改善肥胖症的組合物的製作方法
2023-08-10 09:27:46 3
專利名稱：改善肥胖症的組合物的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種含有染料木黃酮、用於改善或治療肥胖症的組合物，所述染料木黃酮能加速肉毒鹼棕櫚醯轉移酶1(Carnitine PalmitoylTransferase-1)(以下簡稱「CPT-1」)的表達。具體地說，本發明的組合物含有染料木黃酮和肉毒鹼，所述染料木黃酮加速脂肪酸脂解關鍵酶CPT-1的表達，所述肉毒鹼將脂肪酸轉運至線粒體中並加速脂肪酸氧化過程中的脂肪氧化。
背景技術：
肥胖症是由能量攝入量和消耗量失衡引起的一種代謝紊亂狀態，由此產生的未被消耗的多餘能量作為脂肪積累起來，導致體內脂肪異常增長。肥胖症是東西方國家普遍存在的重要健康問題，據報導，大約30-40％的人有肥胖問題。肥胖引發應激反應，並且是高血壓、高血脂、動脈硬化、心臟病、糖尿病等類似疾病的重要誘因。
肥胖症的誘因有很多，例如高脂肪和高熱量的食品、缺乏鍛鍊、內分泌系統紊亂或者病理問題。另外，遺傳因素很重要，其重要性可從下列事實估量出來肥胖症在與遺傳因素相關的某個家族中頻繁發生。據報導，遺傳因素對肥胖症的影響至少佔30-50％。
世界範圍內已經廣泛展開了對治療和預防肥胖症的方法或療法的研究和調查。現有的方法包括減少食物攝入量以減少能量的節食療法，增加能量消耗的鍛鍊療法，諸如切除部分內臟器官或抽脂的外科手術療法，以及使用代謝增強劑、食慾抑制劑或消化/吸收抑制劑的藥物療法。但是令人滿意的方法仍未見報導，上述的方法存在副作用，例如溜溜球效應——停止治療之後，肥胖症變得更加嚴重；節食療法引起營養不均衡；或者免疫力下降導致的感染。特別是藥物療法引起的抑鬱、失眠、消化不良或其它類似現象。因此亟需發明一種安全、有效、無副作用的治療和預防肥胖症的方法。
鑑於許多疾病都由肥胖症引起，減少機體脂肪比簡單地降低體重更重要。因此，亟待尋求一種減少體內脂肪積累並加速脂肪氧化的方法。在此情況下，加速脂肪β氧化的方法成為治療肥胖症的主要靶標。在這類方法中，控制CPT-1的表達可以實現加速脂肪酸的氧化。所述CPT-1是決定脂肪酸β氧化反應速度的酶。迄今為止，通過加速CPT-1的表達以增加脂肪氧化，從而達到抑制肥胖目的的方法尚未得到廣泛研究(McCarty，Medical Hypotheses57(3)324-336，2001)。
發明內容
本發明的發明人研究尋找加速CPT-1表達的天然物質，所述CPT-1酶為脂肪酸氧化反應的限速酶，結果發現一種大豆異黃酮——染料木黃酮能加速CPT-1的表達，並且口服無副作用，能減少肥胖，並最終完成本發明。
此外，發明人還發現，將在脂肪酸往線粒體內轉運中起重要作用的L-肉毒鹼加入到含有染料木黃酮的組合物中，能夠得到加速CPT-1表達的協同效應。
因此，本發明的目的是提供一種治療肥胖症的組合物，該組合物能夠加速CPT-1的表達而加速機體脂肪的氧化代謝，所述CPT-1為脂肪氧化的限速酶。
本發明提供了一種治療肥胖症的組合物，該組合物含有染料木黃酮和L-肉毒鹼，所述染料木黃酮是一種大豆異黃酮，能加速脂肪酸脂解關鍵酶肉毒鹼棕櫚醯轉移酶1(CPT-1)的表達，所述肉毒鹼在將脂肪酸轉運至線粒體過程中起重要作用，並加速脂肪酸氧化。
下面詳細描述本發明。
肥胖症起因於脂肪積累並與遺傳因素有關，脂肪積累是由攝入和消耗的營養能量不均衡以及新陳代謝紊亂所造成的，所述新陳代謝紊亂包括脂肪氧化酶的內分泌量低、脂肪氧化酶——瘦素(Leptin)分泌量低、腎上腺素受體問題。
脂肪酸是一種脂肪組分，在細胞內經過β氧化、三羧酸(TCA)循環和氧化磷酸化作用轉化為可被用做能量的形式，同時消耗大量氧氣並產生三磷酸腺苷(ATP)。但是脂肪酸分子大而不能穿過線粒體膜。從血液轉運至細胞液中的這些長鏈脂肪酸雖然不能直接通過線粒體膜，但是可以經過下列3步酶促反應而滲透到線粒體中1、在存在於線粒體外膜上的醯基輔酶A合成酶作用下，細胞液中的長鏈脂肪酸的羧基和輔酶A(Co-A)的巰基之間反應，形成硫羥酸酯。上述所形成的脂醯輔酶A具有和乙醯輔酶A一樣的高能化合物性質。
2、脂醯輔酶A酯不能通過線粒體內膜。為了將脂肪酸轉運至線粒體內部，存在於線粒體內膜外表而的CPT-1催化脂醯基團與Co-A中的肉毒鹼發生酯交換反應。上述所形成的脂醯肉毒鹼酯通過醯基肉毒鹼/肉毒鹼轉運載體，易化擴散到線粒體基質中。
3、脂醯肉毒鹼在肉毒鹼脂醯轉移酶II催化下形成脂醯輔酶A。
脂肪酸經過上述三步酶促反應轉移至線粒體基質中，並經β氧化轉化為乙醯輔酶A，最終經檸檬酸循環轉化為電子和CO2。上述電子通過呼吸鏈過程生成ATP(Lehninger等人，Principles of Biochemistry479-505，1993)。
本發明的染料木黃酮是加速CPT-1表達以促進脂肪氧化的主要成分，並由下列結構式1表示。
結構式1 染料木黃酮染料木黃酮是一種在大豆中含有的異黃酮，具有雙酚環作為化學主鏈。以糖苷形式存在的異黃酮被體內的葡糖苷酶轉化為糖苷配基形式如染料木黃酮或黃苷元(daidzein)。大豆異黃酮具有與雌激素相似的結構和功能，因此被報導為一種植物雌激素，而且大豆異黃酮還具有多種生理作用，如改善更年期紊亂(Albertazzi等人，Obstet Gynecol 91(1)6-11，1998，Anderson等人，Public Health Nutr 2(4)489-504，1999)、治療骨質增生(Scheiber等人，Menopause 6(3)233-241，1999)、降低膽固醇(Potter等人，Am J Clin Nutr 68(6suppl)1375S-1379S，1998)、抗癌作用(Messina等人，Nutr Cancer 21(2)113-131，1994)。尤其是有報導指出，染料木黃酮在細胞內抑制蛋白酪氨酸激酶的活性從而阻斷多種生長因子信號，並且抑制異構酶的活性從而直接抑制細胞的增殖(Murkies等人，J Clin Endocrinol Metab 83(2)297-303，1998)。異黃酮的抗氧化作用已經被多種體內或體外實驗所證實，例如，抑制脂肪氧化酶的活性，抑制過氧化氫或超氧陰離子的產生，以及增強諸如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、穀胱甘肽過氧化物酶、穀胱甘肽還原酶等抗氧化酶的活性(Cai和Wei，Nutri Cancer 25(1)1-7，1996)。
以該組合物的總重量為基準，本發明的組合物含有0.001-30重量％的染料木黃酮。
此外，本發明治療肥胖症的組合物可以含有與染料木黃酮作用相似的其它異黃酮，例如黃苷元或黃豆黃素(glycitein)。
肉毒鹼是β-羥基-γ-三甲銨丁酸的通用名，在脂肪氧化中起作用，肉毒鹼還在將具有10個以上碳原子的長鏈脂肪酸從線粒體外膜轉運至線粒體內基質的過程中起重要作用，並由下列結構式2表示。
結構式2 L-肉毒鹼如上所述，L-肉毒鹼是將脂肪氧化產生能量的一種重要成分，它在肝或腎中合成並在肉類中普遍存在。L-肉毒鹼不足時，線粒體中的脂肪酸濃度變低，結果產生的能量也有所下降。另外還有報導指出，以L-肉毒鹼為底物的CPT-1在脂肪酸氧化反應中起限速酶作用(Eaton，Prog Lipid Res 41(3)197-269，2002)。
以組合物的總重為基準，本發明的組合物含有0.001-50重量％的L-肉毒鹼。
總之，本發明提供了一種治療肥胖症的組合物，該組合物含有如結構式1所示的染料木黃酮和如結構式2所示的L-肉毒鹼，該組合物可以加速脂肪細胞中脂肪的氧化，而且可以口服。
本發明的組合物還可以含有本領域常用的其它組分。所述組合物可以用作配製成如下形式的保健食品或藥品片劑、膠囊、軟膠囊、珠劑(beads)、顆粒劑、飲劑、條形食物(diet bars)、巧克力、飴糖、點心(snacks)等。
圖1顯示了染料木黃酮和L-肉毒鹼對雄性SD大鼠脂肪細胞中脂肪的氧化作用；
圖2a為RNA印跡(northern blotting)測試法，顯示使用本發明的組合物加速肝中CPT-1的表達，A高脂肪飼料，B高脂肪飼料+L-肉毒鹼(0.2％)，C高脂肪飼料+染料木黃酮(0.2％)，D高脂肪飼料+L-肉毒鹼(0.2％)+染料木黃酮(0.2％)，E高脂肪飼料+染料木黃酮(0.4％)；圖2b為光密度分析圖，顯示使用本發明的組合物加速肝中CPT-1的表達，HFD高脂肪飼料，CAL-肉毒鹼，GE染料木黃酮。
具體實施例方式
下面通過實驗實施例和配方實施例更加詳細地描述本發明，但是本發明的範圍並不僅限於實施例。描述這些實驗實施例和配方實施例是為了解釋本發明，本領域技術人員清楚本發明的範圍不限於這些實施例。實驗實施例和配方實施例中數量單位是重量％。
參考實施例1將從雄性SD大鼠分離出的附睪脂肪組織切成小塊，並加入0.1％膠原酶(DMEM培養液中，未加酚紅)，在37℃培養2小時後，過濾得到脂肪細胞。
實驗實施例1雄性SD大鼠脂肪細胞內中性脂肪氧化的加速為了證實雄性SD大鼠脂肪細胞內中性脂肪氧化的加速，使用在參考實施例1中得到的脂肪細胞進行實驗。對照組在不含本發明組合物(實驗材料)的培養基中培養。實驗實施例中，染料木黃酮和/或L-肉毒鹼的加入量為10微摩爾單位。通過將對照組數據轉換成100％，相對地計算結果。通過測定從脂肪細胞析出到培養基中的丙三醇的濃度，可以確定脂肪的氧化程度。
通過向脂肪細胞中加入含有0.5％牛血清白蛋白(BAS)且不含脂肪酸的無色達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM(Dulceco’s modified eaglesmedium))，製備細胞培養物，使用該細胞培養物進行實驗。採用購自Sigma公司(美國密蘇裡州聖路易St.Louis，MO，U.S.A)的GPO-trinder試劑盒用顏色反應方法測定丙三醇的量，使用酶聯免疫分析測讀儀(ELISA reader)測定540納米下的吸光值。
如圖1所示，與對照組相比，當單獨使用染料木黃酮和L-肉毒鹼時，脂肪酸氧化量分別增長到1.92倍和2.07倍；當聯合使用染料木黃酮和L-肉毒鹼時，脂肪酸氧化量增長到2.7倍。
實驗實施例2為了證實本發明的組合物對由飼餵高脂肪飼料引起的肥胖動物中的脂質代謝的作用，選擇白化雄性Sprague-Dawley大鼠模型。為了證實染料木黃酮、黃苷元和黃豆黃素對高脂肪飼料誘導的肥胖症的作用，選擇6周齡的大鼠適應一周，每實驗組分配12隻大鼠。實驗組如下(1)正常脂肪飼料；(2)高脂肪飼料；(3)高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮；(4)高脂肪飼料+0.2％L-肉毒鹼；(5)高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒鹼；(6)高脂肪飼料+0.2％黃苷元；(7)高脂肪飼料+0.2％黃苷元+0.2％L-肉毒鹼；(8)高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素；(9)高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素+0.2％L-肉毒鹼，並且上述各組大鼠連續飼餵8周。基本實驗飼料為純化的AIN-93G配方飼料，所製備的高脂肪飼料中脂肪佔總能量的36％(脂肪佔飼料總量的18％)，所製備的正常脂肪飼料中脂肪佔總能量的17％(脂肪佔飼料總量的7％)。
表1飼料的組成(克/千克飼料)
1)正常飼料AIN-93G配方飼料2)礦物質混合物AIN-93G配方礦物質混合物(克/千克混合物)3)維生素混合物AIN-93G配方維生素混合物(克/千克混合物)飼餵過程中，每周測量3次飼料消耗量和體重。飼餵過程結束之後，測量最終體重，體重變化如表2所示。
表2
如表2所示，大鼠體重在飼餵前互相之間不存在差別。然而，與高脂肪飼料對照組相比，飼餵染料木黃酮組的體重增加量小。此外，將染料木黃酮和L-肉毒鹼一起飼餵的組的體重增加量更小。但是單純飼餵L-肉毒鹼組與高脂肪飼料對照組的體重增加量幾乎相同。另外，與對照組比較，飼餵黃苷元和黃豆黃素代替染料木黃酮的兩組的體重增加量也小。總之，由高脂肪飼料誘導出肥胖症的大鼠，可通過飼餵染料木黃酮抑制大鼠體重增加；當聯合飼餵L-肉毒鹼時，抑制體重增加的效果更加明顯。為了進行比較，各測試組消耗的飼料量幾乎相同。
實驗實施例39組大鼠分別用正常脂肪飼料、高脂肪飼料、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮、高脂肪飼料+0.2％L-肉毒鹼、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒鹼、高脂肪飼料+0.2％黃苷元、高脂肪飼料+0.2％黃苷元+0.2％L-肉毒鹼、高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素、高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素+0.2％L-肉毒鹼飼餵8周後，處死大鼠並取其附睪脂肪組織。用生理鹽水洗滌上述得到的附睪脂肪，在濾床上除去水分，然後稱重。
表3
如上表所示，與高脂肪飼料對照組相比，飼餵染料木黃酮組的附睪脂肪組織的重量較小，聯合飼餵L-肉毒鹼組的附睪脂肪組織重量更小。總之，患有由高脂肪飼料誘導的肥胖症的大鼠，可通過飼餵染料木黃酮來抑制機體脂肪增加；當聯合飼餵L-肉毒鹼時，抑制機體脂肪增加的效果更加明顯。但是，當只飼餵L-肉毒鹼時，該組的附睪脂肪組織重量與高脂肪飼料對照組的幾乎相同。另外，飼餵黃苷元和黃豆黃素代替染料木黃酮的兩組與對照組比較，兩組的機體脂肪重量也較小。
實驗實施例4分別用下列4組高脂肪飼料、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒鹼、高脂肪飼料+0.4％染料木黃酮飼餵8周後，處死大鼠取其肝組織。將肝組織勻漿後，用由苯酚利異硫氰酸胍組成的總RNA提取試劑盒(TRIZOL)(美國紐約grand Island生物技術公司)從該組織中提取RNA。使用RNA印跡(northern blotting)測試法測定上述提取出的RNA中的CPT-1 mRNA表達程度並用光密度分析法定量表示該表達程度，結果如圖2a和圖2b所示。
如圖2b所示，與高脂肪飼料組相比，飼餵染料木黃酮組的CPT-1表達增加，並且當聯合飼餵L-肉毒鹼時，這種增加更為明顯。此外，高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒鹼組[HFD+CA(0.2％)+GE(0.2％)]與高脂肪飼料+0.4％染料木黃酮組[HFD+GE(0.4％)]的CPT-1表達量相似。上述結果證實CPT-1表達量隨染料木黃酮的濃度增加而增加；當聯合飼餵L-肉毒鹼時得到協同效應。所述協同效應可以防止使用過量染料木黃酮所帶來的副作用，例如雌性大鼠內分泌紊亂、雄性大鼠精子和精液減少(Kazushi Okazaki等，ArchToxicol 2002，76553-559；K.Barry Delclos等，Reproductive toxicology 2001，15647-663)。此外，由於染料木黃酮是非常昂貴的材料，利用協同效應可以減少其用量，從而節約成本。
配方實施例1軟膠囊將80毫克染料木黃酮、180毫克大豆油、2毫克棕櫚油、8毫克植物油、4毫克蜂蠟和6毫克卵磷脂混合，按照常規方法往每個膠囊中填裝400毫克混合物，製成軟膠囊。
配方實施例2片劑將74毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒鹼、200毫克低聚半乳糖、60毫克乳糖和140毫克麥芽糖混合，用流化床乾燥器造粒，再向其中加入6毫克糖酯，擠壓製得片劑。最終得到片劑600毫克。
配方實施例3顆粒劑將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒鹼、250毫克結晶葡萄糖酸酐、550毫克澱粉混合，使用流化床造粒機造粒，包裝。最終得到顆粒劑1克。
配方實施例4飲劑將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒鹼、10克葡萄糖、0.6克檸檬酸和25克液態寡糖混合，再向其中加入300毫升純淨水，分別灌裝到200毫升的瓶中。灌裝後，130℃下滅菌4-5秒即得到最終飲劑。
配方實施例5飴糖將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒鹼、1.8克玉米糖漿、0.5克脫脂奶粉、0.5克大豆卵磷脂、0.6克黃油、0.4克植物油、1.4克糖、0.58克人造黃油和20毫克食鹽混合，加工成形得到飴糖。最後得到飴糖6克。
配方實施例6條形食物將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒鹼、20克澱粉、9克小麥粉、11克澱粉糖漿、11.6克麥芽糖、6克人造黃油、30毫克食鹽、30毫克檸檬酸、140毫克碳酸鈉和2克糖酯混合，加工成條形。最終得到條形食物60克。
如上所述，本發明用於節食、預防或治療肥胖症的組合物可以防止並控制肥胖。該組合物含有染料木黃酮和L-肉毒鹼，所述染料木黃酮加速脂肪酸脂解代謝途徑的關鍵酶肉毒鹼棕櫚醯轉移酶1(CPT-1)的表達。所述L-肉毒鹼將脂肪酸轉運到線粒體中，並加速脂肪氧化。
權利要求
1.一種治療肥胖症的組合物，該組合物含有至少一種加速肉毒鹼棕櫚醯轉移酶1(CPT-1)表達的組分。
2.根據權利要求1所述的治療肥胖症的組合物，該組合物加速脂肪細胞內中性脂肪的氧化(脂解)。
3.根據權利要求1所述的治療肥胖症的組合物，其中，所述加速肉毒鹼棕櫚醯轉移酶1(CPT-1)表達的組分為染料木黃酮和L-肉毒鹼。
4.根據權利要求3所述的治療肥胖症的組合物，其中，以該組合物的總重量為基準，染料木黃酮的含量為0.001-30重量％，L-肉毒鹼的含量為0.001-50重量％。
5.根據權利要求3所述的治療肥胖症的組合物，該組合物含有黃苷元或黃豆黃素以替代染料木黃酮。
6.根據權利要求1所述的治療肥胖症的組合物，該組合物具有選自由片劑、膠囊、軟膠囊、珠劑、顆粒劑、飲劑、條形食物、巧克力、飴糖和點心所組成的組中的配方。
全文摘要
本發明是關於一種含有染料木黃酮、用於改善或治療肥胖症的組合物，所述染料木黃酮能加速肉毒鹼棕櫚醯轉移酶1(CPT－1)的表達。具體地說，本發明的組合物含有染料木黃酮和肉毒鹼，所述染料木黃酮加速脂肪酸脂解關鍵酶CPT－1的表達，所述肉毒鹼將脂肪酸轉運至線粒體中並加速脂肪酸氧化過程中的脂肪氧化。
文檔編號A61P3/00GK1758906SQ200380110196
公開日2006年4月12日 申請日期2003年10月21日 優先權日2003年3月25日
發明者樸賢宇, 金宣姈, 金完起, 金修晶, 金俞, 金知賢, 李泰龍, 沈榮哲, 李尚駿 申請人:株式會社太平洋