硫酸軟骨素鈉的製備方法與流程

2023-07-13 02:40:06

本發明屬於生物製藥
技術領域：
，具體涉及一種硫酸軟骨素鈉的製備方法。
背景技術：
：硫酸軟骨素鈉是從動物組織中提取的一種酸性粘多糖類物質，多存在於動物的軟骨、喉骨、鼻骨、牛馬中膈和氣管中，其分子結構為β-d-葡萄糖醛酸和n-乙醯氨基半乳糖通過β1→3糖苷鍵形成的重複二糖單位所組成的多糖鏈。硫酸軟骨素鈉主要用於治療風溼和類風溼疾病的藥物，還具有抗凝、抗癌、抗血栓、降血脂等作用，可用於治療頭痛、偏頭痛、冠心病、心絞痛等症狀。目前硫酸軟骨素鈉採用的是鹼鹽消化沉澱法，即軟骨經鹼化後，酶解、過濾後用酒精直接沉澱，按此方法生產硫酸軟骨素鈉含量和純度均較低。技術實現要素：針對現有技術中的上述不足，本發明提供了一種硫酸軟骨素鈉的製備方法，可有效解決現有技術生產硫酸軟骨素鈉含量和純度均較低的問題。為實現上述目的，本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：一種硫酸軟骨素鈉的製備方法，包括以下步驟：(1)提取：將豬軟骨和水按重量比為1:3-5混合，加熱煮沸20-40min，然後加入2-3％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調節ph值至8-11；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入複合酶，混合，在以超聲為介質的條件下進行酶解，超聲時間為20-30min，超聲功率為250-300w，單次超聲時間為2-4s，超聲時間與間歇時間比為2-5:1，然後離心，過濾，得濾液；其中，所添加的複合酶佔步驟(1)所得物重量的2-5％；(3)微波提取：向步驟(2)所得濾液中繼續加入複合酶，混合，然後置於微波提取器中提取，微波功率為250-300w，提取時間為5-10min；其中，所添加的複合酶佔步驟(2)所得物重量的1-3％；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調節ph值至8-10，置於50-60℃條件下攪拌40-60min，再用鹽酸調節ph值至6-6.5，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶佔步驟(3)所得物重量的2-4％；(5)沉澱：將步驟(4)所得濾液溫度維持在50-60℃，加入95％乙醇，靜置至沉澱量不再增加，過濾，得沉澱物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為2-3:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉澱物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調節ph值至8-10，再將溶液升溫至35-40℃，加雙氧水靜置氧化脫色2-3h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質量濃度為2-5％，沉澱物佔氯化鈉溶液重量的10-15％，雙氧水佔氯化鈉溶液的0.5-0.8％；(7)沉澱：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調節ph值至5.8-6.0，然後加乙醇使沉澱度數達60-70度，沉澱5-8h，再向沉澱物中加乙醇，使沉澱度數達80-90度，沉澱5-8h，收集沉澱物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉澱物中加75％乙醇浸泡2次，真空乾燥，得硫酸軟骨素鈉成品。進一步地，步驟(2)中所添加的複合酶佔步驟(1)所得物重量的3％。進一步地，複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為6-8:0.8-1.2:0.2-0.4混合的混合物。進一步地，複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為8:1.0:0.2混合的混合物。進一步地，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g。進一步地，步驟(2)中超聲時間為30min，超聲功率為280w，單次超聲時間為3s，超聲時間與間歇時間比為4:1。進一步地，步驟(3)中微波功率為280w，提取時間為8min。進一步地，步驟(3)中所添加的複合酶佔步驟(2)所得物重量的1.8％。進一步地，步驟(4)中所添加的蛋白酶佔步驟(3)所得物重量的2.5％。進一步地，步驟(7)中加乙醇使沉澱度數達65度，沉澱8h，再向沉澱物中加乙醇，使沉澱度數達80度，沉澱6h。本發明提供的一種硫酸軟骨素鈉的製備方法，具有以下有益效果：利用超聲波提取硫酸軟骨素鈉主要是運用超聲波的機械效應和空化作用。超聲波的機械作用可促成液體的乳化、凝膠的液化和固體的分散，當超聲波流體介質中形成駐波時，懸浮在流體中的微小顆粒因受機械力的作用而凝聚在波節處，在空間形成周期性的堆積；超聲波的空化作用是指超聲波作用於液體的時候可以產生大量小氣泡，一個原因是由於液體內局部出現拉應力而形成負壓，壓強的降低使原來溶於液體的氣體過飽和，而從液體逸出，成為小氣泡；另一個原因是由於強大的拉應力把液體「撕開」成一空洞，成為空化。空洞內為液體蒸汽或溶於液體的另一種氣體，甚至可能是真空，因為空化作用形成的小氣泡會隨周圍介質的振動而不斷運動，長大或突然破滅，破滅時周圍液體突然衝入氣泡而產生高溫、高壓，同時產生激波，這種作用力能破壞細胞膜的結構，使細胞在瞬間破裂，超聲波的這些作用都有助於硫酸軟骨素鈉的提取。在超聲波為介質的條件下酶解，即將超聲波導入溶液中，在超聲波破壞細胞膜的情況下，通過酶解過程使細胞內的硫酸軟骨素鈉和蛋白質分離，肝素保留於溶液中，而蛋白質成為固體雜渣，通過離心過濾，便可將硫酸軟骨素鈉與蛋白質初步分離。此過程所用的酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶混合的複合酶，三者酶按照特定的比例關係複合，有利於去除與硫酸軟骨素鈉連接的蛋白質，並且在酶解過程不需額外加熱，便可將蛋白質去除。將超聲波酶解後所得濾液在微波場的作用下引起強烈的極性震蕩，從而導致細胞分子間氫鍵鬆弛，細胞膜結構電擊穿破裂，加速了細胞膜的通透性，從而有助於硫酸軟骨素鈉的提取。在超聲波震蕩前，向濾液中加入了複合酶，然後一起進行超聲波振動，使其在破壞細胞膜結構，增加細胞膜通透性的情況下，直接用複合酶對連接硫酸軟骨素鈉的蛋白質進行酶解，使其與硫酸軟骨素鈉得到進一步的分離。經過超聲波酶解和微波提取過程後，硫酸軟骨素鈉上還連接有蛋白質，通過進一步的蛋白質酶解過程，使其剩餘蛋白質得到更好的去除，有利於提供硫酸軟骨素鈉的純度和收率。超聲波酶解、微波提取和蛋白質酶解，三個過程依次進行，協同將硫酸軟骨素鈉從豬軟骨上提取出來，提高其收率和純度。步驟(5)沉澱過程中濾液溫度要維持在50-60℃，可使硫酸軟骨素鈉緩慢沉澱，減少蛋白雜質與硫酸軟骨素鈉共沉澱現象，操作時加乙醇速度要慢，邊加邊攪拌，可減少硫酸軟骨素鈉沉澱時對蛋白質的包裹。通過上述環環相扣的步驟，使得硫酸軟骨素鈉的產量和純度得以顯著提高，降低了生產成本，提高了經濟效益。具體實施方式實施例1一種硫酸軟骨素鈉的製備方法，包括以下步驟：(1)提取：將豬軟骨和水按重量比為1:3混合，加熱煮沸30min，然後加入2％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調節ph值至10；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入複合酶，混合，在以超聲為介質的條件下進行酶解，超聲時間為30min，超聲功率為250w，單次超聲時間為2s，超聲時間與間歇時間比為2:1，然後離心，過濾，得濾液；其中，所添加的複合酶佔步驟(1)所得物重量的5％；複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提取：向步驟(2)所得濾液中繼續加入複合酶，混合，然後置於微波提取器中提取，微波功率為250w，提取時間為10min；其中，所添加的複合酶佔步驟(2)所得物重量的1％；複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調節ph值至10，置於60℃條件下攪拌40min，再用鹽酸調節ph值至6.5，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶佔步驟(3)所得物重量的2％；(5)沉澱：將步驟(4)所得濾液溫度維持在60℃，加入95％乙醇，靜置至沉澱量不再增加，過濾，得沉澱物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為2:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉澱物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調節ph值至10，再將溶液升溫至40℃，加雙氧水靜置氧化脫色2h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質量濃度為2％，沉澱物佔氯化鈉溶液重量的10％，雙氧水佔氯化鈉溶液的0.5％；(7)沉澱：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調節ph值至6.0，然後加乙醇使沉澱度數達60度，沉澱5h，再向沉澱物中加乙醇，使沉澱度數達80度，沉澱5h，收集沉澱物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉澱物中加75％乙醇浸泡2次，真空乾燥，得硫酸軟骨素鈉成品。實施例2一種硫酸軟骨素鈉的製備方法，包括以下步驟：(1)提取：將豬軟骨和水按重量比為1:5混合，加熱煮沸40min，然後加入3％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調節ph值至11；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入複合酶，混合，在以超聲為介質的條件下進行酶解，超聲時間為30min，超聲功率為300w，單次超聲時間為4s，超聲時間與間歇時間比為5:1，然後離心，過濾，得濾液；其中，所添加的複合酶佔步驟(1)所得物重量的2％；複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提取：向步驟(2)所得濾液中繼續加入複合酶，混合，然後置於微波提取器中提取，微波功率為300w，提取時間為10min；其中，所添加的複合酶佔步驟(2)所得物重量的3％；複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調節ph值至10，置於50℃條件下攪拌60min，再用鹽酸調節ph值至6，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶佔步驟(3)所得物重量的4％；(5)沉澱：將步驟(4)所得濾液溫度維持在50℃，加入95％乙醇，靜置至沉澱量不再增加，過濾，得沉澱物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為3:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉澱物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調節ph值至10，再將溶液升溫至35℃，加雙氧水靜置氧化脫色3h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質量濃度為5％，沉澱物佔氯化鈉溶液重量的15％，雙氧水佔氯化鈉溶液的0.8％；(7)沉澱：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調節ph值至5.8，然後加乙醇使沉澱度數達70度，沉澱8h，再向沉澱物中加乙醇，使沉澱度數達90度，沉澱5h，收集沉澱物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉澱物中加75％乙醇浸泡2次，真空乾燥，得硫酸軟骨素鈉成品。實施例3一種硫酸軟骨素鈉的製備方法，包括以下步驟：(1)提取：將豬軟骨和水按重量比為1:5混合，加熱煮沸40min，然後加入2.5％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調節ph值至11；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入複合酶，混合，在以超聲為介質的條件下進行酶解，超聲時間為30min，超聲功率為280w，單次超聲時間為3s，超聲時間與間歇時間比為4:1，然後離心，過濾，得濾液；其中，所添加的複合酶佔步驟(1)所得物重量的3％；複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提取：向步驟(2)所得濾液中繼續加入複合酶，混合，然後置於微波提取器中提取，微波功率為280w，提取時間為8min；其中，所添加的複合酶佔步驟(2)所得物重量的1.8％；複合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質量比為8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調節ph值至10，置於55℃條件下攪拌50min，再用鹽酸調節ph值至6.5，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶佔步驟(3)所得物重量的2.5％；(5)沉澱：將步驟(4)所得濾液溫度維持在55℃，加入95％乙醇，靜置至沉澱量不再增加，過濾，得沉澱物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為3:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉澱物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調節ph值至10，再將溶液升溫至37℃，加雙氧水靜置氧化脫色3h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質量濃度為3％，沉澱物佔氯化鈉溶液重量的12％，雙氧水佔氯化鈉溶液的0.6％；(7)沉澱：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調節ph值至6.0，然後加乙醇使沉澱度數達65度，沉澱8h，再向沉澱物中加乙醇，使沉澱度數達80度，沉澱6h，收集沉澱物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉澱物中加75％乙醇浸泡2次，真空乾燥，得硫酸軟骨素鈉成品。實施例1-3所製得的硫酸軟骨素鈉成品色澤潔白，粉末疏鬆，收率達32％以上，降低了生產成本，提高了經濟效益。將實施例1-3所得硫酸軟骨素鈉成品進行分析，結果如下：實施例1實施例2實施例3比旋度-26.1°-26.9°-27.8°420nm吸光度0.1940.1890.163酸度6.626.536.41總氮量3.0％2.9％2.8％乾燥失重9.0％8.3％8.0％熾灼殘渣27.8％26.1％25.2％有機殘留3771ppm3002ppm2558ppmcpc含量95.5％96.2％96.7％hplc含量93.1％95.2％97.5％當前第1頁12