Nkg2d抑制劑在治療心血管和代謝疾病如2型糖尿病中的用途的製作方法

2023-08-10 15:17:31

專利名稱：Nkg2d抑制劑在治療心血管和代謝疾病如2型糖尿病中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及治療2型糖尿病和/或可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症如心血管病的方法。
背景技術：
深受糖尿病困擾的人群數量大且不斷增加。糖尿病是胰腺激素胰島素相對或絕對缺陷引起的血糖水平升高導致的代謝疾病。胰島素響應血糖水平而由胰腺分泌到血液中， 其主要功能是將血糖導入機體儲備，從而控制血糖水平。已知糖尿病分為1型和2型。1型糖尿病的特徵是靶向β細胞的破壞性自身免疫過程和這些細胞的再生能力之間失衡所致的胰腺β細胞進行性損失。這種失衡最終導致完全喪失β細胞和內源性胰島素分泌。1型糖尿病佔糖尿病總數的5-10%。2型糖尿病的特徵是胰島素抗性和β細胞功能受損，包括第一期胰島素釋放受損、β細胞脈衝質量降低和胰島素缺陷。2型糖尿病是最常見的糖尿病形式，佔糖尿病總數的90-95%。糖尿病患者發生心血管病的概率是未患糖尿病的人群的2-4倍。儘管在過去幾十年治療取得很大進步，但心血管病仍然是2型糖尿病患者的主要併發症和主要致死原因。心臟病發作、中風和下肢截肢的風險增加是糖尿病患者過早死亡的主要原因。在2型糖尿病患者中，包括肥胖、高血壓、血脂異常和缺乏運動在內的心血管病風險因素通常更為
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曰 JM- O心血管病是最嚴重的人類健康問題並且是美國的第一大死亡原因。根據美國心臟協會的報導，單單在美國，2008年心血管病預防和治療的花費將達到令人驚訝的4485億美元，形成巨大的社會財政負擔。動脈粥樣硬化是動脈血管內壁上形成由脂肪物質和細胞組分構成的斑塊的心血管病形式。該疾病由功能障礙性代謝疾病，如糖尿病患者動脈的易患區域上沉積異常代謝物引發，並且隨著包括免疫激活和炎症在內多種因素的捲入而不斷進展。異常代謝疾病如糖尿病引發多種細胞應激反應，誘導組織炎症和免疫細胞激活， 進而加重代謝功能障礙，產生惡性循環持續造成諸如心血管病進展等失調的下遊後果。然而，我們尚未徹底了解聯接這些過程的分子事件，這阻礙了我們通過調節免疫系統治療代謝功能障礙和心血管病併發症的努力。
因此，需要有效的方法來預測、預防和治療代謝功能障礙相關疾病，如糖尿病以及心血管疾病和失調。

發明內容
本發明涉及在患有2型糖尿病和/或代謝功能障礙的患者和動物中上調，和可能對血管和肝臟炎症、代謝功能障礙和心血管病發生中的免疫細胞激活起到重要作用的免疫刺激分子家族的發現。具體說，在2型糖尿病患者以及脂質代謝功能障礙和動脈粥樣硬化的動物模型中檢測到NKG2D (—種強效免疫激活受體)的刺激配體水平升高。因此，本發明提供治療2型糖尿病和可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症如心血管病的新方法、組合物和藥盒。本發明也提供檢測和診斷2型糖尿病或心血管病發生傾向或者2型糖尿病或心血管病的存在的新方法。在一個實施方式中，本發明提供一種治療2型糖尿病的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的抑制NKG2D激活或信號轉導的藥劑。在另一實施方式中，本發明提供一種治療2型糖尿病的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的阻斷NKG2D 配體結合作用的藥劑。在另一實施方式中，本發明提供一種治療可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的抑制NKG2D激活或信號轉導的藥劑，其中所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。在另一實施方式中，本發明提供一種治療可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的阻斷NKG2D配體結合作用的藥劑，其中所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。在另一實施方式中，本發明涉及治療有效量的在對象中抑制NKG2D激活或信號轉導的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。在另一實施方式中，本發明涉及治療有效量的在對象中阻斷NKG2D配體結合作用的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。在另一實施方式中，本發明涉及治療有效量的在對象中抑制NKG2D激活或信號轉導的藥劑在治療可通過抑制NKG2D 來調節或正常化的病症中的用途，其中所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。在另一實施方式中，本發明涉及治療有效量的在對象中阻斷NKG2D 配體結合作用的藥劑在治療可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症中的用途，其中所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。在一些實施方式中，可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症是2型糖尿病。在一些實施方式中，所述病症是心血管病。在一些實施方式中，所述對象是人。在一些實施方式中，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述藥劑是特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是人或人源化的。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段結合人 NKG2D(hNKG2D)。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段降低NKG2D介導的NKG2D 表達細胞的激活或信號轉導。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段與至少一種 NKG2D配體競爭結合NKG2D。在一些實施方式中，所述NKG2D配體是MICA/B。在一些實施方式中，給予所述藥劑導致對象出現下述反應中至少一種血糖水平降低、葡萄糖耐受提高、胰島素抗性降低、體重降低、血壓降低、炎症減輕或代謝功能障礙減輕。在一些實施方式中，通過靜脈內、腹膜內或皮下途徑給予所述藥劑。在一些實施方式中，本發明方法還包括至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食慾調節藥、抗高血壓藥、治療和/或預防糖尿病導致或與糖尿病相關的併發症的藥劑、和治療和/或預防肥胖導致或與肥胖相關的併發症和失調的藥劑。在一些實施方式中，所述額外藥劑選自(a)選自下組的降血糖藥GLP-1和GLP-I衍生物和類似物、重組促胰島素分泌肽(Exendin)-4和重組促胰島素分泌肽-4衍生物和類似物、糊精和糊精衍生物和類似物、磺脲、雙胍、氯茴苯酸(如那格列奈和瑞格列奈)、葡糖苷酶抑制劑、 DPP-IV (二肽基肽酶-IV)抑制劑、SGLT2抑制劑、SGLTl抑制劑或激動劑、胃泌素和胃泌素類似物和衍生物、FGF-21 (成纖維細胞生長因子21)和FGF-21衍生物和類似物、質子泵抑制劑如蘭索拉唑、奧美拉唑、右旋蘭索拉唑、艾美拉唑、泮託拉唑和雷貝拉唑、R)(R激動劑、考來烯胺、考來替泊、普羅布考、右旋甲狀腺素、PPAR激動劑、脂連蛋白和脂連蛋白衍生物和類似物；(b)選自下組的降血脂劑或脂質代謝調節劑抗高血脂藥，HMG CoA抑制劑(他汀類) 如洛伐他汀、帕伐他丁和斯伐他汀，以及貝特類藥物如吉非貝齊和氯貝丁酯；(c)選自下組的降低食物攝入或提高能量消耗的藥劑NPY(神經肽Y)拮抗劑、PYY(多肽YY)激動劑、 PP(胰多肽)激動劑、Y2受體激動劑、W受體激動劑、混合的Υ2Λ4受體激動劑、MC4(黑皮質素4)激動劑、阿立新拮抗劑、胰高血糖素和胰高血糖素衍生物和類似物、CRF(促腎上腺皮質激素釋放因子)激動劑、CRF BP(促腎上腺皮質激素釋放因子結合蛋白)拮抗劑、尿皮質素激動劑、β 3激動劑、MSH(促黑色素細胞激素)激動劑、MCH(黑色素細胞聚集激素)拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、血清素再攝取抑制劑、血清素和去甲腎上腺素再攝取抑制齊U、混合的血清素和去甲腎上腺素能化合物、5HT(血清素)激動劑、鈴蟾肽激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP 2或 3(非偶聯的蛋白質2或幻調節劑、瘦激素激動劑、DA激動劑(溴隱亭、多普辛(doprexin))、 脂肪酶/澱粉酶抑制劑、RXR(類視黃醇X受體)調節劑、組胺H3拮抗劑和CART (古柯鹼安非他明調節的轉錄物)激動劑；和(d)選自下組的降血壓藥β -阻斷劑如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美託洛爾，ACE(血管緊張素轉化酶)抑制劑如貝那普利、卡託普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、阿拉普利(alatriopril)、喹那普利和雷米普利，鈣通道阻斷劑如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米，以及α -阻斷劑如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪。在一個實施方式中，本發明提供一種組合物，其包含治療有效量的抑制NKG2D激活或信號轉導的藥劑和藥學上可接受的運載體。在另一實施方式中，本發明提供一種組合物，其包含治療有效量的阻斷NKG2D配體結合作用的藥劑和藥學上可接受的運載體。在一些實施方式中，所述藥劑可用於治療2型糖尿病。在一些實施方式中，所述藥劑用於治療可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症。在一些實施方式中，所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。在一些實施方式中，所述病症是2型糖尿病。在一些實施方式中，所述病症是心血管病。在一些實施方式中，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述藥劑是特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是人或人源化的。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段結合人 NKG2D(hNKG2D)。在一些實施方式中，所述藥劑是NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述NKG2D配體活性或表達的抑制劑是MICA/B抑制劑。在一些實施方式中，所述 MICA/B抑制劑是MICA/B-特異性siRNA。在一些實施方式中，本發明組合物還包含至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食慾調節藥、抗高血壓藥、治療和/或預防糖尿病導致或與糖尿病相關的併發症的藥劑、和治療和/或預防肥胖導致或與肥胖相關的併發症和失調的藥劑。在一些實施方式中，所述額外藥劑選自(a)選自下組的降血糖藥GLP-1和GLP-I衍生物和類似物、重組促胰島素分泌肽(Exendin)-4和重組促胰島素分泌肽_4衍生物和類似物、糊精和糊精衍生物和類似物、磺脲、雙胍、氯茴苯酸(如那格列奈和瑞格列奈)、葡糖苷酶抑制劑、 DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制劑、SGLT2抑制劑、SGLTl抑制劑或激動劑、胃泌素和胃泌素類似物和衍生物、FGF-21 (成纖維細胞生長因子21)和FGF-21衍生物和類似物、質子泵抑制劑如蘭索拉唑、奧美拉唑、右旋蘭索拉唑、艾美拉唑、泮託拉唑和雷貝拉唑、R)(R激動劑、考來烯胺、考來替泊、普羅布考、右旋甲狀腺素、PPAR激動劑、脂連蛋白和脂連蛋白衍生物和類似物；(b)選自下組的降血脂劑或脂質代謝調節劑抗高血脂藥，HMG CoA抑制劑(他汀類) 如洛伐他汀、帕伐他丁和斯伐他汀，以及貝特類藥物如吉非貝齊和氯貝丁酯；(c)選自下組的降低食物攝入或提高能量消耗的藥劑NPY(神經肽Y)拮抗劑、PYY(多肽YY)激動劑、 PP(胰多肽)激動劑、Y2受體激動劑、W受體激動劑、混合的Υ2Λ4受體激動劑、MC4(黑皮質素4)激動劑、阿立新拮抗劑、胰高血糖素和胰高血糖素衍生物和類似物、CRF(促腎上腺皮質激素釋放因子)激動劑、CRF BP(促腎上腺皮質激素釋放因子結合蛋白)拮抗劑、尿皮質素激動劑、β 3激動劑、MSH(促黑色素細胞激素)激動劑、MCH(黑色素細胞聚集激素)拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、血清素再攝取抑制劑、血清素和去甲腎上腺素再攝取抑制劑、混合的血清素和去甲腎上腺素能化合物、5HT(血清素)激動劑、鈴蟾肽激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP 2或 3(非偶聯的蛋白質2或幻調節劑、瘦激素激動劑、DA激動劑(溴隱亭、多普辛(doprexin))、 脂肪酶/澱粉酶抑制劑、RXR(類視黃醇X受體)調節劑、組胺H3拮抗劑和CART (古柯鹼安非他明調節的轉錄物)激動劑；和(d)選自下組的降血壓藥β -阻斷劑如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美託洛爾，ACE(血管緊張素轉化酶)抑制劑如貝那普利、卡託普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、阿拉普利(alatriopril)、喹那普利和雷米普利，鈣通道阻斷劑如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米，以及α -阻斷劑如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪。在一個實施方式中，本發明提供一種藥盒，其包含(a)治療有效量的抑制NKG2D 激活或信號轉導的藥劑以及藥學上可接受的運載體；和(b)使用說明書。在另一實施方式中，本發明提供一種藥盒，其包含(a)治療有效量的阻斷NKG2D配體結合作用的藥劑以及藥學上可接受的運載體；和(b)使用說明書。在一些實施方式中，所述藥劑可用於治療2型糖尿病。
在一些實施方式中，所述藥劑用於治療可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症。在一些實施方式中，所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。在一些實施方式中，所述病症是2型糖尿病。在一些實施方式中，所述病症是心血管病。在一些實施方式中，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述藥劑是特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是人或人源化的。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段結合人 NKG2D(hNKG2D)。在一些實施方式中，本發明藥盒還包括至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食慾調節藥、抗高血壓藥、治療和/或預防糖尿病導致或與糖尿病相關的併發症的藥劑、和治療和/或預防肥胖導致或與肥胖相關的併發症和失調的藥劑。在一些實施方式中，所述額外藥劑選自(a)選自下組的降血糖藥GLP-1和GLP-I衍生物和類似物、重組促胰島素分泌肽(Exendin)-4和重組促胰島素分泌肽_4衍生物和類似物、糊精和糊精衍生物和類似物、磺脲、雙胍、氯茴苯酸(如那格列奈和瑞格列奈)、葡糖苷酶抑制劑、 DPP-IV (二肽基肽酶-IV)抑制劑、SGLT2抑制劑、SGLTl抑制劑或激動劑、胃泌素和胃泌素類似物和衍生物、FGF-21 (成纖維細胞生長因子21)和FGF-21衍生物和類似物、質子泵抑制劑如蘭索拉唑、奧美拉唑、右旋蘭索拉唑、艾美拉唑、泮託拉唑和雷貝拉唑、R)(R激動劑、考來烯胺、考來替泊、普羅布考、右旋甲狀腺素、PPAR激動劑、脂連蛋白和脂連蛋白衍生物和類似物；(b)選自下組的降血脂劑或脂質代謝調節劑抗高血脂藥，HMG CoA抑制劑(他汀類) 如洛伐他汀、帕伐他丁和斯伐他汀，以及貝特類藥物如吉非貝齊和氯貝丁酯；(c)選自下組的降低食物攝入或提高能量消耗的藥劑NPY(神經肽Y)拮抗劑、PYY (多肽YY)激動劑、 PP (胰多肽)激動劑、Y2受體激動劑、Y4受體激動劑、混合的Υ2Λ4受體激動劑、MC4(黑皮質素4)激動劑、阿立新拮抗劑、胰高血糖素和胰高血糖素衍生物和類似物、CRF(促腎上腺皮質激素釋放因子)激動劑、CRF BP(促腎上腺皮質激素釋放因子結合蛋白)拮抗劑、尿皮質素激動劑、β 3激動劑、MSH(促黑色素細胞激素)激動劑、MCH(黑色素細胞聚集激素) 拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、血清素再攝取抑制劑、血清素和去甲腎上腺素再攝取抑制劑、混合的血清素和去甲腎上腺素能化合物、5HT(血清素)激動劑、鈴蟾肽激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP 2或 3(非偶聯的蛋白質2或幻調節劑、瘦激素激動劑、DA激動劑(溴隱亭、多普辛(doprexin))、 脂肪酶/澱粉酶抑制劑、RXR(類視黃醇X受體)調節劑、組胺H3拮抗劑和CART (古柯鹼安非他明調節的轉錄物)激動劑；和(d)選自下組的降血壓藥β -阻斷劑如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美託洛爾，ACE(血管緊張素轉化酶)抑制劑如貝那普利、卡託普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、阿拉普利(alatriopril)、喹那普利和雷米普利，鈣通道阻斷劑如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米，以及α -阻斷劑如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪。在一個實施方式中，本發明提供一種在對象中檢測2型糖尿病發生傾向或2型糖尿病的存在的方法，所述方法包括(a)由所述對象獲得樣品；(b)將所述樣品與檢測是否存在MICA/B表達的至少一種試劑相接觸；(c)測定所述樣品中的MICA/B表達水平；和(d) 將MICA/B過度表達與所述對象的2型糖尿病發生傾向或存在2型糖尿病相關聯。在另一實施方式中，本發明提供一種在對象中檢測心血管病發生傾向或心血管病的存在的方法， 所述方法包括(a)由所述對象獲得樣品；(b)將所述樣品與檢測是否存在MICA/B表達的至少一種試劑相接觸；(c)測定所述樣品中的MICA/B表達水平；和(d)將MICA/B過度表達與所述對象的心血管病發生傾向或存在心血管病相關聯。在一些實施方式中，所述試劑是MICA/B抗體。在一些實施方式中，所述樣品是血清。在一些實施方式中，所述對象是人。在一些實施方式中，本發明方法還包括測定所述樣品中不是MICA/B的心血管病標記物的表達水平，並將心血管病標記物的過度表達或表達不足與所述對象的心血管病發生傾向或存在心血管病相關聯。附圖簡要說明

圖1是顯示在2型糖尿病患者血清中檢測的可溶性MICA蛋白和其與其他促炎細胞因子表達的相關性的一系列圖。(A)檢測2型糖尿病患者血液中的可溶性MICA。利用 ELISA試劑盒(明尼蘇達州明尼阿波利斯的R&D系統公司(R&D Systems，Minneapolis，麗)) 測定糖尿病患者血清中的MICA蛋白。重組MICA蛋白用作標準品，根據它計算血清MICA水平。X軸的每個數字代表一位患者。(B和C)通過人促炎4重組(IL-6、TNF- α、IL-I β和 IFN-γ)(馬裡蘭州蓋瑟斯堡的美索發現公司(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)) 分析同一患者血清中的IL-6和TNF-α水平。⑶通過CRP ELISA試劑盒(加州春谷的凱爾生物技術公司(Calbiotech Inc. Spring Valley, CA))分析2型糖尿病患者血清中的C-反應性蛋白(CRP)的血清水平。(E)平均來看，糖尿病患者的血清MICA水平高於所檢測的50 位癌症患者。將2型糖尿病患者的數據分組，並與50位癌症患者的數據作比較。圖2是一系列冰凍切片的顯微照片，顯示通過免疫組化染色在人主動脈斑塊上檢測到MICA/B。用抗-MICA/B抗體對斑塊的冰凍切片染色(A、C、E、G)。用抗-Mac-3或CD31 抗體對相鄰切片進行染色，以顯示巨噬細胞或內皮細胞(B、D、F、H)。正常主動脈的切片用作MICA染色對照(I)。圖3是一系列電泳凝膠照片和一系列免疫組化染色的冰凍切片照片，顯示在 ApoE-/"小鼠的動脈粥樣硬化斑塊中NKG2D配體上調。(A)對主動脈斑塊病變的RNA中 NKG2D配體Rae-I δ、Rae-I ε和H60b的轉錄物進行半定量RT-PCR分析。(B)在飼餵西方飲食(WD)的ApoE-/-和年齡匹配的飼餵西方飲食的野生型小鼠和飼餵正常食物的野生型小鼠中，對分離自主動脈弓區域的RNA樣品中的Rae-I δ ,Rae-I ε和H60b轉錄物進行實時 RT-PCR分析。實驗進行兩次。(C)對自然產生斑塊的(右側)或STZ-誘導型糖尿病加速的(左側)ApoE-/_小鼠的斑塊冰凍切片進行免疫組化染色。切片用抗-Rae-I或H60抗體 (褐色)和抗-CD68抗體(藍色)進行復染。(D)免疫組化染色飼餵西方飲食的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化主動脈中的NKG2D配體Rae-I和H60。同一飼餵西方飲食的ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化主動脈弓區域(上圖和中圖)和「無斑塊」胸部區域(下圖)的冰凍切片用多克隆山羊抗-小鼠抗-Rae-I (R&D系統公司)或H60抗體(聖克魯茲生物技術公司 (Santa Cruz Biotechnology))進行染色。中部照片為上圖(100X)中方框區域的高倍放大圖G00X)。(E)流式細胞術分析分離自ApoE+小鼠的動脈粥樣硬化主動脈或野生型小鼠的正常主動脈的巨噬細胞和內皮細胞上的細胞表面Rae-I表達。在⑶45+⑶Ilb+⑶16/32+ 細胞群上門選巨噬細胞，CD45—CD31+細胞群上門選內皮細胞。灰色區域是同種型匹配的對照抗體染色。(F)對體外處理的野生型巨噬細胞中的總Rae-I蛋白進行蛋白質印跡分析。 (G)對僅在培養基中和在額外oxLDL、天然LDL(nLDL)和LPS(作為對照)存在下培養的野生型巨噬細胞中的不同NKG2D配體上調進行半定量RT-PCR分析。(H)對氧化LDL (oxLDL) 或晚期糖基化終產物(AGE)存在下體外培養的野生型巨噬細胞上的Rae-I表達進行流式細胞術分析。巨噬細胞分離自腹腔，並在含5 μ g/mloxLDL或200 μ g/ml AGE的培養基中體外培養2天，然後通過類似於圖E的流式細胞術進行分析，不同之處在於虛線代表在10倍過量的未標記的抗-泛Rae-I抗體存在下染色。圖4是ApoE缺失小鼠的主動脈的一系列照片，顯示在有糖尿病的ApoE缺失小鼠中抗-NKG2D抗體抑制斑塊形成。(A)代表性抗-NKG2D或對照抗體處理的患有糖尿病的 ApoE缺失小鼠的主動脈中的斑塊形成。主動脈用PBS灌注，並在解剖顯微鏡下觀察明顯的不透明斑塊。需要注意的是，在抗-NKG2D抗體治療小鼠中斑塊顯著縮小(圓圈區域)。(B) 對來自一個代表性實驗的抗-NKG2D(MI-6)和對照抗體(對照)處理的ApoE-/-小鼠的主動脈中的沉積脂類物質進行正面油紅O(En face Oil red 0)染色。打開主動脈，用10%福馬林固定，並用油紅0染料染色。脂類物質染成深紅色。需要注意的是，在抗-NKG2D抗體處理小鼠的主動脈弓區域油紅0染色明顯較少。圖5是表明在各種小鼠模型中靶向NKG2D/配體相互作用能防止動脈粥樣硬化的一系列圖片。(A)在鏈脲黴素誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠中抗-NKG2D抗體阻斷對動脈粥樣硬化發生的影響。根據油紅0陽性染色面積佔總弓面積的比例計算對照和抗-NKG2D處理的糖尿病ApoE-/-小鼠的主動脈上的斑塊大小。(B和C)在鏈脲黴素誘導的患有糖尿病 (B)或飼餵西方飲食(C)的KLRKl-/-ApoE-/-小鼠中(KLRK1基因編碼NKG2D蛋白)，NKG2D 敲除對動脈粥樣硬化發生的影響。斑塊大小的計算方法與圖A相同。ApoE-/-小鼠用作對照。圖6是顯示抗-NKG2D抗體處理的患有糖尿病的ApoE缺失小鼠的血清中促炎細胞因子減少的一系列圖片。用小鼠促炎-7重試劑盒(IL-6、TNF-a、IFN-γ、IL_12p70、IL-10、 IL-I β和KC/CXCL1)(馬裡蘭州蓋瑟斯堡的美索發現公司)直接分析四隻抗-NKG2D(MI-6 Ab)-處理的和三隻對照抗體(Con Ab)處理的糖尿病ApoE缺失小鼠以及年齡匹配的野生型 B6(野生型)各兩隻，一月齡(幼年ApoE)或八月齡(老年ApoE) ApoE-/-小鼠的血清。星號*表明抗-NKG2D抗體和對照抗體處理的糖尿病ApoE-/-小鼠之間的數值有統計學顯著差異。圖7是顯示KLRKl-/-ApoE-/-小鼠(具有缺陷型NKG2D基因)的血清中促炎細胞因子減少的一系列圖片。通過如圖6所示的小鼠促炎-7重試劑盒(IL-6、TNF-a、 IFN-γ、IL-12p70、IL-10、IL-l β和KC/CXCL1)(馬裡蘭州蓋瑟斯堡的美索發現公司)直接分析飼餵西方飲食(12隻小鼠/組)(圖A)或STZ誘導型糖尿病G只小鼠/組)(圖B) KLRKl-/"ApoE-/-和ApoE-/-小鼠的血清。星號表明抗-NKG2D抗體和對照抗體處理的糖尿病ApoE-/"小鼠之間的數值有統計學顯著差異(***P < 0. 01 ;*p < 0. 05)。圖8是顯示KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的代謝疾病緩解的一對血清照片和一對圖片。(A)飼餵西方飲食的KLRKl-/-ApoE-/-的血清比飼餵類似飲食的ApoE-/-小鼠的血清表觀更澄清。(B)KLRKl-/-ApoE-/-小鼠血液中膽固醇和甘油三酯水平降低。分析圖A中血清的總膽固醇和甘油三酯。星號**表明KLRKl/ApoE雙敲除和ApoE-敲除小鼠之間的數值有統計學顯著差異(**P < 0. 05)。每組使用至少5隻小鼠。圖9是顯示NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的血清丙氨酸轉氨酶(ALT)活性相較ApoE-/-小鼠降低的圖片。每組使用至少5隻小鼠。圖10是顯示防止NKG2D/配體相互作用能減輕飼餵西方飲食的ApoE-/-小鼠的肝臟炎症的一對圖片。(A) NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的離體培養的肝臟外植體的IL-6產量降低。從飼餵西方飲食的ApoE-/-或NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠中切除PBS-灌注的肝臟。將相同重量的切除肝臟切成大約Imm3wS塊，在培養基中培養1或3天。回收培養基，通過ELISA分析細胞因子。該實驗重複兩次。(B)在飼餵西方飲食的NKG2D-敲除 KLRKl-/"ApoE-/-小鼠的肝臟中，免疫細胞浸潤減少。數量是每個肝臟中每種免疫細胞類型的數量，根據從肝臟中分離的總單核細胞和每種類型的百分數計算。每組使用至少3隻小鼠。顯示三次獨立實驗中的一次代表性實驗。圖11是一系列圖片和螢光活化細胞分選分析圖，顯示飼餵西方飲食的ApoE-/-小鼠的肝臟細胞中NKG2D配體上調，以及防止NKG2D/配體相互作用能減少肝臟中表達NKG2D 的免疫細胞的激活。(A)對飼餵西方飲食8周的12周齡雄性ApoE-/-小鼠和相同年齡的野生型小鼠的肝臟和其他器官中的Rae-I δ轉錄物進行實時RT-PCR分析。(B)對從飼餵西方飲食的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠的肝臟中純化的巨噬細胞的Rae-I δ轉錄物進行實時 RT-PCR分析。(C和D)對飼餵西方飲食的ApoE-/-小鼠的肝臟巨噬細胞(C)和肝細胞⑶ 的Rae-I表達進行流式細胞術分析。(E) NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的肝臟NKT細胞的IFN-γ和IL-4產量降低。(F)與ApoE-/-小鼠相比，NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/_小鼠的肝臟NK細胞的IFN- γ產量較低。(G) NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-和ApoE-/-小鼠的肝臟巨噬細胞的IL-6產量沒有差異。圖12是顯示靶向NKG2D會抑制2型糖尿病的圖片。向8周齡的ApoE-/-和NKG2D 缺陷型ApoE-/-KLRKl-/-小鼠飼餵西方飲食3個月。然後採集血清並評估葡萄糖水平。 ApoE-/"和ApoE-/-KLRKl-/-小鼠的葡萄糖水平是每組六隻小鼠的平均值。兩組的差異有統計學顯著性(P lOmmol/L) 的動物轉移回低能量飲食，並於10天後當其mBG水平恢復非糖尿病水平時將其用於實際研究(預防模式)。將誘導期mBG沒有增加的動物處死，不繼續使用。(數據未顯示)。用載體(N= 19)或NKG2D-PE抗體(克隆CX5) (N = 9)處理肥沙鼠，每周一次腹膜內注射。該項研究進行六周，期間有規律地跟蹤監測mBG和BW。載體組的所有動物都患上嚴重的糖尿病，平均mBG為14. 5 士 2. 6mM(平均值士標準誤)，而用NKG2D抗體處理的動物仍然保持正常血糖水平(mBG < 8mM)並且具有顯著較低的mBG (8. 0 士 1. 9mM，p < 0. 0001(平均值士標準誤))。在肥沙鼠中NKG2D抗體處理完全抑制了 2型糖尿病的發生，在研究過程中由於出現嚴重的糖尿病酮酸中毒而不得不處死載體組的五隻動物。兩個治療組的BW增加沒有差
已圖14顯示NKG2D抗體結合肥沙鼠(沙鼠，2型糖尿病動物模型)的血細胞的流式細胞術分析。觀察到抗-小鼠NKG2D-PE抗體(克隆CX5)與沙鼠血液中的NK細胞發生劑量依賴性結合。這種結合有特異性，因為同種型對照抗體(大鼠IgGl-PE同種型對照(R3-34) 和小鼠IgGl-PE同種型對照(M0PC-21))或抗-人NKG2D抗體(克隆IDll和克隆0N72)沒有結合。定義除非另外定義，本文中使用的所有技術術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。本文所用的「蛋白質」和「多肽」是同義詞，指不考慮長度或翻譯後修飾如糖基化或磷酸化時的任何肽連接的胺基酸鏈。本文所用術語"MICA/B蛋白"或"MICA/B多肽"指I類MHC鏈相關的A或B基因的表達產物，如天然人MICA蛋白(登錄號L14848)，或與上述蛋白質具有至少65% (優選75、80、85、90、95、96、97、98或99% )胺基酸序列相同性且顯示天然MICA蛋白的功能活性的蛋白質，或天然人MICB蛋白(登錄號NM_005931)，或與上述蛋白質具有至少65% (優選75、80、85、90、95、96、97、98或99% )胺基酸序列相同性且顯示天然MICB蛋白的功能活性的蛋白質。蛋白質的"功能活性"是與蛋白質的生理功能有關的任何活性。例如，天然 MICA/B蛋白的功能活性可包括結合NKG2D和誘導免疫激活，例如分泌細胞因子。本文所用術語「NKG2D蛋白」或「NKG2D多肽」指KLRKl基因的表達產物，如天然人NKG2D蛋白(登錄號574240)或與上述蛋白質具有至少65% (優選75、80、85、90、95、96、 97、98或99%)胺基酸序列相同性且顯示天然NKG2D蛋白的功能活性的蛋白質。例如，天然 NKG2D蛋白的功能活性可包括結合其配體和將信號轉導到免疫細胞內以調節其基因表達和激活。本文所用術語「基因」指編碼特定蛋白質，或者在某些情況下編碼功能或結構RNA 分子的的核酸分子。 本文所用術語「MICA/B基因」、"MICA基因」、"MICB基因」、"MICA/B多核苷酸」、 "MICA多核苷酸」、「MICB多核苷酸」、「MICA/B核酸」、「MICA核酸」、或「MICB核酸」指天然人 MICA或MICB編碼核酸序列，如天然人MICA基因(登錄號L14848)；如天然人MICB基因(登錄號匪005931)，具有可轉錄成MICA或MICB cDNA的序列的核酸；和/或上述物質的等位基因變體和同源物。該術語包括雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。本文所用術語「KLRKl」、「Klrkl」、「KLRKl基因」、「Klrkl 基因」、「NKG2D 基因」、 "NKG2D多核苷酸」或「NKG2D核酸」指天然的人NKG2D編碼核酸序列，如天然人KLRKl基因 (登錄號574240)；具有可轉錄成KLRKlcDNA的序列的核酸；和/或上述物質的等位基因變體和同源物。該術語包括雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。本文所用術語「核酸」或「核酸分子」指兩種或多種核苷酸鏈，如RNA(核糖核酸) 和DNA(脫氧核糖核酸)。本文所述的核酸分子可以是RNA形式或DNA形式(如cDNA、基因
11組DNA和合成DNA)。DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼(有義)鏈或非編碼 (反義)鏈。本文所用術語「患者」、「對象」和「個體」在本文中可互換使用，指治療和/或從中獲得生物樣品的哺乳動物(如人)對象。本文所用術語「結合」、「結合於」或「相互作用」指一種分子識別和粘附於樣品或生物體中特定的第二種分子，但不顯著識別或粘附於樣品中的其他結構不相關的分子。涉及探針或抗體時，本文所用術語「標記」旨在包括通過將可檢測物質偶聯(即物理連接)於該探針或抗體，對探針或抗體進行直接標記。涉及核酸分子或多肽時，本文所用術語「天然」指天然產生的(如WT)核酸或多肽。本文所用術語「診斷的」、「診斷」、「診斷為」指鑑定病理學狀況的存在或特性。本文所用術語「樣品」在本文中以最廣義使用。包含多核苷酸、肽、抗體等的樣品可包括體液、細胞製品的可溶性組分或培養細胞的培養基、基因組DNA、RNA或cDNA、細胞、 組織、皮膚、毛髮等。樣品的例子包括唾液、血清、活檢樣品、血液、尿液和血漿。本文所用術語「序列相同性」指比對兩條序列以最大程度提高亞基匹配，即考慮缺口和插入時，兩條序列中相應位置上相同亞基的百分數。兩條序列中的亞基位置被同一核苷酸或胺基酸佔據時存在序列相同性，例如，若兩個DNA分子的某個給定位置都被腺嘌呤佔據，則這兩個分子在該位置上相同。例如，若在長度為10個胺基酸的序列中有7個位置與長度為10個胺基酸的第二序列的相應位置相同，則這兩個序列具有70%序列相同性。通常採用序列分析軟體(例如，位於威斯康星州麥迪遜53705大學大道1710號的威斯康星大學生物技術中心的遺傳計算機組(Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705) J^WMfiWii^ 包)，測定序列相同性。涉及核酸分子中的突變時，「沉默」改變是取代該核苷酸序列中的一個或多個鹼基對，但不改變該序列編碼多肽的胺基酸序列。「保守性」改變是核酸的蛋白質編碼區中的至少一個密碼子發生改變，使得該核酸序列編碼多肽的至少一個胺基酸被具有相似特性的另
一胺基酸取代。本文所用術語〃寡核苷酸〃、「siRNA"、「 SiRNA寡核苷酸〃和〃 siRNA"在本說明書中可互換使用，包括天然和/或修飾單體或連接的線型或環狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體-單體相互作用的規律模式，如沃森克裡克型鹼基配對、哈斯汀(HoSgsteen)或反向哈斯汀型鹼基配對等特異性結合靶多核苷酸。本文所用術語"抗體"以最廣義使用，具體包括全長單克隆抗體、多克隆抗體，和 (除非另有說明或與上下文牴觸)其抗原結合片段、抗體變體和多特異性分子，只要它們具有所需的生物學活性。通常，全長抗體是含有二硫鍵交聯的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每一重鏈由重鏈可變區(本文簡寫為Vh)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三種結構域CH1、C02和Ch3組成。每一輕鏈由輕鏈可變區(本文簡寫為和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域Q構成。V1^nt區域還可進一步細分為超變區，稱為互補決定區(⑶R)，其間間插更保守的構架區(FR)。每一 Vh和八由三個⑶R和四個FR組成，從氨基端到羧基端按照以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合域。抗體分子結構和與產生抗體有關的各種技術的基本原理可參見，例如，Harlow和Lane，ANTIBODIES :A LABORATORY MANUAL (抗體實驗室手冊)，紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) (1988)。例如，本文所述的抗-NKG2D抗體能夠結合幹擾NKG2D激活和/或信號轉導的NKG2D部分。本文所述抗-NKG2D抗體還能夠結合幹擾NKG2D配體結合相互作用的NKG2D部分。本文所用術語抗體的"抗原結合片段"是包含能夠可檢測地結合抗原的部分全長抗體的分子，通常至少包含Vh區域的一個或多個部分。抗原結合片段包括含有一個、兩個、三個或更多抗體的抗原結合部分的多價分子，和所述\和Vh區域或其所選部分通過合成接頭或重組方法連接形成功能性抗原結合分子的單鏈構建物。雖然抗體的一些抗原結合片段可通過對較大抗體分子進行實際片段化(如酶切)獲得，但通常大部分通過重組技術產生。本文所用術語「人抗體」旨在包括具有構架區和CDR區均衍生自(即相同或基本相同)人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。而且，如果抗體含有恆定區，則該恆定區也 「衍生自」人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包含並非由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，隨機或定點體外誘變引入的突變或體內體細胞突變)。然而，本文所用術語"人抗體"不應包括衍生自另一哺乳動物如小鼠種系的CDR序列被嫁接到人框架序列上的抗體。本文所用術語"人源化"抗體是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的人/ 非人嵌合抗體。多數情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中接受者的高變區的殘基被非人物種，如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(供體抗體)的殘基取代， 具有所需特異性、親和力和性能。在一些情況下，人免疫球蛋白的FR殘基被相應的非人殘基所替換。而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能。通常，人源化抗體將基本上包含至少一個、通常兩個可變區的全部，其中全部或基本上全部的高變環對應於非人免疫球蛋白的高變環，全部或基本上全部的FR殘基是人免疫球蛋白序列的FR殘基。人源化抗體也可任選包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，一般是人免疫球蛋白的Fe。更多詳情可參見例如，Jones等，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332:323—329(1988)；禾口 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)，WO 92/02190，美國專利申請 20060073137 和美國專利 6750325、 6632927,6639055,6548640,6407213,6180370,6054297,5929212,5895205,5886152, 5877293,5869619,5821337,5821123,5770196,5777085,5766886,5714350,5693762, 5693761,5530101,5585089 和 5225539。本文所用術語"構架區"或"FR"殘基是除本文定義的⑶R以外的VH或VL殘基。本文所用術語「表位」或「結合位點」是抗原結合肽(如抗體)特異性結合的抗原的某個區或區域。蛋白質表位可包含直接參與結合的胺基酸殘基(也稱為該表位的免疫顯性組件)和不直接參與結合的其他胺基酸殘基，如被特異性抗原結合肽有效阻斷的胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基位於特異性抗原結合肽的「溶劑排除表面」和/或「足跡」之內)。本文所用術語表位包括特異性結合抗_hNKG2D抗體或本發明另一 hNKG2D特異性物質的hNKG2D的任何特定區域內兩種類型的胺基酸結合位點，除非另有說明(例如，在某些地方，本發明涉及直接結合特定胺基酸殘基的抗體)。NKG2D可包含多個不同表位，它們可包括但不限於，(1)線性肽抗原決定簇，(2)由成熟NKG2D構象中位置相鄰的一個或多個非毗連胺基酸構成的構象抗原決定簇；和(3)翻譯後抗原決定簇，其完全或部分由共價連接於NKG2D的分子結構如糖基團構成。除非上下文另有說明或發生矛盾，構象抗原決定簇包括與抗原結合肽的原子的距離在約4A內的NKG2D胺基酸殘基。本文所用術語與感興趣抗體(如MS或21F2)「結合基本相同的表位或決定簇」指抗體與感興趣抗體「競爭」感興趣抗體特異性結合的NKG2D分子。如本文所述，抗-NKG2D抗體「阻斷」 NKG2D分子與天然NKG2D-配體(如MICA)結合的能力指在利用可溶性或細胞表面相關NKG2D和配體分子進行的試驗中，抗體可檢測地以劑量依賴方式降低NKG2D分子與配體的結合，其中在該抗體缺失時，NKG2D分子可檢測地結合該配體。本文所用術語「NKG2D配體結合相互作用」指NKG2D與其配體(如MICA/B、ULBP/ RAETUMultURae-I δ ,Rae-I ε和H60b)之間的特異性識別和結合相互作用。可調節NKG2D 配體結合相互作用的物質示例包括可溶性NKG2D、特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。膽固醇和甘油三酯水平高被認為是增加心血管病和2型糖尿病風險的脂質代謝失調。本文所用術語「糖尿病」指胰腺激素胰島素相對或絕對缺陷引起的血糖水平升高導致的代謝疾病。糖尿病有兩種形式1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病的特徵是靶向 β細胞的破壞性自身免疫過程和這些細胞的再生能力之間失衡所致的胰腺β細胞進行性損失。這種失衡最終導致完全喪失β細胞和內源性胰島素分泌。2型糖尿病的特徵是胰島素抗性和β細胞功能受損，包括第一期胰島素釋放受損、β細胞脈衝質量降低和胰島素缺陷。在優選實施方式中，本發明涉及2型糖尿病的治療。本文所用術語「2型糖尿病」指機體抵抗胰島素作用或不產生足量胰島素來維持正常葡萄糖水平的慢性病症。此外，它也指處於疾病早期的人群中出現的代謝功能障礙，如血脂異常。本文所用術語「心血管病」指影響心臟和血管相關功能的異常病症。本文所用術語「安全和有效量」指足以產生所需的治療反應而不產生過度的不良副作用(如毒性、刺激或變態反應)某組分的用量，如本文所述使用時該用量應與合理的益處/風險比相稱。本文所用術語"治療有效量"指能有效產生所需治療反應的本文所述組合物的用量，例如，有效延遲動脈粥樣硬化斑塊出現的用量或在糖尿病患者中有效降低血糖水平和促進體重降低的用量。具體的安全和有效量或治療有效量取決於多種因素，例如所治療的具體病症、患者身體狀況、治療的哺乳動物或動物類型、治療持續時間、同時進行的治療(如果有)的性質和採用的具體製劑和化合物或其衍生物的結構。本文所用術語「治療」定義為將治療劑施加或給予患者，或將治療劑施加或給予由患者分離的組織或細胞系，該患者患有疾病、具有疾病症狀或疾病傾向，其目的是治療、治癒、減輕、緩解、改變、補救、改善、提高或影響該疾病、疾病症狀或疾病傾向。例如，尚未鑑定到疾病或失調的症狀或臨床相關表現的患者的「治療」是預防性或防止性治療，而鑑定到疾病或失調的症狀或臨床相關表現的患者的臨床、治癒性或緩解性「治療」通常不構成預防性或防止性治療。例如，在對象中治療2型糖尿病包括降低血糖水平和降低對象的體重。抑制 2型糖尿病疾病進展包括防止或抑制脂質代謝病症、降低胰島素抗性、防止或抑制脂質代謝失調、提高葡萄糖耐受等。治療2型糖尿病和抑制2型糖尿病疾病進展可包括緩解或防止糖尿病相關的症狀、失調或疾病，如代謝症候群、糖尿病性視網膜病、腎衰竭、血液循環不暢和與其相關的肢體疾病。各治療形式可被認為是本發明的不同方面。本文描述了包括常規分子生物學技術的方法。這些技術通常是本領域已知的， 詳見方法學著作，如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (《分子克隆實驗室手冊》)，第3版，第1-3卷，Sambrook等編，紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ),2001 ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (《新編分子生物學實驗指南》)，Ausubel等編，格林出版和韋利科學公司(Greene Publishing and Wiley-Interscience)，紐約，1992 (定期更新)。也可調整基因轉移和基因治療的常規方法，以便用於本發明。參見例如，Gene Therapy Principles and Applications (《基因治療原理和應用》)，Τ· Blackenstein編，施普林格公司(Springer Verlag), 1999 ；Gene Therapy Protocols (《基因治療方案》)(刊於 Methods in Molecular Medicine (分子醫學方法))，P. D. Robbins 編，休曼出版社(Humana Press)，1997 ；禾口 Retro-vectors for Human Gene Therapy (《人基因治療的逆轉錄載體》)，C. P. Hodgson編，施普林格公司，1996。免疫學技術通常是本領域已知的，詳見方法學著作，如Advances in Immunology (《免疫學進展》)，第93卷，Frederick W. Alt編，馬薩
(Academic Press, Burlington, ΜΑ), 2007 ；Making and Using Antibodies :A Practical Handbook (《製備和使用抗體實踐手冊》)，Gary C. Howard 和 Matthew R. Kaser編，佛羅裡達州伯克萊屯的CRC出版社(CRC Press, Boca Raton, Fl), 2006 ；Medical Immunology (《醫學免疫學》)，第6版，Gabriel Virella編，英國倫敦的 IHP 出版社(Informa Healthcare Press, London, England), 2007 ；以及 Harlow 禾口 Lane, ANTIBODIES =A Laboratory Manual (《抗體實驗室手冊》)，紐約州冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 1988。雖然在本發明的實施或測試中可以採用類似於或等同於本文所述的那些方法、組合物和藥盒/試劑盒，但是下面描述了合適的方法、組合物和藥盒/試劑盒。本文引用的所有出版物、專利申請和專利均通過引用全文納入本文。在牴觸的情況下，以本說明書(包括定義在內)為準。下文討論的具體實施方式
僅為說明性，不構成限制。發明詳述本發明基於以下發現某免疫刺激分子家族在糖尿病或脂質代謝功能障礙的患者和動物中上調，該家族對於心血管病的發生至關重要。本文所述的數據提供第一手證據表明MICA/B蛋白在2型糖尿病人類患者的血清中升高，並且將抗-NKG2D抗體注射到糖尿病小鼠中阻斷NKG2D配體相互作用並顯著抑制動脈粥樣硬化斑塊形成。本文所述數據還顯示NKG2D/配體介導的免疫激活參與了 2型糖尿病的疾病進展。將抗-NKG2D抗體注射到2型糖尿病動物模型中能夠治療糖尿病並顯著降低血糖水平。阻斷NKG2D/配體相互作用也能減輕異常的代謝病症，包括降低膽固醇和甘油三酯水平。因此，MICA/B和其他NKG2D配體是預測糖尿病患者發生2型糖尿病以及心血管病的新分子標記物，它們和NKG2D/配體相互作用是預防或治療2型糖尿病以及其他異常代謝病症或疾病(如血脂異常、糖尿病性視網膜病、血液循環不暢、肢體失調)和心血管病(如動脈粥樣硬化)的新靶點。因此，本發明提供檢測和治療2型糖尿病和其他異常代謝病症如心血管疾病或失調的新的方法、組合物和藥盒/試劑盒。NKG2D是多種免疫細胞如NK、NKT、ab T和gd T細胞表達的免疫刺激分子。通過關聯配體刺激NKG2D引起表達NKG2D的免疫細胞的激活。存在多種分子可用作NKG2D配體， 它們包括小鼠中的Rae-1、H60和Multl的成員，以及人體中的MICA/B和ULBP/RAET1蛋白質家族。大多數NKG2D配體在正常細胞中不表達或低水平表達，但在各種疾病狀況下上調， 進而激活表達NKG2D的免疫細胞。雖然這種免疫激活在宿主防禦如微生物免疫和腫瘤監控中起到重要作用，但它也可能產生免疫介導的疾病。在一個實施方式中，本發明提供檢測來自對象的生物樣品中的MICA/B蛋白，以檢測該對象的2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病的存在或預測發病的方法和藥盒/試劑盒。代謝功能障礙相關疾病包括高血糖、糖尿病性視網膜病、血液循環不暢、肢體失調和血脂異常(如高膽固醇和高甘油三酯)。本文實施例1中所示的數據表明，NKG2D配體在2型糖尿病患者中上調，其促進器官炎症和相關併發症。本文所述數據說明，在2型糖尿病人類患者的血清和動脈粥樣硬化斑塊中檢測到MICA/B蛋白水平升高。還發現在糖尿病或非糖尿病ApoE-/-小鼠(脂質代謝功能障礙和動脈粥樣硬化的動物模型)的血管(特別是動脈粥樣硬化病變區域)和肝臟中H60和Rae-I (視黃酸早期誘導基因_1)蛋白上調，以及在這些動物的血清中Multl上調 (參見實施例2)。因此，可利用NKG2D配體(如MICA/B蛋白或ULBP/RAET1蛋白)上調檢測2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病的存在或預測發病。檢測2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病發生傾向或者2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病的存在的典型方法包括從對象獲得生物樣品；使該生物樣品與檢測NKG2D配體表達(如MICA/B表達)的至少一種試劑相接觸； 測定該生物樣品中NKG2D配體的表達水平；和將NKG2D配體過度表達與該對象的2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病發病傾向相關聯。如實施例1所述數據所示，測定可溶性MICA/B的表達。然而，在一些實施方式中，可檢測MICA/B表達的膜形式。 代替MICA/B或除MICA/B外，可分析任何NKG2D配體的表達。例如，ULBP/RAET1蛋白質家族是NKG2D配體並發現其流入和存在於血清中，正如MICA/B那樣，因此使得這些蛋白質成為本文所述方法、組合物和藥盒/試劑盒的合適標記物。NKG2D配體描述於例如，Waldhauer， I.和 A. Steinle, Oncogene, 27 :5932-5943(2008)。在一些實施方式中，檢測NKG2D配體表達(如MICA/B表達)的試劑可包括任何合適試劑，如MICA/B抗體和可溶性NKG2D。生物樣品通常是血清。然而，可使用任何合適的生物樣品。其他生物樣品的例子包括生物活檢樣品、血漿、尿、皮膚、血液和唾液。可採用任何合適的方法或試驗來檢測對象生物樣品中NKG2D配體(如MICA/B)的表達水平。許多基於抗體的檢測形式是本領域眾所周知的，包括ELISA(酶聯免疫吸附實驗)、放射性免疫實驗、免疫印跡、蛋白質印跡、流式細胞術、免疫螢光實驗、免疫沉澱、蛋白 A實驗、免疫電泳實驗和其他相關技術。在一些實施方式中，通過檢測第一抗體上的標記測得抗體的結合。在另一實施方式中，通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結合測得第一抗體。在另一實施方式中，所述第二抗體帶有標記。本領域已知並在本發明的組合物、藥盒 /試劑盒和方法範圍內有多種方法用於在免疫試驗中檢測結合。可以在包括至少一種這些方法來檢測NKG2D配體(如MICA/B)表達的診斷試劑盒中提供MICA/B或其他NKG2D配體的特異性抗體。該試劑盒可包含其他組件，包裝、說明書或輔助進行蛋白質檢測和試劑盒使用的其他材料。在對象中檢測2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病的發病傾向或2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病的存在的方法包括將 MICA/B或其他NKG2D配體的過度表達與該對象2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病發生傾向或患有2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病相關聯。可通過將生物樣品中NKG2D配體(如MICA/B)的表達水平與NKG2D配體(如MICA/ B)表達的基線水平(也稱為對照水平)作比較，確定該生物樣品中是否過度表達一種或多種NKG2D配體(如MICA/B)。「基線水平」是對照水平，在一些實施方式中，是正常水平或在患有2型糖尿病、炎性疾病或其他代謝功能障礙相關疾病和具有心血管病傾向的對象中未觀察到的水平。因此，可根據NKG2D配體(如MICA/B)表達的對照或基線水平確定待分析2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病發生情況的樣品中NKG2D配體表達與基線水平相比是可檢測地提高(即過度表達、上調)、降低或是基本不變。在某些實施方式中，可由測試對象的早先樣品建立基線水平，以便隨時間監控該對象的疾病狀態和/ 或隨時間評估給定治療方案的功效。在檢測對象中2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病發病傾向或者2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關炎性疾病的存在的方法的一些實施方式中，還分析除NKG2D配體(如MICA/B)外的一種或多種標記物的表達。所述一種或多種標記物也可以是NKG2D配體；可分析任何NKG2D配體的表達。可檢測的其他標記物的例子包括C反應性蛋白、IL-6、TNF-α、sICAM-1、sCD40、ULBP/RAET1蛋白質家族(如 ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、RAET1G、RAET1L)等等。在分析除 NKG2D 配體(如 MICA/B)外的一種或多種標記物表達的實施方式中，NKG2D配體(如MICA/B)和其他生物標記物的組合可用於更可靠地預測血管疾病和/或代謝功能障礙相關疾病的發生。在這類實施方式中， 將生物樣品分別與檢測NKG2D配體表達的至少一種試劑和檢測除NKG2D配體(如MICA/B) 外的一種或多種標記物表達的兩種或多種試劑相接觸。測定NKG2D配體(如MICA/B)和所述兩種或多種其他標記物在生物樣品中的表達水平；並將NKG2D配體(如MICA/B)的過度表達與所述對象的2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和/或代謝功能障礙相關疾病(如血脂異常、糖尿病性視網膜病、血液循環不暢、肢體失調等)發生傾向相關聯。根據特定的兩種或多種其他標記物，可將它們的表達不足或過度表達與所述對象的2型糖尿病、心血管病、 炎性疾病和/或代謝功能障礙相關疾病發生傾向相關聯。
在另一實施方式中，本發明提供調節NKG2D配體(如MICA/B或ULBP/RAET1蛋白) 表達(如抑制MICA/B或ULBP/RAET1表達)和活性(如與NKG2D結合)，以治療患有2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關疾病的對象的組合物或方法。本文所述組合物也可用於治療傾向於發生和/或已發生心血管病(如動脈粥樣硬化)和/或患有代謝功能障礙相關疾病如高膽固醇或高甘油三酯、糖尿病、血脂障礙、糖尿病性視網膜病、血液循環不暢、肢體失調等的對象。這類組合物通常包含治療有效量的調節一種或多種NKG2D 配體(如MICA/B或ULBP/RAET1)表達或活性/信號轉導的藥劑和藥學上可接受的運載體。 NKG2D配體(如MICA/B或ULBP/RAET1)的抑制劑有效降低細胞中NKG2D配體水平和/或降低細胞中NKG2D配體活性。有效降低細胞中NKG2D配體水平的NKG2D配體(如MICA/B或 ULBP/RAET1)抑制劑可以是NKG2D配體編碼基因的轉錄或翻譯抑制劑。此外，有效降低細胞中NKG2D配體水平的NKG2D配體抑制劑可刺激NKG2D配體和/或NKG2D配體編碼RNA的降解。轉錄和/或翻譯抑制劑可以是基於核酸的抑制劑，如與靶NKG2D配體mRNA互補的反義寡核苷酸，以及具有切割靶mRNA的催化活性的核酶和DNA酶。在一些實施方式中，本文所述組合物包含NKG2D配體編碼基因的特異性siRNA。序列特異性siRNA結合靶核酸分子，抑制其表達。提供了遞送siRNA的組合物和治療方法。 構建和使用核酶、siRNA和反義分子的方法是本領域眾所周知的(例如，Isaka Y.，Curr Opin Mol Ther,9 :132-136(2007) ；Sioud M.禾口 Iversen P.O.，Curr Drug Targets,6 647-653(2005) ；Mouldy Sioud 的 Ribozymes and siRNA Protocols (核酶和 siRNA 方法) (Methods in Molecular Biology (分子生物學方法))，第2版，2004，紐約州紐約市的休曼出版社)。「反義」核酸可包含與編碼蛋白質的「有義」核酸互補的核苷酸序列，例如，與雙鏈 eDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補。反義核酸可以與整個MICA/B編碼鏈互補，或者僅與其一部分互補。在另一實施方式中，反義核酸分子與編碼NKG2D配體的核苷酸序列編碼鏈的「非編碼區」(如5'和3'非翻譯區)反義。反義物質可包括例如，約8-80個核鹼基(即約8-80個核苷酸)，例如，約8-50個核鹼基，或約12-30個核鹼基。反義化合物包括核酶、外部導向序列(EGQ寡核苷酸(寡酶(oligozymes))和與靶核酸雜交並調節其表達的其他短催化RNA或催化寡核苷酸。反義化合物可包括與靶基因序列互補的至少8個連續核鹼基的臂。寡核苷酸不需要與其特異性雜交的靶核酸序列100%互補。在需要特異性結合的條件下，即，在體內測定或治療性處理情況下處於生理條件，或者體外測定情況下處於進行該測定的條件，當寡核苷酸與靶點結合幹擾該靶分子的正常功能導致可用性喪失， 和有足夠的互補程度以避免寡核苷酸與非靶序列的非特異性結合時，該寡核苷酸為可特異性雜交。在一些實施方式中，調節NKG2D配體表達(如抑制MICA/B或ULBP/RAET1表達)和活性(如與NKG2D結合)以治療患有代謝功能障礙相關性炎性疾病如2型糖尿病，傾向於發生和/或已發生心血管病(如動脈粥樣硬化)和/或患有異常代謝病症如高膽固醇或甘油三酯水平、血脂異常、糖尿病性視網膜病等的對象的組合物包含治療有效量的阻斷NKG2D 與其一種或多種配體相互作用(如NKG2D/MICA/B相互作用)的藥劑、藥學上可接受的運載體和治療NKG2D/配體相互作用途徑以外途徑引起的心血管病、高血壓或代謝失調的已知藥物。治療心血管病的已知藥物的例子是3-羥基-3-甲基戊二醯基輔酶A還原酶抑制劑 (他汀類)中任何一種。他汀類的例子包括西立伐他汀、氟伐他汀、阿託伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀或洛伐他汀，或其藥學上可接受的鹽。包括他汀類的組合物和方法是本領域眾所周知的(參見例如，美國專利號6，465，454)。在另一實施方式中，本發明提供一種治療2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和/或異常代謝病症(如高膽固醇水平、高甘油三酯水平、血脂異常、血液循環不暢、肢體失調、 糖尿病性視網膜病等)的組合物，其包含阻斷NKG2D與其一種或多種配體相互作用(如 NKG2D/MICA/B相互作用)的藥劑和藥學上可接受的運載體。在另一實施方式中，所述組合物包含抑制NKG2D激活或信號轉導的藥劑和藥學上可接受的運載體。本文實施例3所示數據表明，用抗-NKG2D抗體阻斷NKG2D配體結合相互作用能夠抑制糖尿病ApoE-/-小鼠的斑塊形成，而不改變NKG2D表達細胞的數量。可採用任何適合阻斷NKG2D與其一種或多種配體相互作用(如NKG2D/MICA/B 相互作用)或者抑制NKG2D激活或信號轉導的藥劑。例如，所述藥劑可選自下組可溶性 NKG2D、特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。抑制NKG2D激活或信號轉導或者阻斷NKG2D與其一種或多種配體相互作用的典型藥劑是特異性結合NKG2D的抗體。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段結合人 NKG2D(hNKG2D)。可採用任何合適的特異性結合NKG2D的抗體。本文所述的抗-NKG2D抗體包括多克隆和單複製人抗體，或具有免疫球蛋白可變區的至少一個抗原結合區的抗原結合片段部分，所述抗體特異性結合NKG2D。如果用該多肽的表位產生抗體且至少與天然或重組蛋白的一部分結合，則該抗體對NKG2D有特異性。抑制NKG2D激活或信號轉導的另一藥劑例子是特異性結合NKG2D配體(如MICA/B、ULBP)的抗體。可採用任何合適的特異性結合NKG2D 配體的抗體。通過競爭性抑制確定單克隆抗體特異性和親和力的方法可參見Harlow等， Antibodies =A Laboratory Manual (《抗體實驗室手冊》)，紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), 1988, Colligan等編，Current Protocols in Immunology (《新編免疫學實驗指南》)，紐約的格林出版聯合公司禾口韋利禾鬥學公司(Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N. Y.)，(1992，1993)和 Muller，Meth. Enzymo 1. 92 :589-601 (1983)，所述參考文獻通過引用全文納入本文。在一些實施方式中，特異性結合NKG2D的抗體是具有下述序列的人單克隆抗體 16F16、16F31、MS和21F2。在一些實施方式中，所述抗體是人單克隆抗體MS。這些抗體的全長、可變和CDR序列見表1。表1. 16F16、16F31、MS和21F2的全長、可變和CDR胺基酸序列
權利要求
1.治療有效量的抑制對象中NKG2D激活或信號轉導的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。
2.治療有效量的阻斷對象中NKG2D配體結合相互作用的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。
3.治療有效量的抑制對象中NKG2D激活或信號轉導的藥劑在治療可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症中的用途，其中所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。
4.治療有效量的阻斷對象中NKG2D配體結合相互作用的藥劑在治療可通過抑制NKG2D 來調節或正常化的病症中的用途，其中所述病症選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關疾病。
5.如權利要求1-4中任一項所述的用途，其特徵在於，所述對象是人。
6.如權利要求1-5中任一項所述的用途，其特徵在於，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。
7.如權利要求6所述的用途，其特徵在於，所述藥劑是特異性結合NKG2D的抗體或其抗原結合片段。
8.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述抗體或其抗原結合片段是人或人源化的。
9.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述抗體或其抗原結合片段結合人 NKG2D(hNKG2D)。
10.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述抗體或其抗原結合片段降低NKG2D介導的NKG2D表達細胞的激活或信號轉導。
11.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述抗體或其抗原結合片段與至少一種 NKG2D配體競爭結合NKG2D。
12.如權利要求11所述的用途，其特徵在於，所述NKG2D配體是MICA/B。
13.如權利要求1-12中任一項所述的用途，其特徵在於，所述藥劑給予導致所述對象出現下述反應中至少一種血糖水平降低、葡萄糖耐受提高、胰島素抗性降低、體重降低、血壓降低、炎症減輕或代謝功能障礙減輕。
14.如權利要求1-13中任一項所述的用途，其特徵在於，所述藥劑經靜脈內、腹膜內或皮下途徑給予。
15.如權利要求1-13中任一項所述的用途，其特徵在於，所述用途還包括至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食慾調節藥、抗高血壓藥、治療和/或預防糖尿病導致或與糖尿病相關的併發症的藥劑、和治療和/或預防肥胖導致或與肥胖相關的併發症和失調的藥劑。
全文摘要
本發明提供治療和檢測2型糖尿病和/或可通過抑制NKG2D來調節或正常化的病症如心血管病的方法、組合物和藥盒/試劑盒。
文檔編號A61K39/395GK102548573SQ201080034480
公開日2012年7月4日 申請日期2010年8月16日 優先權日2009年8月17日
發明者D·H·羅萊, J·S·彼得森, T·B·博德瓦爾斯多坦, 夏明燦, 熊那 申請人:加利福尼亞大學董事會, 賓州研究基金會