臍帶血幹細胞增殖和生長因子產生的鋰刺激的製作方法

2023-08-10 12:39:16

專利名稱：臍帶血幹細胞增殖和生長因子產生的鋰刺激的製作方法
臍帶血幹細胞增殖和生長因子產生的鋰刺激本申請是2007. 10. 31提交的CN 200780046542. 0，題為「臍帶血幹細胞增殖和生長因子產生的鋰刺激」的分案申請。相關申請的交叉引用本申請要求2006年11月I日提交的美國臨時申請No. 60/856，071的優先權，其公開對於所有目的通過引用完整地整合在本申請中。
背景技術：
對於人幹細胞的鑑定、分離和產生存在著相當大的興趣。人幹細胞通常是能夠自我更新並產生各種成熟的人的細胞系的全能或多能的前體細胞。這一能力是組織和器官發 育所必需的細胞分化和特化的基礎。最近在幹細胞移植方面的成功已經為由於疾病、接觸有毒化學品和/或輻射所引起的骨髓肅清(myeloablation)後的骨髓重建和/或補充提供了新的臨床工具。進一步的證據證明，幹細胞可以用於重塑許多(如果不是所有)組織並恢復生理和解剖學功能性。已經對許多不同種類的哺乳動物幹細胞進行了表徵。例如，胚胎幹細胞、胚胎生殖細胞、成人幹細胞以及其他承認的幹細胞或祖細胞是已知的。事實上，對某些幹細胞不但進行了分離和表徵，而且在允許有限程度分化的條件下對其進行了培養。由於人群中HLA類型的數千萬種可能組合，存在著一個基本問題，即非常難以獲得充分數量、種群和多樣性的能夠分化成能與單個患者HLA匹配的所有細胞類型的人幹細胞HLA類型。不同HLA類型的幹細胞的供給嚴重短缺。由於其在各種疾病和症狀(包括惡性腫瘤、先天性代謝缺陷、血紅蛋白病和免疫缺陷)治療中的重要性，獲得各種HLA類型的幹細胞的足夠來源會是非常有利的。出於幾個原因難以獲得足夠數量的人幹細胞。首先，部分是由於在血液和組織中所發現的數量非常有限，在成人組織中分離正常產生的幹細胞群在技術上是困難的且昂貴的。其次，從胚胎或胎兒組織(包括流產胎兒)中獲得這些細胞引起了倫理問題。因此，不需要使用從胚胎或胎兒組織中獲得的細胞的其他來源是進一步發展幹細胞臨床使用的根本問題。然而，只有很少的幹細胞、尤其是人幹細胞的可行的其他來源，因此其供給是受到限制的。而且，從其他來源獲得用於治療和研究目的的足夠數量幹細胞通常是費力的。例如，美國專利No. 5，486，359公開了源自骨髓的人間葉細胞樣幹細胞(HMSC)組合物。通過對不含與造血細胞或分化的間葉細胞相關標誌的粘附骨髓或骨膜細胞的陽性選擇獲得均一的HMSC組合物。所分離的間葉細胞樣細胞群表現出與間葉細胞樣幹細胞相關的特徵、具有在培養基中不分化而再生的能力、並且在體外誘導或體內置於受損組織處時具有分化成特定間葉細胞系的能力。然而，這樣的方法的缺點在於，為了隨後進行HMSC分離，首先需要從供體中以侵入和疼痛的方式收集骨髓或骨膜細胞。臍帶血是另一種已知的間葉細胞樣幹細胞以及造血幹細胞和祖細胞的來源。臍帶血幹細胞通常冷凍保藏用於重建造血功能，這是骨髓和其他相關移植中使用的一種治療方法(參見例如美國專利5，004, 681和5，192，553)。用於收集臍帶血的常規技術基於使用針或套管，其在重力幫助下將臍帶血從胎盤排出(參見例如美國專利5，004，681,5, 192，553、5，372，581和5，415，665)。針或套管通常置於臍帶經脈中，並輕輕按摩胎盤以幫助臍帶血從胎盤排出。然而，由臍帶血獲得幹細胞的主要限制在於所獲得的臍帶血體積經常不足，導致細胞數量不足以在移植後有效重建骨髓。幹細胞具有在大量各種疾病和損傷的治療中使用的潛力，這包括神經系統損傷(例如脊髓損傷)、惡性腫瘤、遺傳疾病、血紅蛋白病和免疫缺陷。然而，由於其收集的限制、通常從臍帶血收集的細胞數量不足(尤其是如果用於治療成年患者)、以及建立大臍帶血庫的高成本，臍帶血幹細胞嚴重短缺。因此，在本領域內，對於在細胞培養體系中能夠將幹細胞擴展到足以進行移植的數量的臍帶血幹細胞培養方法存在著強烈需求。在本領域內對於提高所移植的幹細胞的生長和存活並降低或延緩受體中的幹細胞排斥的方法也存在需求。本發明滿足了這些和其他需求。發明概述本發明提供了使用含鋰鹽的體外細胞培養體系刺激人臍帶血幹細胞產生生長因子的方法以及擴展(expanding)臍帶血幹細胞的方法。本發明也提供了通過移植前用鋰鹽 處理細胞提高所移植的臍帶血幹細胞的存活和生長的體內方法。本發明進一步提供了通過移植後給予鋰鹽降低所移植的臍帶血幹細胞排斥的體內方法。本發明部分基於鋰刺激幹細胞產生或表達生長因子這一意外發現上。不局限於任何具體理論，鋰對幹細胞增殖、存活和免疫排斥的作用是由幹細胞對鋰鹽的應答中產生或表達的生長因子的數量所介導的。因此，在一個方面，本發明提供了用於刺激人臍帶血細胞產生生長因子的方法，所述方法包括在含鋰鹽的培養基中培養所述細胞。鋰通常刺激諸如細胞存活因子、抗分化因子及其組合的生長因子的產生和表達。細胞存活因子的例子包括但不限於神經營養蛋白、細胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、肝素結合表皮生長因子(ΗΒ-EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、色素上皮細胞衍生因子(PEDF)、神經鞘瘤衍生生長因子(SDGF)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子a (TGF-α )、轉化生長因子-β(TGF-β )、骨形態發生蛋白(例如BMP I-BMP 15)、生長分化因子-9 (⑶F-9)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、肌肉生長抑制素(myostatin)(⑶F-8)、紅細胞生成素(ΕΡ0)、血小板生成素(ΤΡ0)、以及它們的組合。白血病抑制因子(LIF)是一種優選的抗分化因子。神經營養蛋白的例子包括但不限於神經營養蛋白-I (NT-1)、神經營養蛋白-3(NT-3)、神經營養蛋白-4 (NT-4)、大腦衍生神經營養因子(BDNF)、膠質細胞系衍生神經營養因子(⑶NF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經生長因子(NGF)、以及它們的組合。非限制性的細胞因子的例子包括IL-I a、IL-I β、IL_2、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、TNF-a、IFN-a、IFN-β、IFN-y、CXCL1/GR01/GR0a、CXCL2/GR02、CXCL3/GR03、CXCL4/PF-4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15、CXCL16、CXCL17/DMC、CCLI、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1 a、CCL4/MIP-I β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/CCL10、CCLll/ 嗜伊紅粒細胞趨化蛋白(Eotaxin)、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/MIP-5、CCL16/LEC、CCL 17/TARC、CCL 18/MIP-4、CCL 19/MIP-3 β、CCL20/MIP-3 α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF1、CCL24/嗜伊紅粒細胞趨化蛋白_2、CCL25/TECK、CCL26/嗜伊紅粒細胞趨化蛋白-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CL1、CL2、CX3CLU 以及它們的組合。適用於本發明所述方法的鋰鹽的例子包括但不限於氯化鋰、碳酸鋰以及硫酸鋰。優選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在一些實施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約O. 5至約5mM的濃度(例如約 O. 5、1、1· 5、2、2· 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、3、3· 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4· 5 或5mM)存在於所述細胞培養基中。在一優選實施方式中，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在於細胞培養基中。在某些情況下，可以用鋰模擬化合物(lithium mimetic compound)培養所述胳帶血細胞(參見例如 Gould 等，Neuropsychopharmacology, 30:1223-1237 (2005)；以及Gould, Expert Opin. Ther. Targets, 10:377-392 (2006))。在某些其他情況下，可以用類似於鋰的精神藥物培養所述臍帶血細胞，例如丙戍酸(參見例如Hahn等，J. Psychiatr.Res. ,39:355-363(2005) ;Shao 等，Biol. Psychiatry, 58:879-884 (2005);以及 Dokucu 等， Neuropsychopharmacology, 30:2216-2224 (2005))、丙戍酸二鈉(參見例如 Calabrese 等，Am. J. Psychiatry, 162:2152-2161 (2005))、以及卡巴咪嗪(參見例如 Bazinet 等，Biol.Psychiatry,59:401-407 (2006))。在一些實施方式中，首先將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿並隨後用鋰鹽培養存在於耗盡血漿的臍帶血單位中的幹細胞。在其他實施方式中，首先將收集的臍帶血單位基本耗盡紅細胞並隨後用鋰鹽培養存在於耗盡紅細胞的臍帶血單位中的幹細胞。可以在含鋰鹽的培養基中使用精通本領域的人員已知的任何體外培養技術在耗盡血漿或耗盡紅細胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之後對所述臍帶血幹細胞進行培養。另一方面，本發明提供了用於擴展人臍帶血細胞的方法，該方法包括在含鋰鹽的培養基中培養所述細胞。適當的鋰鹽包括但不限於氯化鋰、碳酸鋰和硫酸鋰。優選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在一些實施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約O. 5至約5mM的濃度(例如約O. 5、1、1. 5、2、
2.5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、3、3· 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4· 5 或 5mM)存在於所述細胞培養基中。在一優選實施方式中，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在於所述細胞培養基中。在某些情況下，可以用鋰模擬化合物培養所述臍帶血細胞。在某些其他情況下，可以用類似於鋰的精神藥物培養所述臍帶血細胞，例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、卡巴咪嗪、以及它們的組合。如上所述，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿並隨後可以用鋰鹽培養存在於耗盡血漿的臍帶血單位中的幹細胞。另外，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡紅細胞並隨後可以用鋰鹽培養存在於耗盡紅細胞的臍帶血單位中的幹細胞。可以在含鋰鹽的培養基中使用精通本領域的人員已知的任何體外培養技術在耗盡血漿或耗盡紅細胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之後對所述臍帶血幹細胞進行培養。另一方面，本發明提供了用於提高對象中所移植的人臍帶血細胞的存活和生長的方法，所述方法包括(a)在含鋰鹽的培養基中培養所述細胞；以及(b)將步驟(a)的細胞給予對象。適用於本發明所述方法用於提高所移植的臍帶血細胞的存活和生長的鋰鹽的例子包括但不限於氯化鋰、碳酸鋰和硫酸鋰。優選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在一些實施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約O. 5至約5mM的濃度(例如約O. 5、I、I. 5、2、2. 5,2. 6,2. 7,2. 8、
2.9、3、3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4. 5或5mM)存在於所述細胞培養基中。在一優選實施方式中、所述鋰鹽以約3mM的濃度存在於所述細胞培養基中。在某些情況下，可以用鋰模擬化合物培養所述臍帶血細胞。另外，可以用類似於鋰的精神藥物培養所述臍帶血細胞，例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、卡巴咪嗪、以及它們的組合。如上所述，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿並隨後可以用鋰鹽培養存在於耗盡血漿的臍帶血單位中的幹細胞。另外，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡紅細胞並隨後可以用鋰鹽培養存在於耗盡紅細胞的臍帶血單位中的幹細胞。可以在含鋰鹽的培養基中使用精通本領域的人員已知的任何體外培養技術在耗盡血漿或耗盡紅細胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之後對所述臍帶血幹細胞進行培養。所述對象通常是一種哺乳動物，如人。在對象已被診斷為諸如脊髓損傷的損傷的情況下，所述培養的細胞優選脊柱內給藥。 在某些情況下，所述方法進一步包括將鋰鹽(如氯化鋰)給予哺乳動物(如人)。所述鋰鹽(例如氯化鋰)通常通過包括但不限於口服、鞘內、心室內、皮下、腹膜內、靜脈內、以及肌內的方式給予。在一些實施方式中，所述鋰鹽以約lmg/kg至約150mg/kg(例如約1、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75、100、125、或 150mg/kg)的劑量給予所述對象。在一優選實施方式中，所述鋰鹽以約10mg/kg的劑量給藥。本發明所述培養的細胞和鋰鹽可以單獨或與根據給藥途徑和常規製藥實踐所選擇的製藥上允許的載體混合給藥。作為非限制性實例，可以將常規緩衝鹽溶液(例如約135-150mM NaCl)用作製藥上允許的載體。其他適當的載體包括但不限於水、緩衝的水、
O.4%鹽溶液、O. 3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓製藥科學》(REMINGTON S PHARMACEUTICALSCIENCES),賓夕法尼亞州費城麥克出版社(Mack Publishing Co.，Philadelphia, PA),第18版，(1995))中描述了其他適用於運送本發明所述培養的細胞和鋰鹽的載體。另一個方面，本發明提供了用於降低對象中所移植的臍帶血細胞排斥的方法，所述方法包括細胞移植後將鋰鹽給予所述對象。所述對象通常是哺乳動物(如人)。在對象已被診斷為諸如脊髓損傷的損傷的情況下，所述細胞優選通過脊柱內給藥移植。適用於本發明所述方法的鋰鹽的非限制性實例包括氯化鋰、碳酸鋰、和硫酸鋰。優選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在某些情況下，可以在細胞移植前使用體外培養技術在含鋰鹽的培養基中對臍帶血幹細胞進行擴展。所述臍帶血幹細胞可以從所收集的基本耗盡血漿和/或紅細胞的臍帶血單位中獲得。所述鋰鹽(例如氯化鋰)通常通過包括但不限於口服、鞘內、心室內、皮下、腹膜內、靜脈內、以及肌內等方式給藥。在一些實施方式中，所述鋰鹽以約lmg/kg至約150mg/kg(例如約 1,5,6,7,8,9,10,11, 12，13，14，15，20，25，50，75，100，125，或 150mg/kg)的劑量對所述對象給藥。在一優選實施方式中，所述鋰鹽以約10mg/kg的劑量給藥。在某些情況下,可以用鋰模擬化合物或類似於鋰的精神藥物(例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、和/或卡巴咪嗪)對對象給藥以降低所移植的臍帶血幹細胞的排斥。本發明所述的鋰鹽可以單獨或與根據給藥途徑和常規製藥實踐所選擇的製藥上允許的載體混合給藥。作為非限制性實例，可以將常規緩衝鹽溶液(例如約135-150mMNaCl)用作製藥上允許的載體。其他適當的載體包括但不限於水、緩衝的水、O. 4%鹽溶液、
O.3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓製藥科學》(REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES),賓夕法尼亞州費城麥克出版社，第18版，(1995))中描述了其他適用於運送本發明所述鋰鹽的載體。所述鋰鹽可以在細胞移植後幾分鐘、幾小時、幾天、幾周、幾個月和/或幾年內給予對象。在一些實施方式中，細胞移植後可以用第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多劑量的相同或不同的鋰鹽對對象進行治療。在某些情況下，也可以在細胞移植前和/或細胞移植過程中用I個或多個劑量的所述鋰鹽對對象給藥。本發明的其他特徵、目標和優點及其優選實施方式會通過以下的詳細描述、實施例和權利要求加以明確。


·圖I顯示了證明鋰促進N01. I細胞體外增殖的數據。圖2顯示了證明鋰刺激N01. I細胞體外生成生長因子的數據。圖3顯示了通過定量實時PCR測定的證明鋰促進N01. I細胞體內增殖的數據。圖4顯示了通過基因組PCR測定的證明鋰促進N01. I細胞體內增殖的數據。圖5顯示了通過組織學分析測定的證明鋰促進N01. I細胞體內存活的數據。左嘴側部；右尾側部。比例尺=lmm。圖6顯示了證明鋰刺激N01. I細胞體內產生生長因子的數據。圖7顯示了證明脊髓損傷後鋰對神經保護的作用的數據。圖8顯示了證明鋰促進人臍帶血細胞體外增殖的數據。圖9顯示了證明鋰刺激人臍帶血細胞體外產生生長因子的數據。圖10顯示了證明鋰刺激人臍帶血細胞體外生成生長因子的其他數據。發明詳細描述I.導言鋰用於治療雙相型障礙和其他神經學症狀已有50多年了(參見例如Manji等，Biol. Psychiatry, 46:929-940 (1999))。躁鬱症患者經常需要終身攝入鋰，其治療血液濃度為約ImM。儘管如此的高濃度，鋰是相對無毒的。鋰對細胞具有許多潛在作用機制(Jope，Mol. Psychiatry,4:117-128(1999))。例如，鋰調節包括 GSK-3、Akt、cAMP 依賴型激酶和蛋白激酶C在內的多種酶及其對應的第二信使和轉錄因子的活性。對鋰對神經細胞作用的研究顯示，鋰可以刺激神經再生(Bustuoabad等，Medicina, 40:547-552 (1980))和神經祖細胞增殖(Hashimoto 等，Neuroscience,117:55-61 (2003))、在中風模型中誘導神經元和星形膠質細胞在受傷部位附近的增MCChuang, Crit. Rev. Neurobiol, 16:83-90 (2004))、提高膠質細胞在腦下垂體中的增殖(Levine 等，Cell Prolif.，35:167-172 (2002) ；Levine 等，Cell Prolif.,33:203-207 (2000))、刺激白細胞遷移能力(Azzara等，Haematologica，72:121-127 (1987)；Azzara等· Acta Haematol, 85:100-102 (1991))、提高海馬神經祖細胞的神經元分化(Kim等，J. Neurochem.，89:324-336 (2004))、以及增強小鼠海馬區中的神經形成(Laeng等，J. Neurochem.，91:238-251 (2004))。然而，這些參考文獻都沒有考查體內和體外鋰對人臍帶血幹細胞產生生長因子的影響。同樣地，這些參考文獻沒有考查體內和體外鋰對人臍帶血幹細胞增殖和存活的影響。此外，鋰對骨髓的作用的研究顯示，鋰可以提高集落刺激活性產生並加快粒細胞生成和紅血球生成(Labedzki 等，Klin. Wochenschr. , 58:211-218 (1980))、降低化療引起的對粒細胞生成和巨核細胞生成的抑制(Korycka等，Arch. Immunol. Ther. Exp.,39:501-509 (1991))、加快全身福射後的骨髓恢復(Johnke 等，Int. J. Cell Cloning,9:78-88(1991))、逆轉由同時使用環戊丙酸雌二醇和乙烯雌酚所引起的骨髓發育不全和血細胞減少(Hall，J. Am. Vet. Med. Assoc, 200:814-816 (1992))、以及恢復氯氮平引起的粒細胞減少患者中的正常血細胞計數(Papetti等，Encephale. ,30:578-582(2004))。然而,這些參考文獻都沒有考查體內和體外鋰對人臍帶血幹細胞產生生長因子的影響。同樣地，這些參考文獻沒有考查體內和體外鋰對人臍帶血幹細胞增殖和存活的影響。
因此，本發明是部分基於在含有諸如氯化鋰的鋰鹽的培養基中培養人臍帶血幹細胞可以刺激這些幹細胞生成生長因子從而促進其增殖和存活這一意外發現上的。事實上，如本發明的方法所述培養臍帶血幹細胞成倍(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍)地提高了生長因子的表達量和幹細胞數量。本發明還基於在移植前用鋰鹽處理臍帶血幹細胞提高所移植幹細胞的存活和增長、以及臍帶血幹細胞移植後用鋰鹽給藥降低所移植幹細胞的免疫排斥這一意外發現。因此，這裡所述的方法不僅允許對臍帶血中所發現的有限供給的幹細胞的充分擴展，而且通過例如提高所移植幹細胞的存活和生長以及/或降低所移植幹細胞的免疫排斥，提供了對移植受體臨床結果的顯著改善。II.定義如這裡所使用的，除非另有說明，以下術語具有歸其所有的含義。術語「幹細胞」是指具有在不確定的時間段內分裂並產生專門化細胞的能力的任何細胞。幹細胞源於所有胚層(即外胚層、中胚層和內胚層)。典型的幹細胞來源包括胚胎、骨髓、外周血、臍帶血、胎盤血、肌肉組織和脂肪組織。幹細胞可以是全能的，這意味著它們能生長和分化成體內的任何細胞。在哺乳動物中，只有受精卵和早期胚胎細胞是全能性的。另外，幹細胞可以是多能的，這意味著它們能產生生物體內的大部分組織。例如，多潛能(pluripotent)幹細胞可以產生神經系統、皮膚、肝、血液、肌肉、骨等等的細胞。多能幹細胞的例子包括但不限於臍帶血幹細胞、神經幹細胞、造血幹細胞、脂肪衍生幹細胞、間葉細胞樣幹細胞、胎盤衍生幹細胞、乳牙衍生幹細胞以及毛囊幹細胞。相反，多能(multipotent)幹細胞或成人幹細胞通常產生有限種類的細胞。除非另有說明，這裡所使用的術語幹細胞包括祖細胞。術語「祖細胞」是指品系明確的細胞，即一種祖細胞可以產生限於單一品系的後代。祖細胞的非限制性的例子包括神經元系、肝系、腎組織系、脂肪組織系、成骨細胞系、破骨細胞系、肺泡系、心臟系、腸系或內皮系的前體細胞。這裡所使用的術語「培養」是指將幹細胞保持在其能增殖並避免衰老的條件下。例如，在本發明中，幹細胞在含有鋰鹽和可選地一種或多種生長因子(即生長因子雞尾酒)的
培養基中培養。術語「刺激生長因子產生」是指使用鋰鹽提高來自幹細胞的一種或多種生長因子的表達(例如mRNA、蛋白質)。通常，生長因子表達的提高是與在無鋰鹽條件下培養的對照幹細胞相比而言的。如實施例I和2中所述，本發明的方法(即當幹細胞在含鋰鹽的培養基中培養時)可以顯著刺激幹細胞產生生長因子。可以通過用鋰鹽培養幹細胞所刺激的生長因子的例子包括但不限於細胞存活因子(例如神經營養蛋白、細胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等等)、抗分化因子(例如白血病抑制因子(LIF)等待)、以及它們的組合。神經營養蛋白的非限制性例子包括神經營養蛋白-I (NT-1)、神經營養蛋白-3 (NT-3)、神經營養蛋白-4 (NT-4)、大腦衍生神經營養因子(BDNF)、膠質細胞系衍生神經營養因子(⑶NF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經生長因子(NGF)(例如NGFa、NGFP和NGF Y )、以及它們的組合。細胞因子的例子包括如上所述的屬於白細胞介素或幹擾素亞家族的那些因子。術語「體外擴展」是指在實驗室中培養幹細胞。這樣的細胞從哺乳動物中提取並通過在適當環境中(例如在含鋰鹽的培養基中)培養產生額外的細胞量。如果可能，建立穩定的細胞系以進行細胞的連續繁殖。如實施例I和2中所述，本發明的方法(即當幹細胞在含鋰鹽的培養基中培養時)可以顯著促進幹細胞的體外增殖。術語「提高存活和生長」是指使用鋰鹽促進所移植的幹細胞的活力和增殖。通常， 所移植的幹細胞的存活和生長的提高是與在無鋰鹽條件下培養和移植的對照幹細胞相比而言的。如實施例I中所述，本發明的方法(即用鋰處理的幹細胞對哺乳動物給藥)可以顯著提高所移植的幹細胞的存活和生長。有活力的細胞是活的並通常具有生長和分裂能力的細胞。精通本領域的人員知道確定細胞活力的方法，例如通過其排斥臺盼藍染液的能力。術語「降低排斥」是指使用鋰鹽以降低、延遲或消除所移植細胞的免疫排斥風險。通常，所移植的幹細胞的排斥的降低是與在無鋰鹽條件下培養和移植的對照幹細胞相比而言的。作為非限制性的例子，當用諸如氯化鋰的鋰鹽對幹細胞受體給藥時，本發明的方法可以顯著延遲所移植幹細胞的免疫排斥的發作。術語「臍帶血」是指從出生後留下的臍帶血中獲得的多潛能和多能幹細胞的來源。在臍帶血中發現的幹細胞的例子包括但不限於間葉細胞樣幹細胞、造血幹細胞和祖細胞。間葉細胞樣幹細胞和祖細胞通常能分化成神經細胞、骨髓基質細胞、軟骨細胞、造骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、腱細胞和韌帶細胞。造血幹細胞通常形成淋巴系、髓系和紅血球系的細胞。下文提供了用於收集和處理臍帶血的方法的詳細描述。這裡所使用的術語「臍帶血單位」是指從單個供體收集的臍帶血的體積。本發明的方法中通常使用單個臍帶血單位，但也可以使用多個臍帶血單位(例如兩個臍帶血單位)以增加幹細胞數。如這裡所使用的，術語「基本耗盡血漿的」和「耗盡血漿的」是指其中約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 以上體積的血漿已經耗盡的處理過的臍帶血單位。例如，通過離心臍帶血並將細胞組分與血漿組分分開可以基本耗盡血漿。基本耗盡後殘留的血漿體積通常為約0%至約30%(體積比)，優選約10%至約30%(體積比)。這裡所使用的術語「非紅細胞耗盡的」和「紅細胞未耗盡的」是指其中約30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以下體積的紅細胞已經耗盡的處理過的臍帶血單位。如這裡所使用的，術語「紅細胞基本耗盡的」和「耗盡紅細胞的」是指其中約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 以上體積的紅細胞已經耗盡的處理過的臍帶血。「有核細胞」是指具有核(即含染色體DNA的細胞器)的細胞。有核細胞包括例如白細胞和幹細胞。「無核細胞」包括例如成人紅細胞。術語「鋰鹽」是指任何製藥上允許的鋰的鹽。適用於本發明所述方法的鋰鹽的例子包括但不限於氯化鋰、碳酸鋰、以及硫酸鋰、檸檬酸鋰、羥丁酸鋰、乳清酸鋰、醋酸鋰、鋁酸鋰、氫化鋁鋰、氨基化鋰、硼酸鋰、溴化鋰、二異丙氨基鋰、氟化鋰、氫化鋰、氫氧化鋰、碘化鋰、偏硼酸鋰、鑰酸鋰、鈮酸鋰、硝酸鋰、氮化鋰、氧化鋰、高氯酸鋰、過氧化鋰、硫化鋰、鉭酸鋰、Y亞麻酸鋰、以及它們的組合。優選地，所述鋰鹽是氯化鋰。 術語「對象」指一種哺乳動物，如人。如這裡所使用的，術語「給藥」指通過任何包括但不限於口服、鼻內、眼內、靜脈內、骨內、腹膜內、脊柱內、肌內、關節內、心室內、顱內、病變內、氣管內、鞘內、皮下、皮內、透皮、 或透黏膜給藥途徑的諸如人臍帶血細胞的幹細胞或諸如氯化鋰的鋰鹽的遞送。所述鋰鹽通常經口服、鞘內、心室內、皮下、腹膜內、靜脈內或肌內途徑給藥。在某些情況下，所述鋰鹽通過使用例如Alza公司(Mountain View, CA)提供的DUROSji■植入物植入在對象中的滲透泵給藥。在某些其他情況下，所述鋰鹽通過緩釋儲庫型注射給藥。所述幹細胞可以通過例如在疾病部位、受傷部位(例如用於治療脊髓損傷的脊柱內給藥)或諸如器官的其他目標部位直接注射或灌注給藥。所述幹細胞和鋰鹽可以同時(例如在相同時間)或先後(例如間隔幾分鐘、幾小時或幾天)對對象給藥。III.臍帶血幹細胞A.臍帶血的收集臍帶血是幹細胞的豐富來源，並且可以方便地以對供體無創方式獲得。相反，收集用於移植的骨髓細胞是一種有創過程，其根據住院所花費的時間和金錢而言是昂貴的。優選地，通過從臍帶直接排出收集臍帶血。因此，嬰兒分娩之後，可以將臍帶雙重十字夾緊並在夾鉗的擠壓部分上方切開，產生的臍帶血管中的胎兒血流可以收集在收集容器中。在胎盤分離發生前，通常可以無需擠壓臍帶完成足夠量的收集，並且收集過程在約2分鐘內完成。需要注意避免分娩區域中母體血液、尿液或其他流體的汙染。也可以通過任何本領域內已知的其他方法獲得臍帶血。針對本發明目的的供體可以包括母體供體，她們是捐贈確認書所針對的供體，並且是對實際新生供體具有監護權的母親，其中臍帶血的真實供體是新生兒。母體供體是健康狀況良好並且年齡在約16至約50歲的個人。臍帶血捐贈之前或之後可以收集所述母體供體的某些信息以確定供體的適宜性和不存在輸血傳播的傳染病、遺傳病和造血系統癌症。例如，可以要求所述母體供體填寫醫學問卷。在本發明的一種實施方式中，母體供體在捐贈前應接受醫學檢查。應當在無菌條件下進行臍帶血收集。在一些實施方式中，收集時可以立即將臍帶血與抗凝血劑混合。通常，約23mL至約35mL的抗凝血劑與最多約255mL臍帶血(即一個臍帶血單位)混合。適當的抗凝血劑包括本領域內已知的任何抗凝血劑，例如CPDA (朽1檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺苷)、CPD (檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖)、A⑶(酸-檸檬酸鹽-葡萄糖)、Alsever 溶液(Alsever 等，N. Y. St. J. Med.，41:126 (1941) )、De Gowin 溶液(De Gowin等，J. Am. Med. Assoc, 114:850 (1940) )、Edglugate-Mg (Smith 等，J. Thorac. Cardiovasc.Surg.，38:573 (1959) )>Rous-Turner 溶液(Rous 等,J. Exp. Med. , 23:219 (1916))、其他葡萄
糖混合物、肝素、雙香豆乙酯等等。為了幫助臍帶血處理和提高安全性，用於各種血液成分的處理袋可以是無菌血液袋系統的一部分。在一種實施方式中，在所述處理袋中的一個中整合了血漿存儲溶液。此夕卜，收集袋和處理袋都可以配備有出入口和插拔式連接器。所述出入口可以用於向袋內添加材料或從袋內抽提材料。插拔式連接器可以用於臨時關閉袋的導管或入口。臍帶血通常可以在例如約O。C至約42° C之間或約15° C至約26° C之間的溫度下儲藏不超過約48小時。除了臍帶血，胎盤或胎兒血可以用於獲得適於培養和/或移植的幹細胞。可以使用本領域內已知的任何方法收集胎盤或胎兒血。例如，使用由超聲波、胎盤穿刺或胎兒鏡檢引導的針可以在胎盤根部從胎兒循環中獲取胎兒血。通過例如在根部和擴張的靜脈處從分娩的胎盤中針吸可以獲得胎盤血。·
在一些實施方式中，要求產後的婦女捐獻臍帶血和胎盤血。聯繫醫院並要求其參加臍帶血/胎盤血收集項目。潛在的供體是通過自然分娩或剖腹產方式分娩中的和準備分娩的婦女。在美國專利No. 5，993，387中描述了一種從產後婦女中獲得臍帶血和胎盤血的方法，例如通過一個家庭在小孩出生前加入一個庫並對出生後所要收集的臍帶血幹細胞的收集和保存收取費用。在一種實施方式中，分娩後收集並檢測了臍帶血和/或胎盤血。在一些實施方式中，檢測確保臍帶血或胎盤血適於進一步處理。檢測可以包括檢測胎盤以確保其完整並且不含大量胎便或膿性溢液。可以檢測臍帶以確定其完整地含有2條動脈和I條靜脈並且沒有打結或其他異常。如上所述，可以收集在可選地含有諸如檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺苷(CPDA)溶液的抗凝血劑的袋中。B.耗盡血漿處理在一些實施方式中，可以按照例如美國專利公開No. 20060275271中所述的方法減少所收集的臍帶血的體積。作為一個非限制性例子，首先通過在約0° C至約42° C之間、優選約15° C至約26° C之間的溫度下對所述混合物加以離心可以降低所收集的臍帶血的體積。進行離心從所述混合物中去除大量體積的液體(例如血漿)。優選以約IOOOg至約2500g離心約5至約20分鐘，其中離心力和離心時間足以引起大部分細胞沉澱而不會引起細胞破損。離心後，去除大量體積的血漿以降低臍帶血混合物體積，從而產生未耗盡紅細胞的耗盡血漿的臍帶血單位。基本耗盡後殘留的血漿體積通常為約原體積的0%至約30%，優選為約原體積的10%至約30%。在某些情況下，耗盡血漿的臍帶血單位中留有至少約IOmL的血漿。優選地,正如通過上清液血漿中的細胞計數所顯示的,去除上清液時損失少於約5%的有核細胞(例如少於約5%、4%、3%、2%或1%)。在一些實施方式中，將耗盡血漿的單位移至冷凍用容器(例如Cryocyte 袋)，並冷卻至約2° C至約8° C，保持約30至約60分鐘。通過所使用的具體CryoCyte 袋的容積、冷凍保藏的細胞數量以及冷凍保藏溶液的濃度確定合適的體積。如果耗盡血漿的臍帶血單位的體積太大導致該體積大於約60至約75mL，則可以使用更大的CryoCyte 袋或將樣本封裝在兩個或更多的CryoCyte 袋中。C.培養臍帶血幹細胞
可以在冷凍保藏之前或之後使用體外培養技術在含鋰鹽的培養基中培養存在於臍帶血單位中的幹細胞。已經描述了各種用於臍帶血幹細胞在培養基中生長的方案(參見例如 Smith 等，Br. J. Haematol,63:29-34(1986) ；Dexter 等，J. Cell. Physiol,91:335(1977) ;Witlock 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，79:3608-3612 (1982))。精通本領域的人員應該知道其他用於體外培養臍帶血幹細胞群的方案。各種因子可以與鋰鹽聯合使用以刺激培養物中臍帶血幹細胞的增殖。作為非限制性例子，諸如白介素-I (IL-1)、白介素-3 (IL-3)、白介素-4 (IL-4)、白介素-6 (IL-6)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的各種細胞因子和生長因子可以與鋰鹽組合使用以刺激存在於臍帶血單位中的幹細胞的離體擴展。通過本發明所述方法培養的臍帶血幹細胞可以不經過進一步純化就使用。另外，通過各種本領域內已知的技術(如免疫親和色譜、免疫吸附、FACS分選等等)可以分離所培養幹細胞的特定群或亞群。作為一個非限制性例子，可以在其表達的諸如CD34、c-kit和/或CXCR-4的細胞表面標記的基礎上對臍帶血幹細胞加以分離。
本發明依賴於細胞培養領域內的常規技術。精通本領域的人員通過使用已知的方法學(參見例如Freshney等，《動物細胞培養》(Cimuke Of Animal C—)，第三版(1994))可以確定適當的細胞培養方法和條件。通常，細胞培養環境包括對諸如細胞生長底物、細胞密度和細胞粘著、氣相、培養基和溫度等因素的考慮。通常在已知對細胞生長最優的條件下進行孵育。這樣的條件可以包括例如約37° C的溫度和含有約5%C02的潮溼空氣。根據所需要的結果，孵育時間可以變化很大。使用3H胸腺嘧啶脫氧核苷結合或BrdU標記可以方便地測定增殖。塑料皿、燒瓶、滾瓶或懸浮液中的微載體可以用於如本發明所述的方法培養臍帶血幹細胞。適當的培養容器包括例如多孔平板、皮氏平皿、組織培養管、燒瓶、滾瓶等等。臍帶血幹細胞通常以基於細胞類型的憑經驗確定的最優密度生長，並當細胞密度大於最佳密度時進行傳代。考慮到溫度的地區差異，培養的臍帶血幹細胞通常在提供適當溫度(例如所獲得的細胞所屬的動物的身體溫度)的培養箱內生長。通常，37° C是細胞培養的優選溫度。大部分培養箱加溼至近似於大氣條件。氣相的重要組成是氧和二氧化碳。通常，將大氣的氧壓用於細胞培養物。培養容器通常將大氣排入培養箱，從而通過使用透氣蓋或通過防止培養容器密封進行氣體交換。二氧化碳在穩定PH以及在為細胞培養基提供緩衝方面發揮作用，並通常以約1%至約10%的濃度存在於培養箱中。優選的CO2濃度通常為約5%。可以獲得包裝的、預先混合的粉末或預先滅菌的溶液形式的確定成分培養基。通常使用的培養基的例子包括但不限於Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)、DME、RPMI1640、完全Eagle培養基、以及McCoy培養基(參見例如基博科/生命技術公司目錄和參考指引(GibcoBRL/Life Technologies Catalog and Reference Guide);西格瑪公司目錄(Sigma Catalog))。用約 0. 5_5mM(例如約 O. 5、1、1· 5、2、2· 5、2· 6、2· 7、2· 8、2· 9、3、3· I、
3.2、3. 3、3. 4、3. 5、4、4. 5、或5mM)的鋰鹽(例如氯化鋰)補充確定成分細胞培養基。在一些實施方式中，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在。也可以用約5-20%血清(通常是熱滅活血清，例如人、馬、小牛和胎牛血清)補充確定成分細胞培養基。通常，在本發明的方法中使用10%胎牛血清(FBS)或人血清(HS)。所述細胞培養基通常具有緩衝能力以將細胞保持在pH約7. 2至約7. 4之間。所述培養基的其他補充物包括例如抗生素、胺基酸、糖(例如約5. 5-16. 7mM的葡萄糖)以及生長因子(例如EGF、FGF等等)。IV.所培養的幹細胞和鋰鹽的給藥可以通過本領域內已知的任何方法將鋰鹽和如本發明所述方法培養的幹細胞對對象給藥。適當的給藥方法包括例如靜脈內或皮下給藥、或局部投放(例如直接注射或灌注入疾病部位或其他諸如器官的目標部位)。這裡所述的所培養的幹細胞和鋰鹽可以單獨或與製藥上允許的載體混合給藥。製藥上允許的載體部分通過給藥的具體成分(例如細胞、鹽等等)以及用於所述成分給藥的具體方法加以確定。因此，對於本發明所培養的細胞和鋰鹽的給藥來說，存在大量各種適當的製藥配方。作為一個非限制性例子，普通緩衝鹽溶液(例如約135-150mM NaCl)可以用作製藥上允許的載體。其他適當的載體包括但不限於水、緩衝的水、O. 4%鹽水、O. 3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓製藥科學》 (Remington, s Pharmaceutical Sciences )，賓夕法尼亞州費 城麥克出版社，第18版，(1995)中描述了其他適當的載體。如這裡所使用的，術語「載體」包括任何及所有溶劑、散布媒劑、包被、稀釋劑、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑、緩衝劑、載體溶液、懸浮液、膠體等等。短語「製藥上允許的」是指當對哺乳動物(如人)給藥時不產生過敏或類似的不利反應的分子實體和組合物。本發明的幹細胞和鋰鹽可被製成適於給藥的製劑，例如水性的或非水性的、等滲的無菌注射溶液，它可以包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、和使得該配方與目標受體的血液等滲的溶質，以及可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液。可以由無菌粉末、顆粒和藥片製備注射溶液和懸浮液。在本發明的背景中，對對象給藥的劑量應當在對象中隨時間推移足以產生有益的治療反應。對於所培養的幹細胞而言，應通過所使用的具體幹細胞的功效和對象狀況以及所治療的對象的體重或表面積確定劑量。也應當通過在具體對象中具體細胞類型給藥所伴隨的任何不利副作用的存在、本質和程度確定所述劑量的大小。對於鋰鹽而言，應通過所使用的具體鋰鹽的功效和對象狀況以及所治療的對象的體重或表面積確定劑量。也應當通過在具體對象中具體鋰鹽給藥所伴隨的任何不利副作用的存在、本質和程度確定所述劑量的大小。在確定這裡所述的疾病或損傷的治療中給予所培養的幹細胞有效量的過程中，醫師對細胞毒性、移植反應、疾病進程、以及抗細胞抗體的產生進行評估。對於給藥而言，根據對象的體重和整體健康狀況，可以將本發明所培養的幹細胞以有效減少或減輕與疾病或損傷相關的一種或多種症狀的量給藥，同時考慮到所述細胞類型在各種濃度下的副作用。可以通過單一劑量或分開的劑量完成給藥。在一些實施方式中，本發明提供了一種用於治療受疾病或殘疾(例如脊髓損傷)困擾的對象的方法，該方法包括用如這裡所述的方法收集、處理並/或培養的幹細胞對對象給藥。作為一個非限制性例子，可以用足以補充由於疾病或損傷而損失的細胞的量的鋰刺激的幹細胞對對象給藥。在某些情況下，由於疾病需要替代的細胞是血液細胞。另外，經受針對癌症的化療或放射治療的對象的骨髓細胞可能被這樣的治療所破壞，從而導致發生各種傳染性疾病的易感性提高。這些對象也可以用源自本發明方法的幹細胞進行治療。在某些其他情況下，所述幹細胞可以用於治療遭受脊髓損傷、創傷性腦損傷、中風、帕金森症、阿爾茨海默病、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關節炎、風溼性關節炎等等所困擾的對象。所述幹細胞也可以用於治療遭受諸如白血病、淋巴瘤、貧血、多發性骨髓瘤、遺傳性血液異常的疾病、以及導致免疫缺陷(例如AIDS)的疾病或治療所困擾的對象。所述幹細胞可以對對象單獨或與其他治療方案聯合給藥。在某些情況下，所述的其他治療方案包括化療和/或放射治療。在某些其他情況下，其他資料方案包括至少一種生長因子，例如GM-CSF、G-CSF, M-CSF, IL-3、IL-7、EPO、TPO、IL-5或這裡所述的任何其他生長因子。治療可以是同時或先後給藥。 V.幹細胞移植在一些實施方式中，幹細胞移植不需要HLA分型。在其他實施方式中，對幹細胞進行HLA分型以保證與受體的相容性。HLA標記的匹配數取決於使用者的要求和幹細胞的來源。例如，可以使用6個標記中具有4個、5個或6個匹配的從包括臍帶血在內的胚胎或胎兒組織分離的幹細胞。對於來自成人的幹細胞，優選使用6個HLA標記都相容的。在一些免疫障礙的對象中，移植物對宿主反應可能受到削弱並可以使用並不完全匹配的幹細胞。通常，在移植治療性幹細胞單位之前，耗盡或減少存在於對象中的正常幹細胞群。可以使用化療、輻射或例如美國專利No. 6，217，867中所述的其他技術使得骨髓達到適於移植物移植的要求。最後，可以使用常規方法將治療性幹細胞單位移植入患者體內。在一些實施方式中，幹細胞與製藥上允許的載體(優選水性載體)一起移植。可以使用各種水性載體，例如緩衝鹽溶液等等。這些溶液是無菌的並通常不含不需要的物質。治療性幹細胞單位也可以包含適當的生理條件所需的製藥上允許的輔助物質，如PH調節和緩衝劑、毒性調節劑等等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、白蛋白、葡聚糖、DMS0、它們的組合等等。輔助物質的濃度可以變化很大，並且應該根據所選擇的具體給藥模式和對象需求主要在流體體積、粘性、體重等等的基礎上加以選擇。
實施例將通過以下實施例對本發明進行更詳細的描述。提供以下實施例是為了舉例說明的目的，並不意味著以任何方式對本發明加以限制。精通本領域的人員應當容易地識別可以改變或修改以產生基本相同結果的各種非關鍵參數。實施例I.大鼠新生血細胞增殖和生長因子產生的鋰刺激這一實施例顯示了鋰促進從新生大鼠血液中分離的幹細胞(N01. I細胞)的增殖和生長因子產生。鋰也提高所移植的N01. I細胞的存活和生長。結果體外。圖I顯示了鋰促進N01. I細胞的體外增殖。將N01. I細胞在含有3mM氯化鋰的生長培養基中培養7天。對兩組細胞都進行細胞數計數。氯化鋰組中的細胞數比對照組高359%。鋰處理的N01. I細胞仍是幹蛋白(Nestin)陽性的。圖2顯示了鋰刺激N01. I細胞體外產生生長因子。通過定量實時PCR測定了在含或不含3mM氯化鋰的條件下培養的N01. I細胞中諸如LIF、BDNF,⑶NF、NGF Y和NGF^的生長因子的mRNA水平。LIF和NGFP mRNA水平明顯高於對照組。NGF y、BDNF和⑶NF的mRNA水平之間沒有顯著差異。體內。25mm高落重挫傷後立即移植GFP陽性N01. I細胞。每天用100mg/kg的氯化鋰腹膜內注射大鼠2周。對照組每天用鹽水注射2周。2周後處死動物用於RT-PCR和組織學分析。圖3和4顯示了鋰促進N01. I細胞的體內增殖。圖3中，通過定量實時PCR測定了用鹽水或鋰處理的NO I. I移植後兩周脊髓中的GFPmRNA水平。在鹽水處理的大鼠中，GFPmRNA的量可以檢測到，但是非常低。然而在鋰處理的大鼠中，GFP mRNA的量比鹽水處理的大鼠中高1000倍。圖4中，分離了所移植的脊髓組織的基因組DNA並用GFP引物對進行了基因組PCR分析。在鋰處理的組織中，所擴增的GFP DNA的量顯著高於對照組中所觀察到的量。圖5顯示了鋰促進N01. I細胞的體內存活。將GFP陽性N01. I細胞移植入受傷大鼠脊髓。2周後，處死大鼠並在Zeiss Stemi解剖顯微鏡下觀察脊髓。在鹽水處理的大鼠 中，GFP螢光強度低且彌散(圖5A-B)。然而在鋰處理的大鼠中，GFP螢光強度高並佔據兩大塊區域(圖5C-D)。為了進一步對GFP-N01. I細胞的分布進行評估，將相同的脊髓徑向切片。在鹽水處理的大鼠中，GFP陽性N01. I細胞稀少(圖5E)。相反，鋰處理的大鼠在挫傷中心具有大量GFP陽性N01. I細胞。圖6顯示了鋰刺激N01. I細胞體內產生生長因子。為了研究鋰對細胞因子產生的作用，通過定量實時PCR分析了 4組脊髓。在「損傷」和「損傷/LiCl」組中，生長因子mRNA水平沒有明顯變化。在「損傷/N01. 1」組中，80即、見'3和如？^1111 應水平提高。在「損傷/N01. Ι/LiCl」 組中，⑶NF、LIF、BDNF, NT-3、NGFP 和 NGFNGF YmRNA 水平顯著提高。這些結果說明，在N01. I細胞存在的情況下，鋰刺激生長因子產生。圖7顯示了脊髓損傷後鋰對神經保護的影響。脊髓損傷後立即注射(腹腔內)氯化鋰或鹽水。損傷24小時後測量損傷體積。鋰處理的和鹽水處理的大鼠之間沒有觀察到顯著差異。討論檢測了脊髓損傷後鋰對幹細胞增殖、基因表達和組織保護的影響。使用從新生大鼠血液中分離的用綠色螢光蛋白(GFP )轉染的表達幹蛋白的細胞系(NO I. I )，測定了鋰對培養物中N01. I細胞增殖和植入受損脊髓中的N01. I細胞的影響。將N01. I細胞在3mM鋰中培養導致I周后細胞數提高了 359%。在25mm挫傷後將N01. I細胞移植入大鼠脊髓的情況下，它們沒有脫離控制生長並且遵守脊髓的灰質-白質界線。移植兩周後，檢測移植部位的GFP mRNA水平。在鹽水處理的大鼠中，可以檢測到GFP mRNA，但量很低。然而在鋰處理的大鼠中，GFP mRNA的量比鹽水處理的大鼠中的高1000倍。組織學也顯示用鋰處理的受損脊髓中具有更多的GFP陽性細胞。鋰處理的大鼠中諸如⑶NF、LIF、BDNF、NT-3、NGF@和NGFy的生長因子的mRNA量也較高。因此，這一實施例說明，通過在體內促進細胞增殖和刺激生長因子表達，鋰可以用於提高所移植的幹細胞的存活和生長。因此對於接受幹細胞移植的患者的組合治療是理想的。方法細胞特徵。從野生型新生(PO) Sprague-Dawley (SD)大鼠的血液中分離NOl細胞並用DMEM、10%FBS、EGF和bFGF培養。6周時，60%的NOl細胞是幹蛋白陽性的。克隆檢驗後，選擇具有100%幹蛋白陽性的稱為N01. I的亞克隆。N01. I可以長時間培養而不會發生形態或幹蛋白標記的改變。當從生長培養基中去除血清時，N01. I細胞形成類似於由神經幹細胞所形成的神經球的球狀結構(Sun,第一屆幹細胞研究科學年會QstAnnual ScientificMetting on Stem Cell Research),新澤西,2004)。體外培養。N01. I細胞用3mM氯化鋰在DMEM、10%FBS、bFGF和EGF中在37。C、5%C02的加溼培養箱中處理7天。體內脊髓損傷/細胞移植。用綠色螢光蛋白(GFP)轉染N01. I細胞。使用77+1天大的SD大鼠。製造挫傷(MASCIS撞擊器，25mm高)，隨後用與Hamilton注射器相連的玻璃微移液器在距離挫傷部位2mm的兩個位置上合計脊柱內注射200，000個細胞(100，000個細胞/yL)。體內鋰治療。每天將氯化鋰以每次注射100mg/kg的量腹膜內給藥兩周。定量實時PCR。為了評估移植後兩周所植入的GFP陽性N01. I細胞的細胞存活，通 過 SYBR 綠色螢光在 Applied Biosystems 7900HT 實時 PCR 系統(Foster City，CA)上測量GFP mRNA的量。測量了 N01. I細胞移植後脊髓中LIF、BDNF、NT3、⑶NF、NGF Y和NGF^的mRNA水平。損傷體積(LV)。為了評估鋰對組織保護的作用，根據以下公式測量了損傷後24 小時的損傷體積LV=0. 75-([K]t_4)/120x 體重(Constantini 等，J. Neurosurg.，80:97-111(1994))。實施例2.人臍帶血細胞增殖和生長因子產生的鋰刺激這一實施例顯示了鋰促進從人臍帶血細胞所分離的幹細胞的增殖和生長因子產生。圖8顯示了鋰在體外促進人臍帶血細胞增殖。從新鮮的人臍帶血中分離人單核細胞並在含有或不含有3mM氯化鋰的含有胎牛血清(FBS)的生長培養基中培養。在為期8周的研究過程中，在鋰處理的培養物中的細胞數比對照培養物中的高。雖然5周後在鋰處理的和對照培養物中的總細胞數都降低了，第8周時鋰處理的培養物中明顯具有更多細胞。圖9顯示了鋰在體外刺激生長因子生成。從新鮮的人臍帶血中分離人單核細胞。細胞在含有或不含有3mM氯化鋰的含有FBS的生長培養基中培養。在第2和第4周進行定量實時PCR以評價生長因子mRNA水平。與對照培養物相比，第4周時鋰處理的培養物的生長因子mRNA水平(例如⑶NF、LIF、BDNF, NT-3、NGF β和CNTF)提高了 2-5倍。圖10顯示了鋰在體外刺激生長因子生成。從新鮮的人臍帶血中分離人單核細胞。細胞在含有或不含有3mM氯化鋰(Li)的含有人血清(HS)的生長培養基中培養。在第I和第2周進行定量實時PCR以評價生長因子mRNA水平。與對照培養物相比，在兩個時間點上鋰處理的培養物都表現出生長因子mRNA水平(例如BDNF、CNTF,⑶NF、LIF、NGF β和ΝΤ-3)的顯著提高。應當理解，以上描述是說明性的而不是限制性的。通過閱讀以上描述，許多實施方式對於精通本領域的人員來說是顯而易見的。因此，本發明的範圍不是通過以上描述確定的，而是應當通過附屬的權利要求以及這樣的權利要求所享有的權利的全部範圍的等價物所確定的。針對所有目的，包括專利申請、專利、PCT公開以及Genbank登錄號在內的所有文章和參考文獻通過應用整合在本說明書中。
權利要求
1.一種用於刺激人臍帶血細胞產生生長因子的方法，所述方法包括在含有鋰鹽的培養基中培養所述細胞。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述生長因子選自由細胞存活因子、抗分化因子、以及它們的組合所構成的組。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述生長因子是選自下組的細胞存活因子神經營養蛋白、細胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、以及它們的組合。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述細胞存活因子是選自下組的神經營養蛋白神經營養蛋白-3 (NT-3)、神經營養蛋白-4 (NT-4)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、膠質細胞系衍生神經營養因子(⑶NF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經生長因子(NGF)、以及它們的組合神經營養蛋白。
5.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述生長因子是抗分化因子，其中所述抗分化因子是白血病抑制因子(LIF)。
6.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
7.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是氯化鋰。
8.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽以約O.5至約5mM的濃度存在於所述培養基中。
9.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在與所述培養基中。
10.一種用於擴展人臍帶血細胞的體外方法，所述方法包括在含有鋰鹽的培養基中培養所述細胞。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是氯化鋰。
13.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽以約O.5至約5mM的濃度存在於所述培養基中。
14.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在與所述培養基中。
15.一種提高對象中所移植的人臍帶血細胞的存活和生長的方法，所述方法包括 (a)在含有鋰鹽的培養基中培養所述細胞；以及 (b)給予所述對象步驟(a)的細胞。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
17.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是氯化鋰。
18.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽以約O.5至約5mM的濃度存在於所述培養基中。
19.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在與所述培養基中。
20.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
21.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述對象已被診斷為脊髓損傷。
22.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述細胞以脊柱內方式給予。
23.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述方法進一步包括(c)給予所述對象鋰鹽。
24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
25.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是氯化鋰。
26.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是通過選自口服、鞘內、心室內、皮下、腹膜內、靜脈內或肌內的途徑給予的。
27.如權利要求23所述的方法,其特徵在於,所述鋰鹽是以約lmg/kg至約150mg/kg的劑量給予的。
28.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是以約10mg/kg的劑量給予的。
29.一種用於降低對象中所移植的人臍帶血細胞的排斥的方法，所述方法包括在細胞移植後給予所述對象鋰鹽。
30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
31.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述對象已被診斷為脊髓損傷。
32.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
33.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是氯化鋰。
34.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是通過選自口服、鞘內、心室內、皮下、腹膜內、靜脈內或肌內的途徑給予的。
35.如權利要求29所述的方法,其特徵在於,所述鋰鹽是以約lmg/kg至約150mg/kg的劑量給予的。
36.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述鋰鹽是以約10mg/kg的劑量給予的。
全文摘要
本發明提供了使用含鋰鹽的體外細胞培養系統來擴展人臍帶血幹細胞的方法和刺激臍帶血幹細胞產生生長因子的方法。本發明還提供了通過在移植前用鋰鹽處理所述細胞來提高所移植的臍帶血幹細胞的存活和生長的體內方法。還提供了通過移植後用鋰鹽給藥來降低所移植的臍帶血幹細胞的排斥的體內方法。
文檔編號C12N5/0789GK102911989SQ20121029677
公開日2013年2月6日 申請日期2007年10月31日 優先權日2006年11月1日
發明者D·孫, W·揚 申請人:羅格斯，新澤西州立大學