糖類的分析方法

2023-08-10 05:03:41 1

專利名稱：糖類的分析方法
技術領域：
本發明涉及糖類的分析方法，特別是涉及採用柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離子 交換法的還原糖和甘露糖-6-磷酸的分析方法。。
背景技術：
作為還原糖的分析方法，已知下述方法向將水用作流動相使試樣經液相色譜而 得的洗脫液中加入含精氨酸等鹼性胺基酸的硼酸水溶液，進行加熱反應後冷卻，對該反應 液照射激發光並測定螢光強度或吸光度(專利文獻1)。該方法中所用的裝置是下述裝置 將液相色譜的流出管路延長，在該流路上連接含鹼性胺基酸的硼酸水溶液的供給路徑，其 後安裝有加熱裝置、冷卻裝置、激發光的照射裝置和螢光強度等的測定裝置。該方法中需要 設置用於向經液相色譜而得的洗脫液加入含鹼性胺基酸的硼酸水溶液而使其反應的供給 路徑。此外，作為上述方法的改良型，已知下述方法使試樣經採用含作為反應試劑的 精氨酸等鹼性胺基酸和硼酸的流動相的液相色譜進行洗脫，加熱所得的洗脫液而使反應試 劑與糖類進行反應(加熱反應)後冷卻，對該反應液照射激發光並測定螢光強度或吸光度 (專利文獻2)。該方法中，因為採用含鹼性胺基酸的硼酸水溶液作為液相色譜的流動相，所 以不需要設置用於加入含鹼性胺基酸的硼酸水溶液而使其反應的供給路徑。上述的還原糖 分析法被稱為柱後螢光檢測_硼酸配合物陰離子交換法。上述的還原糖分析法都在檢測中利用了還原糖通過在硼酸的存在下與精氨酸等 鹼性胺基酸的加熱反應生成強螢光衍生物的特性(非專利文獻1)。該螢光衍生物是通過還 原糖與作為胺化合物的鹼性胺基酸的加熱反應、即美拉德反應而生成的呈褐色的類黑精， 該衍生物如果受到作為激發光的波長320nm的光的照射，則發射波長430nm的光。此外，這 些還原糖分析法利用了還原糖具有容易與硼酸結合而生成陰離子性配位離子的性質且該 陰離子性配位離子被保持於陰離子交換色譜的特性。柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離子交換法中，作為流動相，採用含0. 01 5%的濃 度的鹼性胺基酸和0. 05 0. 5M的濃度的硼酸的水溶液(PH7 10)。這時所用的鹼性氨基 酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸等。另外，最近還已知作為液相色譜的流動相使用由0. IM硼緩 衝液和0. 4M硼酸緩衝液形成的梯度來進行糖的分離(專利文獻3、4)。柱後螢光檢測_硼酸配合物陰離子交換法中，液相色譜中的試樣洗脫在室溫 70°C的溫度下進行，而加熱反應、即美拉德反應在140 180°C進行(專利文獻2)。因為在 這樣的高溫下以高硼酸濃度進行洗脫和反應，所以有時流動相中所含的硼酸會析出而堵塞 管道。管道堵塞時就無法進行分析，因此必須經過管道的更換和清洗等費時費力的操作來 重新開始分析。這是柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離子交換法中未解決的重要問題之一。此外，可通過柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離子交換法分析的還原糖有葡萄糖、 甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等單糖，麥芽糖、麥芽三糖等寡糖，葡糖胺、半乳糖胺等氨基 糖，葡糖醛酸等糖醛酸。
作為該方法的分析對象，可以例舉糖蛋白的糖鏈。構成糖蛋白的糖鏈的還原糖有 甘露糖、半乳糖、巖藻糖等中性糖和半乳糖胺等氨基糖等。糖鏈有時還包含甘露糖被1分子 的磷酸修飾而得的甘露糖-6-磷酸(M6P)。
糖蛋白的糖鏈中所含的M6P具有在蛋白質被攝入細胞內時與細胞膜上的甘露 糖-6-磷酸受體結合而促進該攝入的重要功能。作為糖鏈中含M6P的糖蛋白，已知局部存在 於溶酶體中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)等溶酶體酶(非專利文獻2)。溶酶體酶中有 使用重組技術製成的酶，被用作該酶的遺傳性缺失的患者的治療藥，例如α-半乳糖苷酶A 和葡糖腦苷脂酶。溶酶體酶由於在細胞內發揮功能，因此為了使通過靜脈注射等方法給予 患者的溶酶體酶發揮藥效，溶酶體酶必須被攝入患者的細胞內，因而需要在溶酶體酶的糖 鏈中包含Μ6Ρ。因此，進行構成這樣的酶的糖鏈的糖類時，對Μ6Ρ的分析是特別重要的。柱 後螢光檢測-硼酸配合物陰離子交換法可以用作各種糖類的分析技術，但尚未確立採用該 方法的Μ6Ρ的分析技術。專利文獻1 日本專利特開昭58-216953號公報專利文獻2 日本專利特開昭61-25059號公報專利文獻3 日本專利特開2006-184131號公報專利文獻4 日本專利特開2008-245550號公報非專利文獻1 =Mikami H.等，《分析化學》(1983)32，Ε207非專利文獻2 :Bielicki J.等，Biochem J. (1993)289,241-246專利文獻

發明內容
在上述背景下，本發明的一項目的在於調整柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離子交 換法中所用的陰離子性配位離子對於陰離子交換樹脂的保持力，在實現M6P的分析的同 時，提高該方法對甘露糖、巖藻糖、葡萄糖等中性還原糖的分析能力。此外，本發明的另一項目的在於，實質上消除該方法的管道因流動相中所含的硼 酸的析出而堵塞的問題。針對上述目的的研究中，本發明人嘗試了在柱後螢光檢測-硼 酸配合物陰離子交換法中，使用硼酸和水溶性的如氯化鈉等中性無機鹽的水溶液作為流動 相。結果發現，對於這樣的流動相，可以通過水溶性的中性無機鹽的濃度來調節陰離子性配 位離子對於陰離子交換樹脂的保持力，而且令人吃驚的是，能夠對無法通過現有方法分析 的M6P進行分析。此外，也發現與現有方法相比，可以顯著地改善對甘露糖、巖藻糖、葡萄糖 等中性還原糖的分析能力。另外，還發現通過添加氯化鈉，可以降低流動相中所含的硼酸的 濃度，能夠實質上消除柱後螢光檢測_硼酸配合物陰離子交換法的管道因硼酸的析出而堵 塞的問題。本發明是基於這些發現而完成的發明。S卩，本發明提供以下的技術方案。1. 一種分離分析方法，它是試樣中所含的還原糖的採用柱色譜法的分離分析方 法，其中，包括下述步驟將試樣裝載於陰離子交換樹脂柱中，藉由使足量的由含規定濃度的水溶性無機鹽 的規定濃度的硼酸水溶液形成的第一流動相通過所述柱來對柱進行清洗；
以規定的流速連續地向所述柱供給將所述鹽的濃度提高至高於所述第一流動相 的第二流動相，藉由所述第二流動相將還原糖洗脫；將來自所述柱的洗脫液連續地導入流路中；通過在所述流路的規定位置以規定速度連續地向所述洗脫液中添加至少1種鹼 性胺基酸，從而形成在所述流路中連續地流動的混合溶液；通過使所述混合溶液用規定時間通過所述流路的規定溫度的加熱區域，從而對所 述混合溶液 進行加熱；在所述流路的規定位置對加熱後的在所述流路中流動的所述混合溶液連續地照 射激發光的同時，連續地測定並記錄從所述混合溶液發射的螢光的強度。2.如上述1所述的分離分析方法，其中，所述第一流動相的硼酸濃度為50 150mM，所述水溶性無機鹽的濃度為10 30mM。3.如上述2所述的分離分析方法，其中，所述第一流動相及第二流動相的硼酸濃 度為75 125mM。4.如上述1 3中的任一項所述的分離分析方法，其中，所述第一流動相及第二流 動相的PH為7. 5 9. 5。5.如上述1 4中的任一項所述的分離分析方法，其中，所述水溶性無機鹽是氯化 鈉。6.如上述1 5中的任一項所述的分離分析方法，其中，在將所述柱加熱至70°C 以下的溫度的狀態下進行還原糖的分離。7.如上述1 6中的任一項所述的分離分析方法，其中，所述鹼性胺基酸以在所述 混合溶液中達到0. 1 2w/v%的濃度的條件添加。8.如上述1 7中的任一項所述的分離分析方法，其中，所述鹼性胺基酸選自精氨 酸、賴氨酸和組氨酸。9.如上述1 8中的任一項所述的分離分析方法，其中，所述規定溫度的加熱區域 的溫度為140 180°C。10.如上述1 9中的任一項所述的分離分析方法，其中，所述第二流動相的所述 鹽的濃度至少被提高至200mM。11.如上述1 10中的任一項所述的分離分析方法，其中，還原糖包含中性糖。12.如上述1 11中的任一項所述的分離分析方法，其中，還原糖包含甘露糖、葡 萄糖或巖藻糖。13.如上述1 12中的任一項所述的分離分析方法，其中，還原糖包含甘露 糖-6-磷酸。14. 一種水溶液，該水溶液用於在上述1 13中的任一項所述的分離分析方法中 用作所述第一流動相，含50 150mM硼酸和10 30mM氯化鈉。15. 一種水溶液，該水溶液用於在上述1 13中的任一項所述的分離分析方法中 與所述第一流動相混合來製備所述第二流動相，含50 150mM硼酸和200 250mM氯化鈉。16. 一種固體組合物，該組合物用於溶解於水來製備上述14所述的水溶液，以 1 0. 1 1 0.5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。17. 一種固體組合物，該組合物用於溶解於水來製備上述15所述的水溶液，以1 1.5 1 2. 5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。本發明對於柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離子交換法，可實現M6P的分析，且提高 還原糖的分析能力。此外，由於硼酸的使用濃度低於以往的柱後螢光檢測_硼酸配合物陰 離子交換法，因此也可以實質上消除該方法的管道堵塞的問題。



圖1是模式化表示裝置的配置和流路的圖。圖2-1是表示採用新方法的中性還原糖混合物標準溶液的分析結果的色譜圖。圖2-2是表示採用現有方法的中性還原糖混合物標準溶液的分析結果的色譜圖。圖3-1是表示採用新方法的M6P標準溶液的分析結果的色譜圖。圖3-2是表示採用現有方法的M6P標準溶液的分析結果的色譜圖。圖4-1是表示採用新方法的中性糖混合物標準溶液和M6P標準溶液的混合液的分 析結果的色譜圖。圖4-2是表示採用現有方法的中性糖混合物標準溶液和M6P標準溶液的混合液的 分析結果的色譜圖。符號說明1 自動進樣器，2 柱加熱器，3 柱，4 加熱單元，5 螢光檢測器，A 溶液A(A』)，B 溶液(B』)，C:反應試樣液。
具體實施例方式本發明中，「硼酸水溶液」一詞也包括為了適當調整pH而添加有如氫氧化鈉或硼酸 鈉等少量的作為PH調整劑的鹼的硼酸水溶液。本發明中，對於硼酸水溶液，提到「硼酸濃度」時，是指將該水溶液中的硼換算為硼 酸(H3BO3)時的濃度。因此，也包括以如硼酸鈉等鹽的形式添加的硼酸。本發明中，為了提高第二流動相中所含的鹽的濃度，例如將提高了鹽濃度的其他 硼酸水溶液在提高其配比的同時加入至第一流動相中即可。這時，該配比可以連續地提高， 也可以間斷地提高，較好是連續地提高，特別好是線性地提高，即以恆定的速度連續地提 高。第二流動相中的鹽濃度的上升進行至作為分析對象的還原糖洗脫即可。通常使鹽濃度 上升至200mM附近即可，但也可以使其進一步提高，例如可以進行至鹽濃度達到250mM。本發明中，流動相中所含的鹽只要是水溶性的除硼酸鹽以外的無機鹽即可，沒有 特別限定，較好是溶於水時呈中性的中性鹽，特別好是氯化鈉、氯化鉀。本發明中，只要可以進行糖類的分析、特別是根據目的進行的中性還原糖或M6P 的分析，流動相的硼酸濃度沒有限定，較好是在50 150mM的範圍內，更好是75 125mM， 特別好是約lOOmM。本發明中，流動相的pH較好是在7. 5 9. 5的範圍內，特別好是約9。作為本發明中的用於陰離子交換柱色譜的陰離子交換樹脂，可以使用弱陰離子交 換樹脂和強陰離子交換樹脂中的任一種，較好是使用強陰離子交換樹脂。此外，基於陰離子 交換柱色譜法的洗脫可以在室溫下進行，較好是加熱柱來進行。但是，這時的加熱溫度在約 70°C以下，較好是約65°C。
作為本發明中使用的鹼性胺基酸，沒有特別限定，較好是精氨酸、賴氨酸、組氨酸， 特別好是精氨酸。此外，鹼性胺基酸可以單獨使用任一種，也可以將多種胺基酸製成混合 物來使用。此外，這時的鹼性胺基酸的添加通過將含有該鹼性胺基酸的水溶液注入至在流 路中流動的來自柱的洗脫液來進行。鹼性胺基酸的注入速度只要在一次分析期間保持恆定 即可，可以是任意的。通常，以在流路內與來自柱的洗脫液混合後的濃度(最終濃度)達到
0.1 2w/v%的條件注入，較好是以達到0. 5 1. 8w/v%的條件注入，更好是以達到1. 0
1.5w/v%的條件注入。鹼性胺基酸的添加較好是通過例如以含有該鹼性胺基酸的硼酸水溶 液的形式注入流路的方法來進行。該情況下，硼酸濃度可以與流動相的硼酸濃度一致，但也 可以存在一定程度的差異。本發明中，將洗脫液與鹼性胺基酸一起加熱而使其進行反應(加熱反應)時的反 應溫度可以設為140 180°C，較好是約150°C。此外，這時的反應是糖分子中的還原性基 團與鹼性胺基酸反應而生成褐色物質、即類黑精的美拉德反應。本發明中，對加熱反應後的反應液照射作為激發光的波長約320nm的紫外線，熒 光強度的測定針對由此發射的波長約430nm的螢光進行。這時，為了防止噪聲的產生，較好 是在測定螢光強度之前預先通過冷卻裝置等將反應液冷卻至室溫左右。可通過本發明進行分析的糖類是與鹼性胺基酸發生美拉德反應的還原糖。作為例 子，可以例舉葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等單糖，麥芽糖、麥芽三糖等寡糖，葡糖 胺、半乳糖胺等氨基糖，葡糖醛酸等糖醛酸以及磷酸化糖等；特別是甘露糖、葡萄糖、巖藻糖 等中性糖和甘露糖-6-磷酸等磷酸化糖。此外，本發明的方法中所使用的流動相作為試劑預先準備在提高分析操作的便捷 性方面是有利的。試劑的形態可以是水溶液，也可以是通過用純水溶解而形成流動相的 固體組合物(粉末、顆粒等)。水溶液的情況下，用作第一流動相的試劑是含優選為50 150mM、更優選為75 125mM、例如約IOOmM的硼酸和10 30mM的氯化鈉的pH7. 5 9. 5 的水溶液。PH的調整例如可以通過添加氫氧化鈉來實現，也可以通過將硼酸的一部分置換 為硼酸鈉(例如硼砂)來實現，由其中的任一種方法獲得的水溶液為同一組成。此外，用於添加、混合於第一流動相來製備第二流動相的水溶液形式的試劑例如 是含優選為50 150mM、更優選為75 125mM、例如約IOOmM的硼酸和優選200 250mM、 例如約200mM的氯化鈉的pH7. 5 9. 5的水溶液。作為用於單純地溶解來製備第一流動相的試劑的固體組合物的情況下，試劑是以 溶於水後可使硼酸濃度為50 150mM、較好是75 125mM、例如約IOOmM且氯化鈉濃度為 10 30mM的比例摻合了硼酸和氯化鈉的固體組合物。因此，採用例如以1 0. 1 1 0. 5 的摩爾比含有硼酸和氯化鈉的固體組合物即可。這時，通過摻入適量的硼酸鈉來代替一部 分硼酸，可以預先調整製成水溶液時的PH。該情況下，為了以溶於規定量的水時可獲得那樣的pH的條件配製，例如預先製備 少量目標水溶液，測定使其達到該範圍內的PH所需的硼酸量和硼酸鈉(硼砂等)量，再基 於這些量根據要製備的液量配製適當量的硼酸和硼酸鈉(硼砂等)即可。此外，通過添加 氫氧化鈉來調整水溶液的PH的情況下，與和所需的氫氧化鈉的Na離子的摩爾數相同的摩 爾數的Na離子對應的硼酸鈉量是以硼酸鈉代替氫氧化鈉來進行pH調整時的硼酸鈉的需要 量。此外，硼酸的使用量減少與來源於所添加的硼酸鈉的硼的摩爾數對應的量。
為了添加、混合於第一流動相來製備第二流動相而製備含高濃度的氯化鈉的水溶 液，作為用於溶於水來製備所述水溶液的試劑的固體組合物是以製成水溶液時的硼酸的濃 度優選為50 150mM、更優選為75 125mM、例如約IOOmM的硼酸且氯化鈉的濃度為200 250mM的pH達到7. 5 9. 5的條件配製的組合物。因此，採用例如以1 1. 5 1 2.5 的摩爾比含有硼酸和氯化鈉的固體組合物即可。
實施例以下，參照實施例來對本發明進行更詳細的說明，但並不表示本發明受到實施例的限定。〔標準溶液的製備〕將30mg的D (+)-甘露糖、IOmg的L(-)-巖藻糖、30mg的D (+)-半乳糖溶解於純 水，定容為100mL。將在ISmL該水溶液中加入純水而定容為50mL的溶液作為中性還原糖 混合物標準溶液。此外，將20mg的甘露糖-6-磷酸鈉鹽溶於純水而定容為IOOmL的溶液作 為M6P標準原液。M6P標準原液以ImL為單位分裝灌注並於-20°C保存，使用時溶解，將用 純水稀釋2倍而得的溶液作為M6P標準溶液。〔流動相用的溶液的製備(新方法用)〕將6. 2g硼酸加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調整至pH9. 0後，加入純水將總 量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作溶液A (IOOmM硼酸溶液 (PH9.0))。此外，將6. 2g硼酸和11. 7g氯化鈉加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調整至 PH9. 0後，加入純水將總量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作 溶液B (IOOmM硼酸-200mM氯化鈉溶液(pH9. 0))。〔流動相用的溶液的製備(現有方法用)〕將6. 2g硼酸加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調整至pH8. 0後，加入純水將總量 定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作溶液A』 (IOOmM硼酸溶液 (pH8. 0))。將24. 8g硼酸加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調整至pH9. 0後，加入純水將 總量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作溶液B』 (400mM硼酸 水溶液(ρΗ9· 0))。〔反應試樣液的製備〕將IOg L-精氨酸和30g硼酸加入純水中溶解，將總量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m 以下的膜濾器抽濾，將所得的溶液作為反應試樣液。〔採用柱後螢光檢測_硼酸配合物陰離子交換法的糖分析(1)〕(1)裝置在島津HPLC系統LC-lOAvp (還原糖分析系統)中設置作為陰離子交換柱的 Shim-pack ISA-07/S2504 (4. OmmI. D. X 250mm)(基材聚苯乙烯凝膠，固定相；季銨基)，再 設置作為用於加熱該柱的柱加熱器的Shim-pack保護柱ISA (4. OmmI. D. X 50mm)。此外，在 柱的流出口的下遊設置加熱反應用的加熱單元(ALB-221，旭科技玻璃株式會社(旭f 」 ) 夂『，7 )制)。通過柱加熱器將柱加熱至65°C的同時，將加熱單元設置為150°C。此外，在 加熱單元的下遊設置螢光檢測器，設置為照射作為激發光的波長320nm的紫外線並檢測波 長430nm的螢光。裝置的配置和流路模式化示於圖1。
(2)操作步驟
將溶液A和溶液B加樣於還原糖分析系統的自動進樣器，再設置為從柱的流出口 的下遊(加熱單元的上遊)供給反應試樣液的狀態。用色譜分析開始時的流動相(溶液A) 平衡柱後，將中性還原糖混合物標準溶液和M6P標準溶液或者它們的混合溶液裝載於柱。新方法中，將糖類的標準溶液裝載於柱後，使將溶液A和溶液B以90 10的體積 比混合而製成的第一流動相(因此硼酸IOOmM,氯化鈉20mM)以0. 3mL/分鐘的流速通入柱 35分鐘後，以同一流速用25分鐘將溶液A和溶液B的體積比線性地提高至25 75(因此 硼酸IOOmM,氯化鈉提高至150mM)，再使溶液B的添加比例達到100% (因此硼酸IOOmM,氯 化鈉200mM)並以同一流速通入10分鐘，然後與第一流動相的情況同樣地使溶液A和溶液 B以90 10的體積比(因此硼酸IOOmM,氯化鈉20mM)以同一流速通入。此外，反應試樣 液在柱的流出口的下遊以0. 2mL/分鐘的速度供給至流路。因此，反應混合液中的精氨酸濃 度為 3X0. 2/(0. 3+0. 2) = 1. 2w/v%。現有方法中，將糖類的標準溶液裝載於柱後，用50分鐘將溶液A』和溶液B』的體積 比連續地從100 0提高至0 100 (因此，硼酸從IOOmM提高至400mM)的同時，以0.6mL/ 分鐘的流速通入柱後，僅使溶液B』(400mM硼酸)以同一流速通入20分鐘，然後僅使溶液 A' (IOOmM)以同一流速通入。此外，反應試樣液在柱的流出口的下遊以0.5mL/分鐘的速度 供給至流路。因此，反應混合液中的精氨酸濃度為3X0. 5/(0. 6+0. 5) = 1. 36w/v%。新方法和現有方法中的各溶液的組成和色譜分析的條件示於表1，溶液B、B』的比 例分別示於表2。表1.各溶液的組成和色譜分析的條件 表2.溶液B，B，的比例 (注)時間以試樣的裝載時為基準(0分鐘)。〔中性糖混合物標準溶液的分析〕通過新方法對中性糖混合物標準溶液進行分析後，獲得表示來源於甘露糖、巖藻 糖和半乳糖的螢光的強度的完全分離的各峰(圖2-1)。另一方面，通過現有方法對中性糖 混合物標準溶液進行分析後，來源於甘露糖、巖藻糖和半乳糖的各峰未完全分離，特別是獲 得來源於巖藻糖和半乳糖的重疊的峰(圖2-2)。由這些結果可知，新方法作為中性糖的分 析方法，特別是作為定量的分析方法比現有方法更佳。〔Μ6Ρ標準溶液的分析〕通過新方法對Μ6Ρ標準溶液進行分析後，獲得來源於Μ6Ρ的峰(圖3_1)。另一方 面，通過現有方法對Μ6Ρ標準溶液進行分析後，未獲得來源於Μ6Ρ的峰(圖3-2)。這被認為 是將氯化鈉向流動相的摻入使其他還原糖的同時分析成為可能，而且對於對陰離子交換樹 脂的保持力產生調整性的作用，使得對於現有方法中牢固地結合於陰離子交換樹脂而無法 容易地洗脫的Μ6Ρ的保持力下降。還有，新方法的上述實施例中，Μ6Ρ在將流動相中的氯化 鈉濃度暫時提高至200mM的10分鐘中未與中性糖一起洗脫，然後使氯化鈉濃度降低至20mM 後發現洗脫，由實施例整體的結果可知，氯化鈉濃度越高，則M6P越容易洗脫，所以可知即 使不使流動相的氯化鈉的濃度從200mM降下而直接流入維持柱，也可以實現M6P的分離。〔中性糖混合物標準溶液和M6P標準溶液的混合液〕通過新方法對中性糖混合物標準溶液和M6P標準溶液的混合液進行分析後，獲得 來源於甘露糖、巖藻糖、半乳糖和M6P的完全分離的峰(圖4-1)。另一方面，通過現有方法 對中性糖混合物標準溶液和M6P標準溶液的混合液進行分析後，來源於甘露糖、巖藻糖和 半乳糖的各峰未完全分離，也未能獲得來源於M6P的峰(圖4-2)。這些結果顯示，新方法作 為甘露糖、巖藻糖、半乳糖等中性糖的分析技術以及M6P的分析技術，特別是作為它們的定 量分析方法，遠遠優於現有方法。此外，確認如果採用新方法，則可以同時對M6P和甘露糖 進行分析，因此通過對M6P分解而產生的甘露糖進行定量，可以對糖鏈、構成糖蛋白的M6P 的穩定性進行評價。產業上利用的可能性本發明可以用作還原糖的新分析法，該方法對於柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離 子交換法，可實現M6P的分析，且提高中性糖間的分離能力，還解決了該方法的管道堵塞的 問題。
權利要求
一種分離分析方法，它是試樣中所含的還原糖的採用柱色譜法的分離分析方法，其特徵在於，包括下述步驟將試樣裝載於陰離子交換樹脂柱中，藉由使足量的由含規定濃度的水溶性無機鹽的規定濃度的硼酸水溶液形成的第一流動相通過所述柱來對柱進行清洗；以規定的流速連續地向所述柱供給將所述鹽的濃度提高至高於所述第一流動相的第二流動相，藉由所述第二流動相將還原糖洗脫；將來自所述柱的洗脫液連續地導入流路中；通過在所述流路的規定位置以規定速度連續地向所述洗脫液中添加至少1種鹼性胺基酸，從而形成在所述流路中連續地流動的混合溶液；通過使所述混合溶液用規定時間通過所述流路的規定溫度的加熱區域，從而對所述混合溶液進行加熱；在所述流路的規定位置對加熱後的在所述流路中流動的所述混合溶液連續地照射激發光的同時，連續地測定並記錄從所述混合溶液發射的螢光的強度。
2.如權利要求1所述的分離分析方法，其特徵在於，所述第一流動相的硼酸濃度為 50 150mM，所述水溶性無機鹽的濃度為10 30mM。
3.如權利要求2所述的分離分析方法，其特徵在於，所述第一流動相及第二流動相的 硼酸濃度為75 125mM。
4.如權利要求1 3中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，所述第一流動相及 第二流動相的pH為7. 5 9. 5。
5.如權利要求1 4中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，所述水溶性無機鹽 是氯化鈉。
6.如權利要求1 5中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，在將所述柱加熱至 70°C以下的溫度的狀態下進行還原糖的分離。
7.如權利要求1 6中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，所述鹼性胺基酸以 在所述混合溶液中達到0. 1 2w/v%的濃度的條件添加。
8.如權利要求1 7中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，所述鹼性胺基酸選 自精氨酸、賴氨酸和組氨酸。
9.如權利要求1 8中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，所述規定溫度的加 熱區域的溫度為140 180°C。
10.如權利要求1 9中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，所述第二流動相 的所述鹽的濃度至少被提高至200mM。
11.如權利要求1 10中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，還原糖包括中性糖。
12.如權利要求1 11中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，還原糖包含甘露糖、葡萄糖或巖藻糖。
13.如權利要求1 12中的任一項所述的分離分析方法，其特徵在於，還原糖包含甘露 糖-6-磷酸。
14.一種水溶液，其特徵在於，用於在權利要求1 13中的任一項所述的分離分析方法 中用作所述第一流動相，含50 150mM硼酸和10 30mM氯化鈉。
15.一種水溶液，其特徵在於，用於在權利要求1 13中的任一項所述的分離分析方法 中與所述第一流動相混合來製備所述第二流動相，含50 150mM硼酸和200 250mM氯化鈉。
16.一種固體組合物，其特徵在於，用於溶解於水來製備權利要求14所述的水溶液，以 1 0. 1 1 0. 5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。
17.—種固體組合物，其特徵在於，用於溶解於水來製備權利要求15所述的水溶液，以 1 1.5 1 2. 5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。
全文摘要
本發明提供可對甘露糖-6-磷酸進行分析的柱後螢光檢測-硼酸配合物陰離子交換法。一種分離分析方法，它是還原糖的採用柱色譜法的分離分析方法，包括下述步驟將試樣裝載於陰離子交換樹脂柱中，藉由使足量的由含水溶性無機鹽的硼酸水溶液形成的第一流動相通過所述柱來對柱進行清洗，供給將所述鹽的濃度提高了的第二流動相來將還原糖洗脫，向洗脫液中添加鹼性胺基酸，加熱，連續地測定並記錄照射激發光而發射的螢光的強度。
文檔編號G01N21/64GK101839898SQ201010144089
公開日2010年9月22日 申請日期2010年3月11日 優先權日2009年3月13日
發明者橫山哲雄 申請人:日本化學研究株式會社