多態性檢測用探針、多態性檢測方法、藥效評價方法、疾病預測方法以及多態性檢測用試劑盒的製作方法
2023-08-10 12:10:26 2
專利名稱：多態性檢測用探針、多態性檢測方法、藥效評價方法、疾病預測方法以及多態性檢測用試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及多態性檢測用探針、多態性檢測方法、藥效評價方法、疾病預測方法以及多態性檢測用試劑盒。
背景技術：
—直以來,作為高尿酸血症的治療祀標分子，已知作為尿酸重吸收轉運子的Urate轉運子(URAT1/SLC22A12)、葡萄糖轉運子 9 (GLIT9/SLC22A12)。 近年來，明確了由也被稱為 BCRP (breast cancer resistance protein)的ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member 2)基因編碼高容量性的排尿轉運子。另外，受到ABCG2基因的多態性的存在與痛風的發病風險的增加有關的啟發，明確了 ABCG2基因是痛風的主要致病基因(例如，參見實驗醫學2010年，第28卷，第8號，p.1285-1289)。另外，還受到ABCG2基因的多態性的存在與胎盤中的蛋白質表達異常有關聯(例如，參見Drug. Metab. Dispos.，2005年，第33卷，第I號，p. 94-101)的啟示啟發，人們期待短時間、低成本並且簡便地測定ABCG2基因的多態性的方法。作為測定基因的多態性的方法，已知有使用被設計為擴增含有想要測定的鹼基的部分的引物進行PCR，用能夠以該特定鹼基中有無突變來區分是否切斷的限制性內切酶來切斷，之後用電泳檢測是否切斷了的方法(PCR-RFLP法)(例如，參見Genet. Mol. Res. ,2010年，第9卷，第I號，p. 34-40)。另外，還已知有在用PCR法擴增了含有突變的區域之後，使用螢光染料標記的核酸探針進行熔解曲線分析，並基於熔解曲線分析的結果來分析鹼基序列的突變的方法(例如，參見日本專利文獻特開2002-119291號公報)。但是，在PCR-RFLP法中，在PCR反應之後需要提取擴增產物來進行限制性內切酶處理。因此，擴增產物有可能混入下一反應體系，由此有可能獲得假陽性、假陰性的結果。另夕卜，由於在PCR結束後用限制性內切酶進行處理，之後進行電泳，因此有時到檢測為止需要的時間非常長。而且，由於操作複雜，難以自動化。因此，期望進一步開發用於ABCG2基因多態性檢測的技術。
發明內容
發明要解決的問題本發明要解決的問題在於提供能夠高靈敏度且簡便地檢測ABCG2基因的多態性的多態性檢測用探針、使用該探針的多態性檢測方法。另外，本發明要解決的問題在於提供使用了該檢測方法的藥效評價方法和疾病預測方法。此外，本發明要解決的問題還在於提供使用了該檢測用探針的多態性檢測用試劑盒。用於解決問題的手段
用於解決上述問題的具體手段如下。 一種ABCG2基因的多態性檢測用探針，含有從包括下述P1、P1』、P2、P2』、P3和P3』的組中選擇的至少一種螢光標記寡核苷酸(Pl)寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的鹼基序列中的第301位 第311位鹼基的鹼基長為11 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第311位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第311位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記；(P1』)寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的鹼基序列中的第301位 第311位鹼基的鹼基長為11 50的鹼基序列互補的序列，該序列與除了與第311位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號I相同的鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第311 位喊基對應的喊基用突光染料標記；(P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的鹼基序列中的第234位 第251位鹼基的鹼基長為18 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第251位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號2互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第251位喊基對應的喊基用突光染料標記；(P2』)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的鹼基序列中的第234位 第251位鹼基的鹼基長為18 50的鹼基序列互補的序列，該序列與除了與第251位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號2相同的鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第251位喊基對應的喊基用突光染料標記；(P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的鹼基序列中的第152位 第161位鹼基的鹼基長為10 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第152位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號3互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第152位喊基對應的喊基用突光染料標記；以及(P3』)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的鹼基序列中的第152位 第161位鹼基的鹼基長為10 50的鹼基序列互補的序列，該序列與除了與第152位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號3相同的鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第152位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記。 根據〈1>所述的多態性檢測用探針，其中，所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第311位鹼基位於從5』末端起數第I位 第3位的任何位置,所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第251位鹼基位於從5』末端起數第I位 第3位的任何位置,所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第152位鹼基位於從3』末端起數第I位 第3位的任何位置。〈3>根據〈1>或〈2>所述的ABCG2基因的多態性檢測用探針，其中，所述Pl或P1』突光標記寡核苷酸的被突光染料標記的第311位鹼基位於5』末端,所述P2或P2』突光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第251位鹼基位於5』末端，所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的被突光染料標記的第152位鹼基位於3』末端。根據〈1> 〈3>中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述螢光標記寡核苷酸與靶標序列雜交時的螢光強度比未與靶標序列雜交時的螢光強度減少或增加。根據〈1> 〈4>中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述螢光標記寡核苷酸與靶標序列雜交時的螢光強度比未與靶標序列雜交時的螢光強度減少。〈6>根據 中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為11 40，所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為18 40，所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為10 40。根據〈1> 〈6>中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為11 28，所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為20 30，所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為15 30。根據〈1> 〈7>中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為14 18，所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為22 26，所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為18 22。 根據〈1> 〈8>中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述多態性檢測用探針為熔解曲線分析用的探針。 一種ABCG2基因的多態性檢測方法，其使用〈1> 〈9>中任一項所述的多態性檢測用探針。根據〈10>所述的多態性檢測方法，其使用從包括〈1> 〈9>中任一項所述的所述P1、P1』、P2、P2』、P3和P3』的組中選擇的至少兩種多態性檢測用探針。根據權利要求10或11所述的多態性檢測方法，包括(I)使〈1> 〈9>中任一項所述的多態性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述螢光標記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體；(II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，並測定基於所述雜交體的解離的螢光信號的變動；(III)基於所述螢光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值。(IV)基於所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCG2基因中的多態性的存在。〈13>根據權利要求12所述的多態性檢測方法，還包括在所述(I)的獲得雜交體之前或者與(I)的獲得雜交體的同時擴增核酸。 一種藥劑的藥效判定方法，包括通過〈10> 〈13>中任一項所述的多態性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態性；以及基於檢測到的多態性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。 一種疾病預測方法，包括通過〈10> 〈13>中任一項所述的多態性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態性；以及基於檢測到的多態性的有無來預測疾病的罹患風險。 一種多態性檢測用試劑盒，包含權利要求I至9中任一項所述的多態性檢測用探針。根據〈16>所述的多態性檢測用試劑盒，還包含下述引物對中的至少一者能夠擴增含有序列編號I所示的鹼基序列中的、與所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸雜交的序列的區域的引物對；能夠擴增含有序列編號2所示的鹼基序列中的、與所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸雜交的序列的區域的引物對；以及能夠擴增含有序列編號3所示的鹼基序列中的、與所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸雜交的序列的區域的引物對。發明效果通過本發明，能夠提供可高靈敏度且簡便地檢測ABCG2基因的多態性的多態性檢測用探針、使用該探針的多態性檢測方法。另外，通過本發明，能夠提供使用了該檢測方法的藥效評價方法和疾病預測方法。此外，通過本發明還能夠提供使用了該檢測用探針的多態性檢測用試劑盒。
圖I的(A)是示出核酸混合物的熔解曲線的示例的圖，以及圖I的(B)是示出微 分熔解曲線的示例的圖；圖2的(A)和⑶是使用本發明實施例1-1涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖3是使用本發明實施例1-2涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖4的(A) (H)是使用本發明實施例2涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖5的(A) (C)是使用本發明實施例3涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖6的(A) (C)是使用本發明實施例4涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖7的(A) (C)是使用本發明實施例4涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖8的(A)和(B)是使用本發明比較例I涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖9是使用本發明比較例I涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖10的(A) ⑶是使用本發明比較例2涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖11的(A) (C)是使用本發明比較例3涉及的多態性檢測用探針而獲得的熔解曲線。
具體實施例方式本發明的探針是ABCG2基因的多態性檢測用探針，其含有從包括P1、P1』、P2、P2』、P3和P3』的組中選擇的至少一種螢光標記寡核苷酸。通過本發明，能夠高靈敏度且簡便地檢測ABCG2基因的多態性。ABCG2基因的鹼基序列相當於與GeneID :9429,GenBank登錄號No. 000004(版本000004. 11)相當的序列中的第89011415位鹼基 第89080010位鹼基的序列。本說明書中，將該第89011415位鹼基 第89080010位鹼基的序列作為「ABCG2基因的鹼基序列」。本發明中，關於作為檢測對象的試樣中的試樣核酸、多態性檢測用探針或者引物的每個的序列，基於它們的相互互補的關系所記述的事項，只要不特別指出，也適用於各個序列和相對於各序列互補的序列。在將本發明的事項適用於相對於各序列互補的該序列時，在本領域技術人員的技術常識的範圍內，由該互補的序列識別的序列視為將說明書全體替換為與對應的本說明書中記載的序列互補的序列。在本發明中，「Tm值」是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。即，當加熱含有雙鏈核酸、例如雙鏈DNA的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈核酸DNA中的兩條雙鏈之間的氫鍵由於加熱而斷裂，解離成單鏈DNA (DNA的熔解)。並且，全部雙鏈核酸DNA解離成單鏈DNA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈核酸DNA的吸光度)的約I. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成。Tm值基於該現象而設定。在本發明中，關於寡核苷酸的序列，當稱為「從3』末端起數的第I 3位」時為以寡核苷酸鏈的3』末端為第I位起數的。同樣地，當稱為「從5』末端起數的第I 3位」時 為以寡核苷酸鏈的5』末端為第I位起數的。在本說明書中，「步驟」 一詞不僅包含獨立的步驟，即使在不能與其他的步驟明確區別的情況下只要達到了本步驟預期的效果，則包含在本術語之內。另外，在本說明書中，使用「 」表示的數值範圍為將「 」的前後記載的數值分別作為最小值和最大值包含的範圍。另外，在本發明中，組成物中的各成分的量在所述組成物中存在多種相當於各成分的物質的情況下，只要不特別指出，是指所述組成物中存在的該多種物質的合計量的意思。下面說明本發明。本發明的多態性檢測用探針(以下，有時僅稱為「探針」)包含從由包括下述P1』、P2、P2』、P3和P3』的組中選擇的至少一種螢光標記寡核苷酸(以下，有時僅稱為「螢光標記
寡核苷酸」)。(Pl)寡核苷酸，其為與含有序列編號I所示的鹼基序列中的第301位 第311位鹼基的鹼基長為11 50的鹼基序列互補的序列，該序列和除了與第311位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第311位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記；(P1』 )寡核苷酸，其為與含有序列編號I所示的鹼基序列中的第301位 第311位鹼基的鹼基長為11 50的鹼基序列互補的序列，該序列和除了與第311位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號I相同鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第311位喊基對應的喊基用突光染料標記；(P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的鹼基序列中的第234位 第251位鹼基的鹼基長為18 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第251位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號2互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第251位喊基對應的喊基用突光染料標記；(P2』 )寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的鹼基序列中的第234位 第251位鹼基的鹼基長為18 50的鹼基序列互補的序列，該序列和除了與第251位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號2相同鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第251位喊基對應的喊基用突光染料標記；
(P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的鹼基序列中的第152位 第161位鹼基的鹼基長為10 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第152位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號3互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第152位喊基對應的喊基用突光染料標記；以及(P3』 )寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的鹼基序列中的第152位 第161位鹼基的鹼基長為10 50的鹼基序列互補的序列，該序列和除了與第152位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號3相同鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第152位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記。通過含有至少一種上述特定的螢光標記寡核苷酸，能夠更高靈敏度且簡便地第檢測ABCG2基因的多態性。 序列編號I所不的喊基序列為ABCG2基因的喊基序列的一部分，對應於ABCG2基因的第I位 第68595位鹼基中的第18597位 第19196位的601個鹼基。在ABCG基因的野生型中，與序列編號I所示的鹼基序列的第301位對應的鹼基為G (鳥嘌呤)，而在突變型中突變成A (腺嘌呤)。另外，在野生型的ABCG2基因中，ABCG2轉運子的胺基酸序列中的第12位的胺基酸為纈氨酸(Val)，而在突變型的ABCG2基因中，為蛋氨酸(Met)(以下稱為「V12M突變」)。另外，在所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸中，「與第311位鹼基對應的鹼基」是與序列編號I所示的鹼基序列中的第311位鹼基G(鳥嘌呤)互補的鹼基C(胞嘧啶)。在所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸中，該被螢光標記的互補的鹼基C能夠存在於從5』末端起數第I位 第3位的任何位置。另外，能夠存在於5』末端。由此，例如多態性檢測靈敏度進一步提高。另外，能夠生產性良好地獲得Pl螢光標記寡核苷酸。所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸是能夠檢測序列編號I所示的鹼基序列的第301位鹼基的多態性的探針。該鹼基的野生型為G，突變型為A。所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長需為11 50。在鹼基長為10以下或51以上的情況下，ABCG2基因多態性的檢測靈敏度降低。另外，從多態性檢測靈敏度的觀點來說，所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長可以為11 40、11 28或14 18。另外，通過改變所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長，例如能夠將由Pl或P1』螢光標記寡核苷酸與其互補鏈(靶標序列)形成的雜交體的解離溫度、即Tm值調節到期望的值。本發明的所述Pl螢光標記寡核苷酸與除了第311位的鹼基為鳥嘌呤之外和序列編號I所示的鹼基序列互補的序列具有同源性。具體地，本發明的所述Pl螢光標記寡核苷酸相對於與序列編號I所示的鹼基序列互補的鹼基序列具有80%以上的同一性。另外，從檢測靈敏度的觀點來說，也可以顯示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一丨I"生。在將本發明的所述Pl螢光標記寡核苷酸和下述與序列編號I互補的序列進行比較時的同一性低於80%的情況下，對含有突變型的ABCG2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變低，所述與序列編號I互補的序列是除了與第311位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補的序列。本發明的所述P1』螢光標記寡核苷酸與除了第311位鹼基為鳥嘌呤之外具有和序列編號I相同的鹼基的序列在嚴謹條件下雜交。雜交可以根據公知的方法或者基於公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來進行。該文獻通過參考被併入本說明書中。嚴謹條件是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴謹條 件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約I. OmM 約5. OmM中進行雜交的條件。作為本發明的條件的示例，可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下進行雜交的條件,但不限於此。此外，嚴謹條件被記載在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻通過參考被併入本說明書中。本領域技術人員能夠通過改變雜交反應、雜交反應液的鹽濃度等來容易地選擇這樣的條件。以下，在表I中示出本發明的pi或Pr螢光標記寡核苷酸的鹼基序列的示例，但本發明不限於這些。在表I中，與序列編號I的第301位鹼基對應的鹼基用大寫字母表示，並且一併示出與該序列編號I的第301位鹼基對應的鹼基為C、T、A或G時的寡核苷酸與各螢光標記寡核苷酸之間的雜交體的Tm值。這裡Tm 值是使用 Meltcalc 99 free (http://www. meltcalc. com/)在設定條件Oligoconc [ u M] 0. 2、Na eq. [mM] 50 的條件下計算的。表I
權利要求
1.一種ABCG2基因的多態性檢測用探針，含有從包括下述PU PI』、P2、P2』、P3和P3』的組中選擇的至少一種螢光標記寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的鹼基序列中的第301位 第311位鹼基的鹼基長為11 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第311位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第311位喊基對應的喊基用突光染料標記； (Pr )寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的鹼基序列中的第301位 第311位鹼基的鹼基長為11 50的鹼基序列互補的序列，該序列與除了與第311位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號I相同的鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第311位喊基對應的喊基用突光染料標記； (P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的鹼基序列中的第234位 第251位鹼基的鹼基長為18 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第251位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號2互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第251位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記； (P2』 )寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的鹼基序列中的第234位 第251位鹼基的鹼基長為18 50的鹼基序列互補的序列，該序列與除了與第251位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號2相同的鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第251位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記； (P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的鹼基序列中的第152位 第161位鹼基的鹼基長為10 50的鹼基序列互補的序列，該序列相對於除了與第152位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外與序列編號3互補的序列具有至少80%以上的同一性，並且與第152位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記；以及 (P3』 )寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的鹼基序列中的第152位 第161位鹼基的鹼基長為10 50的鹼基序列互補的序列，該序列與除了與第152位鹼基對應的鹼基為鳥嘌呤之外具有與序列編號3相同的鹼基的序列在嚴謹條件下雜交，並且與第152位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記。
2.根據權利要求I所述的多態性檢測用探針，其中， 所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第311位鹼基位於從5』末端起數第I位 第3位的任何位置， 所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第251位鹼基位於從5』末端起數第I位 第3位的任何位置， 所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第152位鹼基位於從3』末端起數第I位 第3位的任何位置。
3.根據權利要求I或2所述的ABCG2基因的多態性檢測用探針，其中， 所述pi或pr螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第311位鹼基位於5』末端， 所述P2或P2』突光標記寡核苷酸的被突光染料標記的第251位鹼基位於5』末端， 所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的被螢光染料標記的第152位鹼基位於3』末端。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述螢光標記寡核苷酸與靶標序列雜交時的螢光強度比未與靶標序列雜交時的螢光強度減少或增加。
5.根據權利要求I至4中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述螢光標記寡核苷酸與靶標序列雜交時的螢光強度比未與靶標序列雜交時的螢光強度減少。
6.根據權利要求I至5中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述Pi或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為11 40，所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為18 40，所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為10 40。
7.根據權利要求I至6中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述Pi或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為11 28，所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為20 30，所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為15 30。
8.根據權利要求I至7中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述Pl或P1』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為14 18，所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為22 26，所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸的鹼基長為18 22。
9.根據權利要求I至8中任一項所述的多態性檢測用探針，其中，所述多態性檢測用探針為熔解曲線分析用的探針。
10.一種ABCG2基因的多態性檢測方法，其使用權利要求I至9中任一項所述的多態性檢測用探針。
11.一種ABCG2基因的多態性檢測方法，其使用從包括權利要求I至9中任一項所述的所述PU PI』、P2、P2』、P3和P3』的組中選擇的至少兩種多態性檢測用探針。
12.根據權利要求10或11所述的多態性檢測方法，包括 (I)使權利要求I至9中任一項所述的多態性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述螢光標記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體； (II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，並測定基於所述雜交體的解離的螢光信號的變動； (III)基於所述螢光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值。
(IV)基於所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCG2基因中的多態性的存在。
13.根據權利要求12所述的多態性檢測方法，還包括所述在所述(I)的獲得雜交體之前或者與(I)的獲得雜交體的同時擴增核酸。
14.一種藥劑的藥效判定方法，包括 通過權利要求10至13中任一項所述的多態性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態性；以及 基於檢測到的多態性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。
15.一種疾病預測方法，包括 通過權利要求10至13中任一項所述的多態性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態性；以及 基於檢測到的多態性的有無來預測疾病的罹患風險。
16.一種多態性檢測用試劑盒，包含權利要求I至9中任一項所述的多態性檢測用探針。
17.根據權利要求16所述的多態性檢測用試劑盒，還包含下述引物對中的至少一者 能夠擴增含有序列編號I所示的鹼基序列中的、與所述pi或Pr螢光標記寡核苷酸雜交的序列的區域的引物對；能夠擴增含有序列編號2所示的鹼基序列中的、與所述P2或P2』螢光標記寡核苷酸雜交的序列的區域的引物對；以及 能夠擴增含有序列編號3所示的鹼基序列中的、與所述P3或P3』螢光標記寡核苷酸雜交的序列的區域的引物對。
全文摘要
本發明提供多態性檢測用探針、多態性檢測方法、藥效評價方法、疾病預測方法以及多態性檢測用試劑盒。ABCG2基因的多態性檢測用探針通過包含下述的寡核苷酸等而構成其為與含有序列編號1所示的鹼基序列中的第301位～第311位鹼基的鹼基長為11～50的鹼基序列互補且具有至少80％以上的同一性，並且與第311位鹼基對應的鹼基用螢光染料標記。
文檔編號C12Q1/68GK102766681SQ20121013201
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月27日 優先權日2011年5月2日
發明者井口亞希, 黑瀬燻 申請人:愛科來株式會社