重組螢光雙雜交酵母及其檢測方法與應用的製作方法

2023-08-10 15:46:31

專利名稱：重組螢光雙雜交酵母及其檢測方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中重組螢光雙雜交酵母及其檢測方法與應用。
背景技術：
酵母雙雜交技術(yeast two hybrid)是利用酵母遺傳學方法分析蛋白質間的相 互作用的實驗系統，常用於驗證已知蛋白質間的相互作用或篩選與靶蛋白特異作用的候選 蛋白。酵母雙雜交技術已廣泛應用於細胞周期調控、信號轉導、腫瘤基因表達、藥代動力學 等多個研究領域。Fields和Song首先在研究真核基因轉錄調控中建立了酵母雙雜交系統，該系統 基於對酵母轉錄因子GAL4的完整認識，它具有兩個功能相對獨立的域DNA結合域(DNA binding domain, BD)和轉錄激活域(activation domain，AD)，BD 能夠識別 GAL4 效應基因 (GAL4-responsive gene)白勺上坊字激夕舌序歹[J (upstream activatingsequence, UAS)，並與之 結合。而AD則通過與轉錄機器(transcription machinery)中的其他成分之間的作用，啟 動UAS下遊的基因進行轉錄。BD和AD單獨作用均不能激活轉錄反應。而當兩者在空間上 接近後，不需要形成共價鍵即可激活轉錄。這便構成雙雜交體系的基礎。在經典的酵母雙雜交系統中，將待研究的兩種蛋白質的基因分別克隆到酵母表達 載體的GAL4-AD和GAL4-BD的下遊，進行融合表達，分析蛋白互作。具體來說，X和Y為兩 個未知相互作用的蛋白，將DB-X的融合蛋白稱作誘餌(bait)，X通常是已知蛋白，AD-Y稱 作獵物(prey)，如果bait與prey能夠在宿主細胞核內同時表達，則BD和AD形成轉錄激活 複合物，從而激活手報告基因的表達。該基因的表達可以通過生化或遺傳學的方法檢測得 到，即可實現對於蛋白質(X和Y)間相互作用的研究。作為研究分析蛋白質與蛋白質之間 相互作用的體系，酵母雙雜交的最大的優勢在於不需要分離純化蛋白質。同時，由於酵母生 長速度快、易於操作，該系統兼具了簡便有效的特點。目前酵母雙雜交體系常用的報告基因有LacZ和營養缺陷型標記如His等，前者可 以通過ONPG (或其他底物)存在時的顏色反應篩選陽性克隆，後者則根據篩選培養基上的 生長與否判斷。但作為一種檢測方法，營養缺陷標記作為報告基因無法對蛋白互作進行相 對定量。而LacZ的檢測通常需要破碎細胞，溫浴顯色等步驟，操作繁瑣、耗時耗力。這些缺 點已成為雙雜交酵母高通量、快速檢測蛋白互作的障礙。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種融合基因。本發明所提供的融合基因，由序列表中序列5第9到1030位核苷酸所示的DNA片 段、報告基因、終止子、篩選標記蛋白表達盒和序列表中序列5第4336到52 位核苷酸所 示的DNA片段依次連接構成的融合基因。所述終止子的核苷酸序列為序列表中序列5第觀03到3130位所示；所述報告基因為螢光素酶報告基因；
所述篩選標記蛋白表達盒為HIS Box表達盒。所述螢光素酶報告基因的核苷酸序列如序列表中序列5第1063到2715位所示；所述HIS Box表達盒的核苷酸序列為序列表中序列5第3152到43 位所示。所述融合基因為序列表中序列5第9到52 位所示的DNA分子。含有所述融合基因的重組質粒也屬於本發明的保護範圍。本發明的另一個目的是提供一種重組酵母菌。本發明所提供的重組酵母菌，是將所述融合基因導入宿主酵母菌得到的；所述宿 主酵母菌為缺失GAL4基因和GAL80基因的酵母菌。所述宿主酵母菌為酵母菌Y187。本發明的又一個目的是提供檢測所述重組酵母菌中螢光素酶活性的方法。本發明所提供的檢測所述重組酵母菌中螢光素酶活性的方法，包括以下步驟(1)使權利要求6或7所述的重組酵母菌中螢光素酶表達，得到螢光素酶表達的重 組酵母菌；(2)將步驟⑴得到的所述重組酵母菌進行震蕩培養，至菌液的OD6tltl值為0. 4-1. 5 或0. 4或1. 0或1. 5，得到的菌液為待測菌液；培養容器內的所有物質記作菌液；(3)將螢光素酶底物溶解於檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液中得到螢光素酶底物溶液， 將得到的螢光素酶底物溶液與所述待測菌液混合，得到混合物，檢測混合物的螢光值，即得 到所述螢光素酶活性。所述震蕩培養是在溫度為30°C和轉速為200rpm的條件下進行，旋轉半徑為 1. 3cm ；所述震蕩培養的培養基為營養缺陷型SD培養基。所述待測菌液與所述螢光素酶底物溶液的體積比為1 2-2 1或1 2或1 1 或2 1 ；所述螢光素酶底物溶液的濃度為0. OlmM ；所述螢光素酶底物為D-螢光素；所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液的濃度為0. lmol/L和pH值為3. 0。所述重組酵母菌在檢測蛋白質間相互作用中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明所提供的重組螢光酵母可用於快速檢測蛋白質間的相互作用。


圖1為不同D-Iuciferin濃度下待測菌液的螢光檢測結果。圖2為重組酵母菌的生長曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、構建重組螢光酵母及其功能驗證一、構建重組螢光酵母1、構建融合基因(1)融合基因中各DNA片段的獲得
A、GAL1全啟動子區片段的獲得以酵母菌株Y187(購自Clontech公司)基因組DNA為模板，設計特異引物進行 PCR,獲得在LacZ上遊獲得涵蓋GAL1UAS和GAL1TATA序列的全啟動子區，具體方法如下設計引物序列如下GAL-UP-NotI 5' -AGCGGCCGCCGACAGTTCCCAAAATG-3『，GAL-UP-Hind 5' -TAAGCTTTATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3『。以酵母菌株Υ187基因組DNA為模板，PCR反應條件如下94 "C 30 秒56 "C 30 秒72 "C 1 分鐘30個循環，最後72°C延伸5分鐘。經測序驗證，PCR擴增反應獲得的DNA片段序列為序列表中序列1。序列表中序 列1的第591位-第708位為GAL1UAS序列；序列表中序列1的第IOM位-第1030位為 GALITATA序列。將序列表中序列1第1位-第1030位的片段命名為GALlUAS-GALlTATA。B、LacZ-C端片斷的獲得設計引物序列如下LacZ-F2283B 5' -AGGATCCCTGACCACCAGCGAAATG-3『，LacZ-R3167S 5' -AGTCGACGCGAAATACGGGCAGACAT-3『，以酵母菌株Y187基因組DNA為模板，PCR反應條件如下94 "C 30 秒56 "C 30 秒72 "C 1 分鐘30個循環，最後72°C延伸5分鐘。經測序驗證，PCR擴增反應獲得的DNA片段序列為序列表中序列2，序列表中序列 2的第7位-第897位為LacZ⑶S序列中靠近C端的部分片段，將該LacZ⑶S序列的DNA 片段命名為LacZ-C。C、HIS Box基因表達盒的獲得設計引物序列如下HisBox-EcoR-UP 5' -AGAATTCATTCCCGTTTTAAGAGCTTG-3『，HisBox-BamHI-Dff 5' -AGGATCCTCGAGTTCAAGAGAAAAAAAAAGAAAAAGC-3'。以質粒pEG202 (購自Molecular Biotechnology)為模板，PCR反應條件如下94 "C 30 秒56°C30 秒
72 "C 1 分鐘30個循環，最後72°C延伸5分鐘。經測序驗證，PCR擴增反應獲得的DNA片段序列為序列表中序列3的第7位-第 1184位為HIS Box序列。D、ADH終止子的獲得設計引物序列如下TADH-BamH-UP 5' -AGGATCCTGACTAGAATTAATGCCCA-3『，TADH-EcoR-Dff 5' -AGAATTCATTAGGTCCCTCGCACAT-3『。以酵母菌株Y187基因組DNA為模板，PCR反應條件如下94 "C 30 秒56 "C 30 秒72 "C 1 分鐘30個循環，最後72 °C延伸5分鐘。經測序驗證，PCR擴增反應獲得的DNA片段序列為序列表中序列4，序列表中序列 4的第81位-第408位為ADHl terminator序列，將該ADHl terminator序列DNA片段命 名為TADH。(2) GAL1UAS-GAL1TATA 與 Luc 編碼區相連Luc編碼區片段直接從pGL3_Basic質粒(購自Promega公司)用HindIII/Xbal 酶切獲得。反應體系如下pGL3-Basic2ul (lug/ul)IOX 多功能 Buffer 2ulHindIIIIul(lOu/ul)XbaIIul (lOu/ul)ddH2014ul37 °C4h電泳分離上述得到的約1. 6kb片斷，將其插入到pBlue-SK載體(購自泛基諾科技 有限公司，產品目錄號為PYB808)的Hindlll/Spel位點，連接體系如下DNA 片斷2ul (Iug)載體DNAIul (0. 2ug)IOXligation Buffer IulLigaseIulddH205ul16 °C連接過夜。取5ul連接反應液，加感受態細菌JM109(購自寶生物，產品目錄號為 D9052) IOOul，置於冰上20min，42°C熱休克2min，加LB Iml培養30min後塗布LB+Amp平板。0105]挑起單克隆用引物特異性PCR鑑定，陽性克隆在1.61Λ處出現明顯條帶。將得到 的重組載體命名為pBlue-SK-Luc。
0106]將上述步驟(1)得到的DNA片段GAL1UAS-GAL1TATA插入到重組載體 pBlue-SK-Luc 的 Notl/Hindlll 位點，
0107]連接體系如下
0108]DNA 片斷2ul (Iug)
0109]載體DNAIul (0. 2ug)
0110]IOXligation Buffer Iul
0111]LigaseIul
0112]ddH205ul
0113]16 °C連接過夜。
0114]取5ul連接反應液，加感受態細菌JM109100ul，置於冰上20min，42°C熱休克2min， 加LB Iml培養30min後塗布LB+Amp平板。
0115]挑起單克隆用引物特異性PCR鑑定，陽性克隆在1.31Λ處出現明顯條帶。將得到 的重組載體命名為 pBlue-SK-GALlUAS-GALlTATA-Luc。
0116](3)將HIS Box表達盒與LacZ-C端序列片段相連
0117]將HIS Box表達盒和LacZ-C端序列片段分別使用SmaI酶切，獲得帶有相同粘性 末端的片段。
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
反應體系如下
DNA 片段2ul (lug/ul)
IOX 多功能 Buffer2ul
SmaIIul(10u/ul)
(MH2O15ul
37 °C4h
將上述得到的片段進行連接。 連接體系如下 DNA片段 載體DNA
10X ligation Buffer Ligase
ddH20
2ul(lug) Iul (0. 2ug) Iul Iul 5ul
16 °C連接過夜
0132]得到HIS-LacZ-C片段，將該片段插入至Ij pBlue-SK-GALlUAS-GALlTATA-Luc 的 EcoRI/Sall 位點形成以下結構
0133]GALlUAS-GALlTATA-Luc-MCS-HIS-LacZ-C。
0134]連接體系如下
0135]DNA 片段2ul (Iug)
0136]載體DNAIul (0. 2ug)
0137]IOXligation Buffer Iul
體 載
組 ￡
5
LigaseIulddH205ul16 °C連接過夜 取5ul連接反應液，加感受態細菌JM109100ul，置於冰上20min，42°C熱休克2min， 加LB Iml培養30min後塗布LB+Amp平板。挑起單克隆用引物特異性PCR鑑定，陽性克隆在2. Ikb處出現明顯條帶。(4)融合基因的獲得將步驟(1)得到的TADH片段(BamHI/EcoRI)插入到上述步驟(3)得到的載體的 Luc與HIS之間，最終質粒含有的元件順序如下=Notl-GALl-Luc-ADHterminator-HIS-Lac Z-C0分段測序拼接結果為序列表中序列5。序列表中序列5第9到1030位為GALl全啟動 子區片段，其中，序列表中序列5第591位-第708位為GAL1UAS序列；序列表中序列5第 1024位-第1030位為GAL1TATA序列；序列表中序列5第1063位-第2715位為Luc CDS 序列；序列表中序列5第觀03位-第3130位為TADH序列；序列表中序列5第3152位-第 4329位為HIS Box序列；序列表中序列5第4336位-第52 位為LacZ-C序列。2、構建重組酵母(1)分離純化上述最終質粒，用Notl/Sall雙酶切該質粒，得到GALl-Luc-ADHterm inator-HIS-LacZ-C片段，使用酵母轉化試劑盒(泛基諾YGM011)轉化酵母菌Y187。同時 用空載體pBlue-SK轉化酵母菌Y187，得到轉空載體對照酵母菌。(2)挑取單克隆在-His培養基中培養，挑取陽性克隆，提取陽性克隆的基因組 DNA。在GALl上遊激活序列片段的遠上遊再合成一條引物進行陽性克隆鑑定。引物序列如 下GALl-far-up 5』 -CTCGTAGCATCACCATAGA-3 』，用上述引物與Luc629R序列配對進行PCR鑑定Luc629R 5』 -AGAGCGACACCTTTAGGCAGA-3 』。PCR鑑定結果顯示陽性克隆出現1.71Λ條帶的PCR產物，轉空載體對照無此條帶產生。(3)提取陽性克隆基因組DNA分段擴增局部區域片段測序證實，測序結果與設計 序列一致。最終構建的酵母基因型為MATa，ura 3_5，ade 2-101 trp 1-901, leu 2-3,112, gal4A , met-, gal80 Δ，URA: :GAL1UAS_GAL1TATA_Luc。該重組酵母以酵母菌株 Y187 為骨 架，Luc基因被整合到酵母染色體中GAL1UAS-GAL1TATA下遊受其調控。與Y187相同，該酵 母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是的負調控因子)被缺失，從而排除了細胞內源 調控因子的影響。與Y187不同，該酵母具有HIS合成能力。該酵母基於GAL4系統，目前所 有已知的該系統質粒均可根據需要在該宿主內複製或表達。二、螢光雙雜交酵母功能驗證1、繪製生長曲線(1)陽性對照質粒的轉化使用酵母轉化試劑盒或LiAc法向重組螢光酵母中轉化可表達完整GAL4蛋白的質 粒pCLl (購自Promega公司，產品目錄號為K1604-1)。該蛋白為野生型GAL4蛋白，可激活 GAL4響應元件(UAS)，進而啟動該元件下遊報告基因的表達。pCLl通常作為GAL4雙雜交系統的陽性對照質粒。在此用以檢測重組螢光酵母基因組中GALIUAS-GALITATA-Luc片段生 物活性。(2)陽性克隆的篩選將轉化後的菌液塗布於營養缺陷型固體SD平板(_Leu，-His)，30°C倒置培養1_2 天至單斑出現。(3)螢光檢測方法I挑取具有Trp和His合成能力的酵母單斑，用營養缺陷型SD培養基(-LeU，-His) 進行震蕩培養(30°C，200rpm，旋轉半徑為1. !Bern)，至菌液的OD6tltl值為0. 4，得到的菌液為待 測菌液；培養容器內的所有物質記作菌液。營養缺陷型SD培養基(_Leu，-His)的配方為20mg · L_1腺嘌呤半硫酸鹽， 20mg · L-I鹽酸精氨酸，20mg · L-I色氨酸，30mg · L-I異亮氨酸，30mg · L-I鹽酸賴氨酸， 20mg .L-I 甲硫氨酸，50mg -L-I 苯丙氨酸，200mg -L-I 蘇氨酸，30mg -L-I 酪氨酸，20mg -L-I 尿嘧啶，150mg · L-I纈氨酸，6. 7g · L-I無胺基酸酵母氮源。將D-螢光素(D-Iuciferin)溶解於檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH值為3.0)中， 得到 D-Iuciferin 溶液(設三個濃度的 D-Iuciferin 溶液lmM、0. ImM和 0. OlmM)，將 200ul D-Iuciferin溶液與IOOul待測菌液混合，得到混合物，將得到混合物加入檢測板(白)，檢 測混合物的螢光值。螢光測定使用TECAN Infinite M200多功能酶標儀，90個循環每aiiin 測定一次，積分時間為ls，每次測定前線性震蕩2s，震蕩直徑4mm。檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液的配製方法如下將0. lmol/L檸檬酸18. 6ml與0. lmol/L檸檬酸鈉1. 4ml混合後獲得20ml檸檬 酸-檸檬酸鈉緩衝液，PH值為3. 0，濃度為0. lmol/L。結果實驗結果如圖1所示，D-Iuciferin的濃度為0. OlmM時螢光信號較為穩定， 隨時間及溫度的變化較小。而且，使用低濃度的底物對於降低實驗成本具有較大的意義。所 以確定使用0. OlmM的D-Iuciferin進行檢測。根據測定的0D600值和發光值，繪製生長曲線(圖2)。結果顯示經過延滯期後，該重組酵母具有7-8小時的對數生長期，經過5-4小時的 穩定期之後開始衰亡。通常認為對數生長期中，酵母生長速率最快、代謝旺盛、酶系活躍、細 胞的化學組成形態理化性質基本一致。較適宜進行定量研究。方法II除以下1)和2)的方法以外，其餘方法均與方法I相同。(1)至菌液的 OD6tl。值為 1.0。(2)將 IOOul D-Iuciferin 溶液與 IOOul 待測菌液混合。結果與方法I無顯著差異。方法III除以下1)和2)的方法以外，其餘方法均與方法I相同。(1)至菌液的 OD6tltl 值為 1. 5。(2)將50ul D-Iuciferin溶液與IOOul待測菌液混合。結果與方法I無顯著差異。
實施例2、利用螢光雙雜交酵母檢測蛋白質之間的相互作用pGBKT7-53質粒(購自clontech公司，產品目錄號為630303)，包含融合基因 GAL4DNA-BD-murine p53 ；pGADT7_T 質粒(購自 Clontech 公司，產品目錄號為 630303)，包 含融合基因 GAL4AD-large T-antigen。其中蛋白 murine p53 與 large T-antigen 可以相 互作用。一、質粒轉化使用酵母轉化試劑盒或LiAc法向實施例1構建的重組螢光酵母中共 轉化包含融合基因GAL4DNA-BD-murine p53的pGBKT7_53質粒和包含融合基因 GAL4AD-largeT-antigen 的 pGADT7_T 質粒。由於二者同時表達，蛋白 murine p53 和 large T-antigen可以相互作用，使得BD和AD在空間上接近，形成轉錄激活複合物，可激活GAL4 響應元件(UAS)進而激活報告基因螢光素酶的表達。即可實現對於蛋白質(X和Y)間相互 作用的研究。將pGBKT7-53質粒和pGADT7_T質粒分別單獨轉化重組螢光酵母作為陰性對照，將 PCLl質粒轉化重組螢光酵母作為陽性對照，同時設未轉化質粒的重組螢光酵母為轉空載體 對照。將轉化後的菌液塗布於營養缺陷型固體SD平板，30°C倒置培養1-2天至單斑出 現。挑取酵母單斑，過夜培養(30°C，200rpm)後，使用pGBKT7_53質粒和pGADT7_T質粒的 特定引物進行菌液PCR驗證。pGBKT7-53引物序列如下T7sequencing primer 5』 -TAATACGACTCACTATAGGGCG-3』3， DNA-BD sequencing primer5， -TTTTGCTTTTAAAACCTAAGAGTC-3，陽性結果在0. 6kb出現明亮條帶。pGADT7-T引物序列如下T7sequencing primer 5』 -TAATACGACTCACTATAGGGCG-3』3， AD sequencing primer 5』 -TCTACCACGTGCTACGTGTC-3，陽性結果在0. 8kb出現明亮條帶。二、螢光檢測挑取陽性酵母單斑，用營養缺陷型SD培養基(_Leu，-Trp)進行震蕩培養(30°C， 200rpm，旋轉半徑為1. 3cm)，至菌液的0D_值為0. 4，得到的菌液為待測菌液，培養容器內 的所有物質記作菌液，即可進行螢光發光檢測。營養缺陷型SD培養基(_Leu，-Trp)的配方為20mg · L-I腺嘌呤半硫酸鹽， 20mg · L-I鹽酸精氨酸，20mg · L-I 一水合鹽酸組氨酸，30mg · L-I異亮氨酸，30mg · L-I鹽 酸賴氨酸，20mg · L-I甲硫氨酸，50mg · L-I苯丙氨酸，200mg · L-I蘇氨酸，30mg · L-I酪氨 酸，20mg · L-I尿嘧啶，150mg · L-I纈氨酸，6. 7g · L-I無胺基酸酵母氮源。螢光測定方法與實施例1中步驟二的方法I相同。
螢光檢測結果如表1所示表1轉化不同質粒的的重組螢光酵母菌液螢光測定結果
權利要求
1.一種融合基因，由序列表中序列5第9到1030位核苷酸所示的DNA片段、報告基因、 終止子、篩選標記蛋白表達盒和序列表中序列5第4336到52 位核苷酸所示的DNA片段 依次連接構成的融合基因。
2.根據權利要求1所述的融合基因，其特徵在於所述終止子的核苷酸序列為序列表中序列5第觀03到3130位所示；所述報告基因為螢光素酶報告基因；所述篩選標記蛋白表達盒為HIS Box表達盒。
3.根據權利要求1或2所述的融合基因，其特徵在於所述螢光素酶報告基因的核苷酸序列如序列表中序列5第1063位-第2715位所示；所述HIS Box表達盒的核苷酸序列為序列表中序列5第3152到43 位所示。
4.根據權利要求1-3中任一所述的融合基因，其特徵在於所述融合基因為序列表中 序列5第9到52 位所示的DNA分子。
5.含有權利要求1-4中任一所述融合基因的重組質粒。
6.一種重組酵母菌，是將權利要求1-5中任一所述融合基因導入宿主酵母菌得到的； 所述宿主酵母菌為缺失GAL4基因和GAL80基因的酵母菌。
7.根據權利要求6所述的重組酵母菌，其特徵在於所述宿主酵母菌為酵母菌Y187。
8.檢測權利要求6或7所述的重組酵母菌中螢光素酶活性的方法，包括以下步驟(1)使權利要求6或7所述的重組酵母菌中螢光素酶表達，得到螢光素酶表達的重組酵 母菌；(2)將步驟(1)得到的所述重組酵母菌進行震蕩培養，至菌液的0D_值為0.4-1. 5或 0. 4或1. 0或1. 5，得到的菌液為待測菌液；培養容器內的所有物質記作菌液；(3)將螢光素酶底物溶解於檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液中得到螢光素酶底物溶液，將得 到的螢光素酶底物溶液與所述待測菌液混合，得到混合物，檢測混合物的螢光值，即得到所 述螢光素酶活性。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述震蕩培養是在溫度為30°C和轉速為200rpm的條件下進行，旋轉半徑為1. 3cm ；所述待測菌液與所述螢光素酶底物溶液的體積比為1 2-2 1或1 2或1 1或 2:1;所述螢光素酶底物溶液的濃度為0. OlmM ；所述螢光素酶底物為D-螢光素；所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液的濃度為0. lmol/L和pH值為3. 0。
10.權利要求6或7所述的重組酵母菌在檢測蛋白質間相互作用中的應用。
全文摘要
本發明公開了重組螢光雙雜交酵母及其檢測方法與應用。本發明所提供的重組螢光酵母是將融合基因轉入酵母菌Y187得到的重組酵母菌。所述融合基因由序列表中序列5第9到1030位所示的DNA片段、報告基因、終止子、篩選標記蛋白表達盒和序列表中序列5第4336到5226位依次連接構成的融合基因。本發明所提供的重組螢光酵母可用於快速檢測蛋白質之間的相互作用。
文檔編號C12N15/62GK102127561SQ201010601628
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月22日 優先權日2010年12月22日
發明者楊明嘉, 王子健, 馬梅 申請人:中國科學院生態環境研究中心