一種連翹酯苷b和金石蠶苷單體的高效分離純化方法
2023-10-17 21:16:49 5
專利名稱：一種連翹酯苷b和金石蠶苷單體的高效分離純化方法
技術領域：
本發明涉及一種植物中單體活性成分的分離純化方法，屬醫藥技術領域，具體來 說，本發明涉及一種從廣東紫珠藥材中分離高純度連翹酯苷B和金石蠶苷單體的方法，以 及連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分析方法。
/^(Callicarpa kwangtungensis Chun. )(Verbenaceae)胃 珠屬(Callicarpa L.)植物，別名萬年青、珍珠風、臭常山、老鴉飯、金刀菜等，主要分布於 浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、貴州、雲南等地，收載於江西省藥材標準(1996年 版第M頁)，其藥用部位為乾燥的莖枝及葉，具有收斂止血、清熱解毒之功效。用於咯血， 衄血，便血，肺胃出血，崩漏，肺熱咳嗽，咽喉腫痛，燒傷，熱毒瘡瘍，外傷出血。廣東紫珠對金 黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌在體外有較強的抑制作用，對實驗性炎症早期的滲出產生明 顯的抑制炎症反應，可明顯縮短出血和凝血時間，止血效果顯著。化學成分研究表明，廣東 紫珠的主要活性成分為連翹酯苷B和金石蠶苷，除此之外還含有沒食子酸、紫珠萜酮、谷甾 醇、齊墩果酸、熊果酸、水楊酸、丙氨酸等多種成分。連翹酯苷B抗金黃色葡萄球菌和奇異變 形桿菌的作用，以及金石蠶苷抗氧化、抑制紅血球溶血的作用均與廣東紫珠的藥理作用密 切相關。
廣東紫珠藥材是中國藥典2010年版起草品種(YS — 264)，連翹酯苷B和 金石蠶苷是在《中國藥典》2010年版一部中收載的指標成分，它們的結構式如下針對廣東紫珠藥理作用應用廣泛，但主要是對其提取物的製備和應用，如申請號為 200810014095. 7的專利申請公開了「連翹酯苷B在製備治療或預防急慢性肝損傷及肝纖維 化的藥物中的應用」。加之，連翹酯苷B和金石蠶苷已在2010年藥典中被列為標準，這兩種 單體的需求量越來越大，尤其是金石蠶苷在藥材中含量很低，從藥材中分離出單體非常困 難，而且目前市場上還沒有連翹酯苷B和金石蠶苷克級產品的提供，也未有連翹酯苷B和金 石蠶苷單體的製備分離報導，因此從廣東紫珠中分離純化連翹酯苷B和金石蠶苷單體顯得 非常必要，具有廣泛的應用價值。
背景技術：
連_震證SL<3 M
發明內容
本發明旨在克服上述缺陷，提供一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效分離純化 方法，此方法不但可實現連翹酯苷B和金石蠶苷單體的同步分離，且分離效率高，工藝穩 定，成本低廉，可大量製備得到純度大於98%的單體。同時本發明還提供了一種連翹酯苷B 和金石蠶苷單體的高效液相色譜分析方法。
為實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的分離純化方法，包括步驟a、廣東紫珠藥材的提取和濃 縮；步驟b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集；步驟C、連翹酯苷B和金石蠶苷半成品溶液的製備； 步驟d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離；步驟e、單體的濃縮及乾燥處理。
上述步驟a—e的具體工藝方法如下a、廣東紫珠藥材的提取和濃縮將廣東紫珠藥材粉碎成4(Γ65目的粉末，加入藥材重 量5 10倍的乙醇溶液，50 70°C加熱提取，每次提取2小時，共提取3次，合併提取液，於 5(T80°C條件下減壓回收乙醇，濃縮至水溶液，過濾，得濃縮液； 所述乙醇溶液的體積百分比濃度為309Γ50%。
步驟a也可採用加入藥材重量5 10倍的蒸餾水進行水提取，過濾得水提取液。
b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集將步驟a所得濃縮液或水提取液上活化好的 AB-8大孔樹脂進行吸附，吸附完全後，先用3倍柱體積的水進行洗脫，去掉糖類等大極性雜 質，然後再用3倍柱體積的30% (V/V)乙醇解析，收集解析液，合併濃縮液至浸膏；c、連翹酯苷B和金石蠶苷半成品溶液的製備將步驟b製得的濃縮浸膏以60-80目矽 膠拌樣後進行矽膠層析柱色譜初分，採用二氯甲烷一甲醇洗脫體系，並按50 :1 — 1 1的體 積比由高到低作梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，得到連翹酯苷B和金石蠶苷半成品 甲醇溶液；d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離利用製備型高效液相色譜柱，將 步驟c所得連翹酯苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液進行連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效 分離，示差折光檢測器在線檢測，分別收集連翹酯苷B和金石蠶苷的單體溶液，分別於50°C 減壓濃縮，再分別進行二次高效液相色譜分離；所述高效液相色譜柱的直徑為8 30cm，粒度10 μ m、C18填料，P =0. 940 (20°C ) g/mL 的甲醇水溶液作為流動相，流速10(T300mL/min。
所述甲醇水溶液的體積百分比濃度為40%，且在該甲醇水溶液中加有0. 5% (體積 比)的磷酸。
e、單體溶液的濃縮及乾燥處理將步驟d所得單體溶液，分別於50 60°C減壓回 收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附樹脂富集，70 95%乙醇(V/V)解吸附，解吸液 減壓濃縮至粉末狀，50°C與五氧化二磷共存真空乾燥至恆重，即可收集分別得到連翹酯苷B 和金石蠶苷單體產品。
本發明的有益效果表現在1、採用製備型高效液相色譜柱對連翹酯苷B和金石蠶苷單體進行分離，示差折光檢測 器在線檢測，針對性收集連翹酯苷B和金石蠶苷單體，目標明確，避免了常規柱分離的盲目 性和先分離後檢測造成的資源浪費。
2、過程直觀，目標性強，對產品的質量易於控制，產品純度均在98%以上。
3、本發明整體工藝高效，環保，收率高，產量大，適合工業化生產。
圖1為本發明廣東紫珠原料的高效液相色譜2為本發明連翹酯苷B和金石蠶苷半成品的高效液相在線製備色譜圖 圖3為本發明連翹酯苷B單體(含量> 98%)的高效液相色譜圖 圖4為本發明金石蠶苷單體(含量> 98%)的高效液相色譜圖。
具體實施方式
實施例1一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效分離純化方法，其特徵在於按如下工藝步驟進行a、廣東紫珠藥材的提取和濃縮取廣東紫珠藥材10kg，粉碎成50目粉末，加入藥材重 量5倍的體積百分比濃度為30%的乙醇溶液，60°C回流提取3次，每次池，合併三次的提取 液；於70°C減壓回收乙醇，濃縮至水溶液，過濾，得濃縮液；b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集將步驟a所得濃縮液上活化好的AB-8大孔樹脂進行 吸附，吸附完全後先用3倍柱體積水進行洗脫，去掉糖類等大極性雜質，然後用3倍柱體積 的30% (V/V)乙醇解析，收集解析液，合併濃縮至浸膏；c、連翹酯苷B和金石蠶苷半成品溶液的製備將步驟c製得的濃縮浸膏以60-80目矽 膠拌樣後進行矽膠層析柱色譜初分，採用二氯甲烷一甲醇洗脫體系，並依次按50 1,20 1, 10 1, 5 :1和1 :1的體積比由高到低作梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，得到連翹酯 苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液40g ；d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離利用製備型高效液相色譜柱，分 離柱直徑15cm，C18填料，粒度10 μ m，P =0. 940 (20°C ) g/mL的甲醇水溶液作為流動相，流 速300mL/min，將步驟c所得連翹酯苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液進行連翹酯苷B和金石 蠶苷單體的高效分離，示差折光檢測器在線檢測，分別收集連翹酯苷B和金石蠶苷的單體 溶液，分別濃縮，再分別進行二次高效液相色譜分離；e、製備所得單體溶液的處理以及產品乾燥將步驟d所得單體溶液，分別於50 60°C 減壓回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附樹脂富集，80%乙醇解吸附，解吸液減壓濃 縮至粉末狀，50°C與五氧化二磷共存真空乾燥至恆重，即可收集產品，分別得到連翹酯苷單 體B Mg、金石蠶苷單體3g。
所得產品用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，連翹酯苷B純度 98. 61%,金石蠶苷純度99. 28%ο
色譜柱填料為C18，粒度5 μ m,流動相為含0. 5%磷酸的40%甲醇水溶液(體積百分 比濃度)，檢測波長為332nm ；流速lmL/min。
實施例2一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效分離純化方法，其特徵在於按如下工藝步驟進行a、廣東紫珠藥材的提取和濃縮取廣東紫珠藥材證8，粉碎成60目粉末，加入5倍重量的體積百分比濃度為40%的乙醇溶液，55°C回流提取3次，每次池，合併三次的提取液；於 70°C減壓回收乙醇，濃縮至水溶液，過濾，得濃縮液；b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集將步驟a所得濃縮液上活化好的AB-8大孔樹脂進行 吸附，吸附完全後先用3倍柱體積水進行洗脫，去掉糖類等大極性雜質，然後用3倍柱體積 的30% (V/V)乙醇解析，收集解析液，合併濃縮至浸膏；c、連翹酯苷B和金石蠶苷半成品溶液的製備將步驟c製得的濃縮浸膏以60-80目矽 膠拌樣後進行矽膠層析柱色譜初分，採用二氯甲烷一甲醇洗脫體系，並依次按50:1，15:1， 8 1, 4 :1和1 :1的體積比由高到低作梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，得到連翹酯苷 B和金石蠶苷半成品甲醇溶液22g ；d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離利用製備型高效液相色譜柱，分 離柱直徑15cm，C18填料，粒度10 μ m，P =0. 940 (20°C ) g/mL的甲醇水溶液作為流動相，流 速140mL/min，將步驟c所得連翹酯苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液進行連翹酯苷B和金石 蠶苷單體的高效分離，示差折光檢測器在線檢測，分別收集連翹酯苷B和金石蠶苷的單體 溶液，分別濃縮，再分別進行二次高效液相色譜分離；e、製備所得單體溶液的處理以及產品乾燥將步驟d所得單體溶液，分別於50 60°C 減壓回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附樹脂富集，95%乙醇解吸附，解吸液減壓濃 縮至粉末狀，50°C與五氧化二磷共存真空乾燥至恆重，即可收集產品，分別得到連翹酯苷B 單體13g、金石蠶苷單體1.8g。
所得產品用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，連翹酯苷B純度 98. 8%，金石蠶苷純度99. 1%。檢測條件同實施例1。
實施例3一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效分離純化方法，其特徵在於按如下工藝步驟進行a、廣東紫珠藥材的提取和濃縮取廣東紫珠藥材20kg，粉碎成40目粉末，加入8倍重 量的體積百分比濃度為50%的乙醇溶液，65°C回流提取3次，每次池，合併三次的提取液； 於80°C減壓回收乙醇，濃縮至水溶液，過濾，得濃縮液；b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集將步驟a所得濃縮液上活化好的AB-8大孔樹脂進行 吸附，吸附完全後先用3倍柱體積水進行洗脫，去掉糖類等大極性雜質，然後用3倍柱體積 的30% (V/V)乙醇解析，收集解析液，合併濃縮至浸膏；c、連翹酯苷B和金石蠶苷半成品溶液的製備將步驟c製得的濃縮浸膏以矽膠(60-80 目)拌樣後進行矽膠層析柱色譜初分，採用二氯甲烷一甲醇洗脫體系，並依次按50 :1，15 1,10 1, 5 :1和1 :1的體積比由高到低作梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，得到連翹 酯苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液90g ；d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離利用製備型高效液相色譜柱，分 離柱直徑20cm，C18填料，粒度10 μ m，P =0. 940 (20°C ) g/mL的甲醇水溶液作為流動相，流 速300mL/min，將步驟c所得連翹酯苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液進行連翹酯苷B和金石 蠶苷單體的高效分離，示差折光檢測器在線檢測，分別收集連翹酯苷B和金石蠶苷的單體 溶液，分別濃縮，再分別進行二次高效液相色譜分離；e、製備所得單體溶液的處理以及產品乾燥將步驟d所得單體溶液，分別於50 60°C6減壓回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附樹脂富集，75%乙醇解吸附，解吸液減壓濃 縮至粉末狀，50°C與五氧化二磷共存真空乾燥至恆重，即可收集產品，分別得到連翹酯苷B 單體50g、金石蠶苷單體6. 5g。
所得產品用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，連翹酯苷B純度98.5%，金石蠶苷純度98. 8%。檢測條件同實施例1。
實施例4一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效分離純化方法，其特徵在於按如下工藝步驟進行a、廣東紫珠藥材的提取和濃縮取廣東紫珠藥材30kg，粉碎成50目粉末，加入10倍重 量的水溶液，700C回流提取3次，每次池，合併三次的提取液，過濾；b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集將步驟a所得提取液上活化好的AB-8大孔樹脂進 行吸附，吸附完全後先用3倍柱體積水進行洗脫，去掉糖類等大極性雜質，然後用3倍柱體 積的30% (V/V)乙醇解析，收集解析液，合併濃縮至浸膏；c、連翹酯苷B和金石蠶苷半成品溶液的製備將步驟c製得的濃縮浸膏以矽膠(60-80 目)拌樣後進行矽膠層析柱色譜初分，採用二氯甲烷一甲醇洗脫體系，並依次按50 1,12 1,6 1, 3 :1和1 :1的體積比由高到低作梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，得到連翹酯 苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液125g ；d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離利用製備型高效液相色譜柱，分 離柱直徑20cm，C18填料，粒度10 μ m，P =0. 940 (20°C ) g/mL的甲醇水溶液作為流動相，流 速300mL/min，將步驟c所得連翹酯苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液進行連翹酯苷B和金石 蠶苷單體的高效分離，示差折光檢測器在線檢測，分別收集連翹酯苷B和金石蠶苷的單體 溶液，分別濃縮，再分別進行二次高效液相色譜分離；e、製備所得單體溶液的處理以及產品乾燥將步驟d所得單體溶液，分別於50 60°C 減壓回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附樹脂富集，75%乙醇解吸附，解吸液減壓濃 縮至粉末狀，50°C與五氧化二磷共存真空乾燥至恆重，即可收集產品，分別得到連翹酯苷B 單體75g、金石蠶苷單體9. 5g。
所得產品用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，連翹酯苷B純度99.1%，金石蠶苷純度99. 3%。檢測條件同實施例1。
權利要求
1.一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的分離純化方法，其特徵在於包括步驟a、廣東紫 珠藥材的提取和濃縮；步驟b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集；步驟C、連翹酯苷B和金石蠶 苷半成品溶液的製備；步驟d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離；步驟e、單 體的濃縮及乾燥處理。
2.如權利要求1所述的一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的分離純化方法，其特徵在於 所述步驟的具體工藝方法如下a、廣東紫珠藥材的提取和濃縮將廣東紫珠藥材粉碎成4(Γ65目的粉末，加入藥材重 量5 10倍的乙醇溶液，50 70°C加熱提取，每次提取2小時，共提取3次，合併提取液， 於5(T80°C條件下減壓回收乙醇，濃縮至水溶液，過濾，得濃縮液；或者採用加入藥材重量 5^10倍的蒸餾水進行水提取，過濾得水提取液；b、連翹酯苷B和金石蠶苷的富集將步驟a所得濃縮液或水提取液上活化好的AB-8大 孔樹脂進行吸附，吸附完全後，先用3倍柱體積的水進行洗脫，去掉糖類等大極性雜質，然 後再用3倍柱體積的30%乙醇解析，收集解析液，合併濃縮液至浸膏；c、連翹酯苷B和金石蠶苷半成品溶液的製備將步驟b製得的濃縮浸膏以60-80目矽 膠拌樣後進行矽膠層析柱色譜初分，採用二氯甲烷一甲醇洗脫體系，並按50 :1 — 1 1的體 積比由高到低作梯度洗脫，TLC跟蹤檢測，收集洗脫液，得到連翹酯苷B和金石蠶苷半成品 甲醇溶液；d、連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效液相色譜分離利用製備型高效液相色譜柱，將 步驟c所得連翹酯苷B和金石蠶苷半成品甲醇溶液進行連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效 分離，示差折光檢測器在線檢測，分別收集連翹酯苷B和金石蠶苷的單體溶液，分別於50°C 減壓濃縮，再分別進行二次高效液相色譜分離；e、單體溶液的濃縮及乾燥處理將步驟d所得單體溶液，分別於50 60°C減壓回收甲 醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附樹脂富集，70 95%乙醇解吸附，解吸液減壓濃縮至粉 末狀，50°C與五氧化二磷共存真空乾燥至恆重，即可收集分別得到連翹酯苷B和金石蠶苷 單體產品。
3.如權利要求2所述的一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的分離純化方法，其特徵在於 步驟a所述乙醇溶液的體積百分比濃度為309Γ50%。
4.如權利要求2所述的一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的分離純化方法，其特徵在於 步驟d所述高效液相色譜柱的直徑為8 30cm，粒度10 μ m、C18填料，P =0. 940g/mL的甲 醇水溶液作為流動相，流速10(T300mL/min。
5.如權利要求2或4所述的一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的分離純化方法，其特徵 在於所述甲醇水溶液為含0. 5%磷酸的40%甲醇水溶液。
全文摘要
本發明公開了一種連翹酯苷B和金石蠶苷單體的高效分離純化方法，它是以廣東紫珠藥材為原料，先用極性溶劑對粉碎的藥材進行提取，然後通過AB-8大孔樹脂進行富集，除去糖類等大極性雜質，然後通過矽膠柱層析進行脫色粗分，再將粗分的半成品用製備型高效液相色譜柱進行分離純化，示差折光檢測器進行在線檢測，針對性收集連翹酯苷B和金石蠶苷單體溶液，分別處理乾燥，可獲得純度大於98%的連翹酯苷B和金石蠶苷單體。本發明可實現連翹酯苷B和金石蠶苷的同步分離，製備量大、收率高、產品質量好，適合工業化生產。
文檔編號C07H15/18GK102040635SQ201010555338
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者劉丁, 常建紅, 郭建華 申請人:成都普思生物科技有限公司