終止消化，用細胞刮刀(Nunc.Inc.USA)輕輕刮下已消化好的上皮層，吸管反覆吹打離散細胞。1000r/min離心兩次，每次5min，收集細胞。
以後的實施方法與實施1相同。圖3為凍存後的人角膜緣幹細胞。
權利要求
1.凍存自體角膜緣幹細胞的無飼養層構建角膜上皮方法，其特徵在於，將自體角膜緣幹細胞體外長期保存，並用保存的角膜緣幹細胞採用無飼養層的方法構建角膜上皮植片，實現臨床上角膜緣幹細胞缺損後的角膜上皮自體重建；包括以下步驟1)首先採用dispase冷消化角膜緣上皮組織，使之與上皮基底膜很好地分離，獲取含較多角膜緣幹細胞的角膜上皮細胞，在鋪有明膠的六孔塑料培養板上培養擴增出角膜緣幹細胞，對角膜緣幹細胞的分子標記進行免疫組化檢測當CK19、P63和PCNA陽性，CK3/K12陰性時，證明所獲得的細胞為角膜緣幹細胞；2)將角膜緣幹細胞用酶消化後，加入冷凍保護液後置於不同的環境溫度中凍存，保護液配方DMEM/F12+10％DMSO+10％FBS，凍存時記錄角膜緣幹細胞的來源，以便進行對應的角膜自體移植，凍存後的角膜緣幹細胞仍具有角膜緣幹細胞特性，體外可繼續擴增；3)將已去上皮的人羊膜粘附到一個特製的支架上，放入六孔板中，37℃乾燥30min～60min後，使羊膜與六孔板底和支架粘附牢固，取凍存的角膜緣幹細胞解凍後製備成濃度為1×106個細胞/ml的角膜緣上皮細胞懸液，用微量吸管仔細滴加到羊膜上皮基底膜上，加入無飼養層的角膜上皮培養液，角膜上皮培養液配方為DMEM/F12基礎培養液，添加20％FBS，20ng/mlEGF，5ug/ml insulin，0.5％DMSO和100Iu/ml青黴素100ug/ml鏈黴素，移入CO2培養箱培養，培養至8～10天，將支架從培養板底剝離，繼續懸浮培養5～7天，待細胞成復層生長即停止培養，即得到準備移植的人工角膜上皮植片。
2.如權利要求1所述的凍存自體角膜緣幹細胞的無飼養層構建角膜上皮方法，其特徵在於，所述凍存角膜緣幹細胞的不同環境溫度保存時間為4℃條件下冰箱保存時間為12-48h；-20℃條件下冰箱保存時間為7d，-80℃條件下冰箱保存時間1-1.5個月，-196℃液態條件下保存時間大於6個月。
全文摘要
本發明公開了一種凍存自體角膜緣幹細胞的無飼養層構建角膜上皮方法，將自體角膜緣幹細胞體外長期保存，可以滿足在不同的實驗條件下，對角膜緣幹細胞的運輸、保存和增殖的要求。並用保存的角膜緣幹細胞採用無飼養層的方法構建角膜上皮植片，實現臨床上角膜緣幹細胞缺損後的角膜上皮自體重建；本發明能夠成功構建的人工角膜上皮植片，自體移植到角膜緣幹細胞缺失的角膜表面，復明效果明顯。在臨床上具有廣泛的應用潛力。
文檔編號C12N5/08GK1580248SQ20041002615
公開日2005年2月16日 申請日期2004年5月20日 優先權日2004年5月20日
發明者屈雷, 王馨, 竇忠英 申請人:西北農業科技大學