細胞角質蛋白19片段(cyfra21-1)定量測定試劑盒及其檢測方法

2023-08-09 22:24:16

專利名稱：細胞角質蛋白19片段(cyfra21-1)定量測定試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及測定血清的試劑盒及其測試方法，尤其是涉及測定血清中細胞角質蛋白19片段(CYFRA21-1)含量的試劑盒及其測試方法。
背景技術：
細胞角蛋白19(CYK_19)是一分子量約40，OOODa的I類角蛋白(酸性蛋白)，是角蛋白家族中最小的成員。CYK-19廣泛分布在正常組織表面，如層狀或鱗狀上皮中。在惡性上皮細胞中，激活的蛋白酶加速了細胞的降解，使得大量細胞角蛋白片段釋放入血，其可溶性片段可與兩株單克隆抗體KS19. 1和BM19. 21特異性結合，故稱為CYFRA21-1。CYFRA21-1 分子量約30，000Da。在惡性肺癌組織中，CYFRA21-1含量豐富，尤其是在肺鱗癌中有高表達。CYFRA21-1對各型肺癌診斷的敏感性依次為鱗癌>腺癌>大細胞癌>小細胞癌。從檢測角度上來說，目前臨床上用於測定CYFRA21-1的方法主要有放免法、ELISA法、化學發光法等。過去以放免為代表的細胞角質蛋白19片段(CYFRA21-1)測定試劑盒受方法學的限制，其靈敏度和抗幹擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場，目前應用較多的為酶聯免疫檢測技術和化學發光技術。化學發光技術興起於上個世紀80年代是繼酶聯免疫技術和放免技術之後發展起來的新興技術，由於其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標記結合物穩定，無放射性同位素損傷和汙染等特點，在近些年得到了飛速發展。磁微粒分離酶聯免疫檢測技術是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術與酶聯免疫檢測技術相結合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳統ELISA方法， 抗原、抗體的結合反應是在固相(ELISA板反應孔)表面進行的，而磁微粒分離酶聯免疫檢測方法，抗原、抗體的結合反應也在近似液相的條件下進行，因而反應快速、徹底。與傳統 ELISA相比具有靈敏度高，檢測用時少的優點。

發明內容
本發明需要解決的技術問題在於提供一種細胞角質蛋白19片段(CYFRA21-1)定量測定試劑盒及其檢測方法，採用該試劑盒進行CYFRA21-1檢測具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測結果的時間和更簡便的操作方式。本發明提供了一種細胞角質蛋白19片段(CYFRA21-1)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有CYFRA21-1磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，校準品、質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。所述的磁分離試劑含有標記有抗CYFRA21-1單克隆抗體的磁性微球。所述的酶反應物是含有鹼性磷酸酶標記的抗CYFRA21-1單克隆抗體。所述的反應增強劑是含有Tris的緩衝液。所述稀釋液是含有BSA溶液。
所述的校準品及質控品是含有一定量的CYFRA21-1抗原的BSA蛋白溶液。所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftx)Clin-300的緩衝液。所述的底物溶液為酶促化學發光底物溶液。本發明細胞角質蛋白19片段(CYFRA21-1)的定量測定試劑盒的製備方法，包括下述步驟第一步磁分離試劑的製備過程一、磁珠緩衝液配製操作步驟，配製IL 1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 於 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 於 20ml 容器中加適量水使其完全溶解後，倒入上述容器中；2、用移液器將ftOclin-300量取0. 2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中，然後在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；3、調節PH計測量其PH值，調PH，控制PH在7. 95-8. 05之間；4、稱取BSA 3g倒入上述IL容器中；5、最後定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾；過濾完後貼好標籤於2_8°C冷庫貯存。二、磁分離試劑的製備過程1、將1. Omg辛二酸二琥珀醯亞胺酯溶於50ul DMSO中，取2mg抗CYFRA21-1單克隆抗體溶於PH 9. 5的0. lmol/L PB緩衝液中至總體積為Iml ；2、確定辛二酸二琥珀醯亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀醯亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min ；3、將步驟2抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中然後放入到高速冷凍離心機中在3000g下濃縮30min至體積為0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘後吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重複操作3次； 將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻後室溫反應4小時；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分鐘；7、每次加入1. 5ml PH 7. 2 0. lmol/L PB清洗已經標記的磁珠，混勻30秒，上架，
去上清，重複操作3次；8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0. 05%的CYFRA21-1磁分離試劑；磁珠保存液配方為0. 1% BSA, 0. 05%吐溫-20，0. 02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。9、將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩衝液按照1 1的比例混勻，即得本發明試劑盒中磁分離試劑。第二步酶反應物製備過程一、酶反應物稀釋液配製操作步驟，配製IL 1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. 0g、Zncl2 0. 05g、Proclin-300 0. 2ml 禾口 MgCl2 0. 05g 於燒瓶中，然後在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；2、調 PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 範圍內；3、稱取BSA 3g倒入上述燒杯中；4、最後定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾即得。
二、鹼性磷酸酶ALP與抗CYFRA21-1單克隆抗體的偶聯1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮
至1毫升；2、向步驟1獲得濃縮液中加入0. 2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然後裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜，收集保留液；3、向步驟3獲得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩衝液，使PH升高到9. 0，然後立即加入2. 5mg抗CYFRA21-1單克隆抗體，室溫避光輕輕攪拌2小時，再加入0. Iml的^ig/ ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小時；4、將上述液裝入透析袋中，對0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時，然後 3000rpm離心半小時，棄上清，沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，最後沉澱物溶於20ml的 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB緩衝鹽水透析5個小時去除銨離子，收集保留液後10，OOOrpm離心30分鐘去除沉澱，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM皿8(12溶液，即得鹼性磷酸酶(ALP)與CYFRA21-1單克隆抗體的偶聯物，最後將收集到的鹼性磷酸酶(ALP)與CYFRA21-1單克隆抗體的偶聯物用上述酶反應物稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應物。第三步反應增強劑配製步驟，配製IL 1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g於IL容器中；用移液器將ftx)clin-300量取 0. 2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解調PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之間；3、稱取Mak33 0. 9g於上述IL容器中；最後定容1000ml，完全溶解後，用0. 2um濾
器過濾ο第四步稀釋液配製步驟，配製IL 1、稱取 NaC19. Og 和 BSA 60g 於 IL 的容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 5ml加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最後定容1000ml，完全溶解後，用0. 2um濾器過濾，貼好標籤於2_8°C冷庫貯存， 有效期為12個月。第五步校準品和質控品的配製校準品濃度分別為5、15、30、80、160ng/ml ；質控品濃度分別為15、80ng/ml。第六步清洗濃縮液配製步驟，配製IL 1、稱取 TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 於 IL 容器中；2、稱取5g Tween-20於IOOml容器中加20ml水使其完全溶解後，倒入上述IL容器中；3、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml於盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解後， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解；5、調PH，控制其範圍在7. 35-7. 45之間；6、最後定容1000ml，完全溶解後用0. 2um濾器過濾即得。第七步底物溶液配製步驟，配製IL 1、稱取 TRIS 2.35g、NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 於 IL 燒杯中；2、用量筒量取600ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調PH，控制其範圍在7. 95-8. 05之間；3、加入250ml Lumi-Phos 480後，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻後即得。本發明工作原理本品為夾心法化學發光免疫分析法與磁性微粒分離技術相結合的一種檢測方法。在標本、校準品和質控品中加入定量的酶標CYFRA21-1單抗、結合著磁性微粒的CYFRA21-1單克隆抗體及穩定增強劑。37°C孵育後，磁性微粒上結合的CYFRA21-1單克隆抗體與酶標單克隆抗體分別與CYFRA21-1分子的不同表位結合，形成「三明治」結構。 在外加磁場中直接沉澱，不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉澱的複合物，然後加入酶促化學發光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到基態時便發出光子，形成發光反應，即可使用發光儀檢測反應的發光強度，根據標準曲線即可算出樣品中的CYFRA21-1含量。在檢測範圍內，發光強度與樣本中的CYFRA21-1 濃度成正比。本發明的主要創新之處在於1、本發明試劑盒將化學發光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，本發明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，同時在出結果時間上相對現有技術縮短了至少10分鐘，並達到了較佳的性能參數。2、本發明公開了一種新的專用穩定增強劑以及清洗液濃縮液，使得反應過程更加穩定可靠，實驗數據靈敏有效，在提高產品性能的同時，並且大大降低了產品成本；3、試劑盒中的磁分離試劑，酶反應物，穩定增強劑，校準品、質控品，清洗液濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應體系下的最優配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
具體實施例方式實施例1、一、磁珠緩衝液配製操作規程配方見表1，以配製IL為例1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 於 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 於 20ml 容器中加適量水使其完全溶解後，倒入上述容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml於少量純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；然後在IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；3、調節PH計測量其PH值；用HCl或NaOH調PH，測量其PH在7. 95-8. 05之間即符合要求；4、稱取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；5、最後定容至1000ml，測PH值，範圍在7. 95-8. 05之間即符合要求，用0. 2um濾器過濾；過濾完後貼好標籤於2_8°C冷庫貯存，磁珠緩衝液有效期為12個月；磁珠緩衝液表權利要求
1.一種細胞角質蛋白19片段CYFRA21-1的定量測定試劑盒，其特徵在於，該試劑盒包含CYFRA21-1磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，CYFRA21-1校準品、CYFRA21-1質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的CYFRA21-1磁分離試劑含有標記有抗CYFRA21-1單克隆抗體的磁性微球；所述的酶反應物是含有鹼性磷酸酶標記的抗CYFRA21-1單克隆抗體；所述的反應增強劑是含有Tris的緩衝液；所述稀釋液是含有BSA的溶液；所述的校準品及質控品是含有一定量的CYFRA21-1抗原的BSA溶液；所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftOclin-300的緩衝液；所述的底物溶液為酶促化學發光底物溶液。
3.如權利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中各組分按照如下製備方法製得一、磁分離試劑的製備過程一)、磁珠緩衝液配製操作步驟，配製IL·1、稱取TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 於 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 於 20ml 容器中加適量水使其完全溶解後，倒入上述IL容器中；·2、用移液器將I^roclin-SOO量取0.2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述 IL容器中，然後在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；·3、調節PH,控制PH在7.95-8. 05之間；·4、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；·5、最後定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、磁分離試劑的製備過程·1、將1.Omg辛二酸二琥珀醯亞胺酯溶於50ul DMSO中，取2mg抗CYFRA21-1單克隆抗體溶於PH 9. 5的0. lmol/L PB緩衝液中至總體積為Iml ；·2、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀醯亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫 90min ；·3、將步驟2的溶液加入到濃縮管中，然後放入到高速冷凍離心機中在3000g下離心 30min 濃縮至 0. 5ml ；·4、取0.5ml磁珠，加入5ml反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘後吸取上清，然後加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB，混勻30秒，然後加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻後室溫反應4小時；·5、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘，然後加入 1. 5ml PH 7.2 0. lmol/L PB 清洗已經標記的磁珠，混勻30秒；·6、用100ml磁珠保存液將磁珠轉入玻璃瓶；·7、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩衝液按照1 1的體積比例混勻，即得權利要求 1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；二、酶反應物的製備過程一)、酶反應物稀釋液配製操作步驟，配製IL ·1、取 Tris 6.06g、NaCl 13. Og^Zncl2 0. 05g、Proclin_300 0. 2ml 和 MgCl2 0. 05g 於燒 瓶中，然後在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；·2、調PH,控制PH在7.35-7. 45範圍內;·3、稱取BSA3g倒入上述燒杯中；·4、最後定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、鹼性磷酸酶ALP與抗CYFRA21-1單克隆抗體的偶聯·1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮至1毫升；·2、向步驟1獲得濃縮液中加入0.2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然後裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜，收集保留液；·3、向步驟2獲得保留液中加入0.2M PH9. 5碳酸鹽緩衝液，使PH升高到9. 0，然後立即加入2. 5mg抗CYFRA21-1單克隆抗體，攪拌2小時，再加入0. Iml的4mg/ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小時；·4、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；·5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C1小時，然後3000rpm離心半小時，棄上清，沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，最後沉澱物溶於20ml的0. 15M PH7. 4的 PBS 中；·6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4的PB緩衝液透析5個小時去除銨離子，收集保留液後10，OOOrpm離心30分鐘去除沉澱，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得鹼性磷酸酶ALP與抗CYFRA21-1單克隆抗體的偶聯物；將收集到的鹼性磷酸酶ALP與抗CYFRA21-1單克隆抗體的偶聯物用上述步驟一)獲得的酶反應物稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應物。三、反應增強劑的製備過程，配製IL·1、取TRIS1. 56g 和 NaCl 4. 23g 於 IL 容器中，取 0. 2ml Proclin-300 於 IOml 純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；·2、取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調PH在7.35-7. 45之間；·3、稱取Mak330.9g於上述IL容器中；最後定容1000ml，完全溶解後，用0. 2um濾器過濾即得；四、稀釋液的製備過程，配製IL:·1、稱取NaC19.Og和BSA 60g於IL的容器中；·2、取0.5ml Proclin-300加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；·3、最後定容1000ml，完全溶解後，用0.2um濾器過濾即得；五、CYFRA21-1校準品和CYFRA21-1質控品的配製CYFRA21-1 校準品中 CYFRA21-1 抗原的濃度分別為 5、15、30、80、160ng/ml ；CYFRA21-1 質控品中CYFRA21-1抗原的濃度分別為15、80ng/ml ；六、清洗液濃縮液的製備過程，配製IL·1、取TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 於 IL 容器中；·2、取5gTween-20於IOOml容器中加20ml水使其完全溶解後，倒入上述IL容器中；·3、取0.2ml Proclin-300於盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；·4、取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解；·5、調PH，控制其範圍在7.35-7. 45之間；·6、最後定容1000ml，完全溶解後用0.2um濾器過濾即得； 七、底物溶液的製備過程，配製IL ·1、取TRIS 2. 35g,NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 於 IL 燒杯中；·2、取600ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH在7.95-8. 05之間；·3、加入250mlLumi-Phos 480，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻後即得。
4、如權利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒的使用方法如下1)、加15μ 1 CYFRA21-1校準品、CYFRA21-1質控品、待測標本至對應試管底部；2)、加30μ 1酶反應物至每一試管中；3)、加30μ 1反應增強劑至每一試管中；4)、加30μ 1磁分離試劑至每一試管中；5)、用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s後，置37°C水浴30分鐘；6)、然後放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉澱2分鐘，倒轉分離器倒出上清液；7)、清洗液濃縮液用純化水稀釋20倍後，加200μ 1稀釋後的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ；8)、加200μ 1底物溶液至試管中混勻3秒，發光檢測儀檢測。
5、如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述待測標本為高值HOOK樣本時，根據需要使用稀釋液對標本進行稀釋。
全文摘要
本發明公開了一種細胞角質蛋白19片段CYFRA21-1的定量測定試劑盒，其特徵在於，該試劑盒包含CYFRA21-1磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，CYFRA21-1校準品、CYFRA21-1質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。本發明還公開了該試劑盒的製備方法。本發明試劑盒將化學發光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，本發明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，並達到了較佳的性能參數，並且大大降低了產品成本。
文檔編號G01N33/68GK102426245SQ20111025747
公開日2012年4月25日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者不公告發明人 申請人:內蒙古科慧生物科技有限責任公司