一種反硝化菌的篩選方法

2023-08-10 11:40:26 1

專利名稱：一種反硝化菌的篩選方法
技術領域：
本發明屬於汙水生物處理技術領域，具體地說涉及一種利用硝酸鹽氮為唯一氮源 篩選高效好氧反硝化菌的方法。
背景技術：
在汙水處理領域，生物脫氮被認為是經濟有效的汙水脫氮方法之一。傳統的生物 脫氮工藝將硝化和反硝化作為兩個相互獨立的過程，分別在不同反應器中進行，如Α/Α/0、 A/0等；或者用間歇的好氧和厭氧條件來運行，如SBR、氧化溝等，即硝化反應發生在好氧條 件下，反硝化反應發生在嚴格的缺氧或者厭氧條件下，使二者在時間或空間上分離。這就使 得工藝流程較長、基建投資高，處理效果有限；同時，硝化池需要補充鹼度、反硝化池需要補 充碳源，這同樣增加了運行成本。硝化和反硝化過程由兩類不同的生物來完成。一般認為，將氨氮(NH3-N)氧化成硝 態氮的硝化菌需要在好氧條件下才能完成硝化反應；而進行硝酸鹽呼吸的反硝化菌只有在 無氧條件下，才能誘導出反硝化作用所需要的硝酸鹽還原酶A和亞硝酸還原酶，以硝酸鹽 和亞硝酸鹽為電子受體進行反硝化脫氮，該細菌屬於兼性厭氧微生物。由於微生物所需環 境條件的不同，因此整個脫氮過程無論是在兩個反應器中進行還是在同一反應器中進行， 系統的抗衝擊能力均比較差，高濃度的氨氮、硝態氮等會抑制硝化菌生長；同樣，高濃度的 溶解氧(DO)和碳源不足也會抑制反硝化菌生長，從而影響生物脫氮總體效果。近年來，在許多實際運行中的好氧反硝化池中，常常發現有總氮的損失(馮葉成 等，同時硝化反硝化的實驗研究.上海環境科學，2002，21)。國內外不少研究和報導也證實 了好氧反硝化的存在(丁愛中等.好氧生物反硝化反應的實驗證據[J]科學通報，2000， 45)。因此利用好氧反硝化菌開發脫氮技術，具有以下優點(1)使脫氮過程在同一個反應器 中進行，可以大大減少佔地面積和建設投資；(2)可以減少調節系統PH的化學物質和碳源 的用量，節省藥劑費用，降低運轉成本；(3)在脫氮的同時還能脫除COD (化學需氧量)；(4) 在處理過程中，系統的抗衝擊能力增強，處理效果好。CN1594591A公開了一種篩選好氧反硝化菌的方法，該方法採取馴化厭氧脫氮汙泥 的方法富集生物菌群，將馴化後得到的活性汙泥內的生物菌群採用平板係數法與平板劃線 法分離和純化。對分離、純化後得到的純菌進行初篩，得到對TN去除率達50%以上的菌株， 對初篩後的菌株進行復篩，得到好氧反硝化菌。該方法獲得的菌株由於採用馴化厭氧脫氮 汙泥的方法富集生物菌群，使得篩選菌株來源於厭氧環境，沒有經歷高濃度氨氮汙水的好 氧馴化過程，在遇到高濃度氨氮汙水衝擊時，總氮去除能力顯得不足；該方法要求進水COD 控制在4500 5500mg/L範圍內，在處理不同的汙水時受到了限制。

發明內容
本發明的目的是提供一種篩選具有天然生長優勢的好氧反硝化菌的方法，該方法 篩選到的反硝化菌應用於汙水脫氮處理，除了能夠克服傳統生物脫氮技術存在的不足外，還能在不同的環境條件下作為生物修復劑補加到受衝擊的汙水處理系統中，快速恢復系統 的處理能力，為同步硝化反硝化脫氮準備了條件。本發明好氧反硝化菌的篩選方法包括以下內容(1)用含氨汙水對好氧活性汙泥進行富集培養；(2)從富集菌群中分離純化反硝化菌；(3)用含有目標汙染物的水對純化的反硝化菌進行生長能力馴化；(4)在不同溶解氧條件下對馴化的反硝化菌進行脫氮能力馴化。步驟(1)富集好氧脫氨氮活性汙泥可以為本領域現有任何方法。優選逐漸提高基 質氨氮濃度的方式進行富集，培養過程培養液氨氮初始濃度為100 600mg/L，最終氨氮濃 度為700 2000mg/L，優選1000 1500mg/L，培養液COD值低於400mg/L，優選低於200mg/ L0當氨氮初始濃度降低至為150mg/L以下時，提高基質氨氮濃度同時補加碳源保證培養液 COD濃度不低於100mg/L，每次提高氨氮濃度50 400mg/L。接種汙泥可以選取本領域常用 的具有硝化作用的活性汙泥，優選取自煉油和煉油催化劑汙水處理廠的活性汙泥。所述富 集培養條件為溫度20 40°C;pH 6.0 9.0，優選6. 5 8.0 ;D0 (溶解氧)大於ang·!/1， 優選2 IOmg · Γ1。步驟( 採用平板稀釋法或平板劃線法對富集活性汙泥內的菌群進行分離純化， 培養基可以是本領域常用的培養基。具體操作取一定量的泥水混合物稀釋不同的倍數後 接種於含有硝酸鹽氮的固體培養基平板中，25 35°C恆溫靜置培養，培養液中除了含有硝 酸鹽外，還含有h^Mg^K^Ca2+等金屬離子以及磷酸根離子等，以溴百裡芬蘭做指示劑進 行分離和純化。選取變藍色的單菌落稀釋不同的倍數後接種於同樣的固體平板進行分離， 重複上述操作直到獲得純化菌株。步驟C3)採用不同碳源對純化出的菌株進行生長能力馴化，使得該菌株既能夠在 營養豐富價格高的優質碳源(如琥珀酸鈉、葡萄糖、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乙醇等)條件下生 長，也能夠在廉價的劣質碳源(如工業甲醇、工業廢乙醇、高濃度COD汙水等)條件下生長。 具體方法採取逐漸降低優質碳源逐漸提高劣質碳源的方式進行梯度馴化，從固體平板上 用接菌環挑取部分菌落接入裝有一定量培養液的反應器中培養，初始氮源濃度(以NO3--N 計)為50 200mg/L，初始碳源濃度(以COD計)為500 2000mg/L，定期檢測培養液中 氮源和碳源濃度，控制生長能力馴化過程中反應系統的碳源和氮源的質量比為3 1 20 1，如果碳源不足補加碳源，如果碳源過剩則補加氮源，直到總氮和COD濃度分別低 於15mg/L和60mg/L時終止反應。培養條件為溫度為20 35°C ；pH為6. 5 9. 8，優選 7. 0 8. 5 ；DO (溶解氧)為2 IOmg · Γ1，優選為3 5mg · Γ1。步驟⑷採取不同的溶解氧條件進行脫氮能力馴化。具體過程將步驟⑶獲得 的菌懸液按照一定的接種量接入含有硝酸鹽氮的液體培養液中進行馴化，碳源可以是任何 微生物能夠利用的有機碳源。馴化過程中採取菌體轉接、批次換水或者批次補料的方式， 並逐漸提高氮源和碳源濃度，最終達到欲處理廢水中氮和碳的濃度。如果欲處理廢水氮濃 度較低，可以直接用欲處理廢水進行脫氮能力馴化。馴化過程中，溫度為20 35°C ；pH為 6. 5 9. 8，優選7. 0 8. 5，給予不同的溶解氧和COD濃度條件進行菌體馴化，可以獲得兩 種不同的脫氮路徑，第一種脫氮路徑控制溶解氧濃度5mg/L以上，初始培養液中氮源濃度 (以NO3--N計)為50 200mg/L，碳源濃度(以COD計)為1000 2000mg/L，菌株去除的碳源和氮源質量比10 1以上，優選為10 1 20 1 ；第二種脫氮路徑控制溶解氧濃度 < 5mg/L，初始培養液中氮源濃度(以NO3--N計)為50 200mg/L，初始碳源濃度(以COD 計)為400 1000mg/L，菌株去除的碳源和氮源質量比< 10 1，優選為3 1至<10 1。 第一種是PH上升幅度大、碳氮比高的路徑，第二種是pH上升幅度小、碳氮比低的路徑。本發明方法從高氨氮、低COD廢水馴化的好氧汙泥中篩選好氧反硝化菌，獲得在 苛刻環境條件下能夠存活、在適宜環境條件能夠脫氮的好氧反硝化菌株。本發明方法獲得的好氧反硝化菌以硝酸鹽為唯一氮源，在溶解氧充足的情況下可 以利用高濃度的碳源完成反硝化脫氮反應，在溶解氧不足的情況下可以利用低濃度的碳源 完成反硝化脫氮反應。溶解氧濃度不同可以獲得不同的脫氮和除COD效果。所以該反硝化 菌在一定程度上不受碳源濃度的限制，可以適應不同溶解氧濃度和不同碳源濃度，因此對 環境條件的適應能力強，耐受性好，適用於各種含氮和COD的汙水處理。當汙水處理廠受到 衝擊時還可以作為生物修復劑進行補加。本發明好氧反硝化菌的篩選方法首先在好氧汙泥這種群體內分離出適應能力和 耐受衝擊能力強的反硝化菌。對篩選純化的反硝化菌進行碳源利用馴化和不同溶解氧條件 馴化，可以使該生物能夠適用於各種含有COD和氮素的汙水處理；同時根據不同的COD濃度 和總氮濃度，可以提供不同的溶解氧條件，以保證處理後汙水中的COD和總氮濃度均能滿 足達標排放要求。不同的培養馴化階段優化生物對不同培養條件的適應性，獲得了綜合優 化效果，得到的微生物菌群適應範圍廣、使用性能好。
具體實施例方式本發明的特點是首先採用好氧脫氨氮活性汙泥進行富集，以獲得在好氧、低碳源 的環境中能夠生存的反硝化菌，然後採用不同碳源的汙水在不同溶氧條件下進行對環境的 耐受性馴化，最終獲得在複雜環境下能夠生存、在適宜條件下即可高效處理同時含有硝酸 鹽氮和COD汙水的好氧反硝化菌。本發明好氧反硝化菌具有較強的耐受性和適應性，具有較好的抗衝擊性，能同時 脫氮和除COD ；可以實現同時硝化和反硝化工藝在工業汙水處理中的應用。實施例一(1)富集培養從某煉油汙水處理廠好氧曝氣池內取一定量的活性汙泥，接入好 氧反應器中，採用逐漸提高基質氨氮濃度的方式進行富集，汙水的初始氨氮濃度為IOOmg/ L、COD濃度為350mg/L，培養過程中當氨氮濃度低於10mg/L時，補加氮源，使氨氮濃度比 上一次提高100mg/L，直到提高到1000mg/L。富集過程中溫度為25°C ；pH 7. 5，DO(溶解 氧)2. 5mg 『 Γ1 左右。(2)篩選純化取步驟(1)中得到的一定量的泥水混合物稀釋不同的倍數後塗布 於固體培養基平板中培養，培養液中硝酸鹽氮濃度為100mg/L，還含有少量的狗2+、Mg2+、K+、 Ca2+等金屬離子以及磷酸根離子等，30°C恆溫靜置培養，以丁二酸鈉為碳源，按照碳氮質量 比10 1配置，以溴百裡芬蘭做指示劑進行分離和純化。培養2-3天後，選取變藍色的單 菌落再稀釋不同的倍數後塗布於同樣的固體平板進行分離，重複上述操作直到獲得純化菌 株。(3)生長能力馴化從固體平板上用接菌環挑取部分菌落接入裝有一定量培養液的反應器中培養，培養液中初始氮源濃度為100mg/L，分別加入一定量的琥珀酸鈉和甲醇作 為碳源，兩種碳源按照質量比10 1、5 1、1 1、和單純以甲醇為碳源對篩選出的菌株 進行梯度馴化。7 9天後獲得去除碳氮比為3 1 20 1的菌株。培養條件為溫度 25°C,pH 7. 5，DO(溶解氧)小於 5mg · Γ1。(4)脫氮能力馴化將步驟(3)獲得的菌懸液按照一定的接種量接入含有150mL 反硝化菌培養液的500mL搖瓶中，以紗布封口置溶解氧濃度控制為5. Omg/L的空氣振動器 中進行梯度馴化。初始培養液中總氮濃度為100mg/L。當總氮去除率達到90%以上時，取 一定量的菌懸液接種到濃度提高100mg/L的新鮮培養液中，重複操作直到培養液中總氮濃 度提高到600mg/L。培養過程中，以甲醇為碳源，碳氮質量比為15 1，溫度為25°C ;pH為7.5，馴化一定時間後即可獲得總氮去除率達到90%以上的反硝化菌。實施例二(1)富集培養從某催化劑汙水處理廠好氧曝氣池內取一定量的活性汙泥，接 入好氧反應器中，採用逐漸提高基質氨氮濃度的方式進行富集，汙水的初始氨氮濃度為 200mg/L、COD濃度為200mg/L，培養過程中當氨氮濃度低於50mg/L時，補加氨氮濃度比上 一次提高150mg/L，直到提高到1500mg/L。富集過程中溫度為30°C，pH 7.8，DO(溶解 氧)5mg · L-1左右。(2)篩選純化取一定量的泥水混合物稀釋不同的倍數後塗布於固體培養基平板 中培養，培養液中硝酸鹽氮濃度為100mg/L，還含有少量的狗2+、Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子以 及磷酸根離子等，28°C恆溫靜置培養，以丁二酸鈉為碳源，按照碳氮質量比6 1配置，以溴 百裡芬蘭做指示劑進行分離和純化。培養2-3天後，選取變藍色的單菌落再稀釋不同的倍 數後塗布於同樣的固體平板進行分離，重複上述操作直到獲得純菌株。(3)生長能力馴化從固體平板上用接菌環挑取部分菌落接入裝有一定量培養液 的反應器中培養，培養液中初始氮源濃度為150mg/L，以琥珀酸鈉、檸檬酸鈉和甲醇作為碳 源，三種碳源按照質量比10 5 1、5 3 1、1 1 1、和單純以甲醇為碳源對篩選出 的菌株進行梯度馴化。7 9天後獲得去除碳氮比為3 1 20 1的菌株。培養條件 為溫度 30°C,pH 7. 8，D0(溶解氧)3mg · L-1。(4)脫氮能力馴化將步驟(3)獲得的菌懸液按照一定的接種量接入含有150mL 反硝化菌培養液的500mL搖瓶中，以封口膜封口置溶解氧濃度低於1. 0mg/L的空氣振動器 中進行梯度馴化。初始培養液中總氮濃度為130mg/L。當總氮去除率達到90%以上時，補 加氮源使得補加後培養液中總氮濃度提高100mg/L，重複上述操作直到培養液中總氮濃度 提高到某一需要的水平。培養過程中，以甲醇為碳源，碳氮質量比為6 1，溫度為30°C，pH 為7. 8，馴化一定時間後即可獲得碳氮比低於10 1、總氮去除率達90%以上的反硝化菌。實施例三從某煉油汙水處理廠好氧曝氣池內取一定量的活性汙泥，接入溫度J8°C、pH8.0、DO :4mg · L—1的好氧反應器中進行富集，汙水的初始氨氮濃度為150mg/L、COD濃度為 300mg/L，培養過程中當氨氮濃度低於25mg/L時，補加氨氮濃度比上一次提高100mg/L，直 到提高到1200mg/L。取一定量的上述泥水混合物稀釋不同的倍數後塗布於固體培養基平板中培養，培 養液中硝酸鹽氮濃度為80mg/L，還含有少量的狗2+、Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子以及磷酸根離7子等二8°C恆溫靜置培養，以檸檬酸鈉為碳源，按照碳氮質量比12 1配置，以溴百裡芬蘭 做指示劑進行分離和純化。培養2-3天後，選取變藍色的單菌落再稀釋不同的倍數後塗布 於同樣的固體平板進行分離，重複上述操作直到獲得純菌株。從固體平板上用接菌環挑取部分菌落接入裝有一定量培養液的反應器中培養，培 養液中初始氮源濃度為150mg/L，以甲醇作為碳源，對篩選出的菌株進行梯度馴化。一定時 間後獲得去除碳氮比為3 1 15 1的菌株。培養條件溫度^°C，pH 8. 0，DO(溶解 氧 Hmg · Γ1。取一定量的菌懸液離心後棄上清液，將菌體均勻分裝到兩個500mL搖瓶中，一瓶 用總氮濃度200mg/L、C0D濃度6000mg/L的煉油汙水定容到150mL，以紗布封口置溶解氧濃 度為5. Omg/L的空氣振動器中進行脫氮和除COD，7 後總氮和COD去除率分別達到99%和 97% ；另一瓶用總氮濃度^Omg/L、COD濃度1000mg/L的煉油汙水定容到150mL，以封口膜 封口置溶解氧濃度低於1. 0mg/L的空氣振動器中進行脫氮和除C0D，48h後總氮和COD去除 率均達到99%。
權利要求
1.一種反硝化菌的篩選方法，其特徵在於包括如下過程(1)用含氨汙水對好氧活性汙泥進行富集培養；(2)從富集菌群中分離純化反硝化菌；(3)用含有目標汙染物的水對純化的反硝化菌進行生長能力馴化；(4)在不同溶解氧條件下對馴化的反硝化菌進行脫氮能力馴化。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)富集好氧脫氨氮活性汙泥採用 逐漸提高基質氨氮濃度的方式進行，培養過程培養液氨氮初始濃度為100 600mg/L，最終 氨氮濃度為700 2000mg/L，培養液COD值低於400mg/L，當氨氮初始濃度降低至為150mg/ L以下時，提高基質氨氮濃度，同時補加碳源保證培養液COD濃度不低於100mg/L，每次提 高氨氮濃度50 400mg/L ；富集培養條件為溫度20 40°C，pH 6. 0 9. 0，溶解氧大於 2mg · I71。
3.按照權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(1)好氧活性汙泥進行富集培養過 程培養液最終氨氮濃度為1000 1500mg/L，培養液COD值低於200mg/L ；富集培養條件為 pH 6. 5 8. 0，溶解氧為2 IOmg · Γ1。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)從富集菌群中分離純化反硝化 菌的方法採用平板稀釋法或平板劃線法。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(3)用含有目標汙染物的水對純化 的反硝化菌進行生長能力馴化過程如下採取逐漸降低優質碳源逐漸提高劣質碳源的方式 進行梯度馴化，從固體平板上用接菌環挑取部分菌落接入裝有培養液的反應器中培養，以 NO3--N計的初始氮源濃度為50 200mg/L，以COD計的初始碳源濃度為500 2000mg/L， 檢測培養液中氮源和碳源濃度，控制生長能力馴化過程中反應系統的碳源和氮源的質量比 為3 1 20 1，如果碳源不足補加碳源，如果碳源過剩則補加氮源，直到總氮和COD濃 度分別低於15mg/L和60mg/L時終止反應。
6.按照權利要求1或5所述的方法，其特徵在於生長能力馴化培養條件為溫度為 20 ;35°C，pH 為 6. 5 9. 8，溶解氧為 2 IOmg · I71。
7.按照權利要求1或5所述的方法，其特徵在於生長能力馴化培養條件為pH為 7. 0 8. 5，溶解氧為3 5mg · Γ1。
8.按照權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的優質碳源為琥珀酸鈉、葡萄糖、檸 檬酸鈉、乙酸鈉或乙醇；所述的劣質碳源為工業甲醇、工業廢乙醇或高濃度COD汙水。
9.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(4)脫氮能力馴化採取菌體轉接、 批次換水或者批次補料的方式，並逐漸提高氮源和碳源濃度，最終達到欲處理廢水中氮和 碳的濃度；或者直接用欲處理廢水進行脫氮能力馴化；馴化過程中，溫度為20 35°C，pH 為6. 5 9. 8，給予不同的溶解氧和COD濃度條件進行菌體馴化，獲得兩種不同的脫氮路 徑，第一種脫氮路徑控制溶解氧濃度5mg/L以上，以Ν03_-Ν計的初始培養液中氮源濃度為 50 200mg/L，以COD計的初始碳源濃度為1000 2000mg/L，菌株去除的碳源和氮源質量 比10 1以上；第二種脫氮路徑控制溶解氧濃度< 5mg/L，以Ν03_-Ν計的初始培養液中氮 源濃度為50 200mg/L，以COD計的初始碳源濃度為400 1000mg/L，菌株去除的碳源和 氮源質量比< 10 1。
10.按照權利要求9所述的方法，其特徵在於脫氮能力馴化過程的PH為7.0 8. 5，第一種脫氮路徑菌株去除的碳源和氮源質量比為10 1 20 1;第二種脫氮路徑菌株 去除的碳氮質量比為3 1至<10 1。
全文摘要
本發明公開了一種反硝化菌的篩選方法，過程包括(1)用含氨汙水對好氧活性汙泥進行富集培養；(2)從富集菌群中分離純化反硝化菌；(3)用含有目標汙染物的水對純化的反硝化菌進行生長能力馴化；(4)在不同溶解氧條件下對馴化的反硝化菌進行脫氮能力馴化。本發明方法篩選到的反硝化菌應用於汙水脫氮處理，除了能夠克服傳統生物脫氮技術存在的不足外，還能在不同的環境條件下作為生物修復劑補加到受衝擊的汙水處理系統中，快速恢復系統的處理能力，為同步硝化反硝化脫氮準備了條件。
文檔編號C02F3/34GK102041291SQ20091020428
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月21日 優先權日2009年10月21日
發明者唐似茵, 李志瑞, 高會傑, 黎元生 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院