一種水產品中主要過敏原的快速免疫磁珠層析方法

2023-08-09 23:48:06 1

專利名稱：一種水產品中主要過敏原的快速免疫磁珠層析方法
技術領域：
本發明涉及食物過敏原的檢測方法，特別是涉及一種檢測水產品中主要過敏 原的免疫磁珠層析方法，該方法主要是使用甲殼類和貝類的主要過敏原原肌球蛋白 (Tropomyosin，簡稱Tm)、魚類主要過敏原小清蛋白(Parvalbumin，簡稱Pa)的免疫磁珠層 析檢測方法。
背景技術：
食物過敏是由食物引起的機體對免疫系統的異常反應，近幾十年來，世界範圍內 食物過敏反應症患者呈現逐年上升趨勢，據WHO報導，到2010年，全球可能有40%到50% 的人患有過敏症，食物過敏現已成為一個新興的食品安全問題。食物過敏原為食物中引發 或激起過敏反應的物質，通常是在特定食物中含有的含量豐富、天然存在的蛋白質。根據過 敏原反應的速度、機制及臨床特點將致敏機制分為I型、II型、III型、IV型，其中大部分食物 過敏是由IgE介導的I型超敏反應，一般症狀包括嘔吐、腹痛、腹瀉等，也包括皮膚反應及呼 吸道症狀，嚴重情況下甚至會出現過敏性休克或死亡，目前尚無有效的治療方法。為了保 護易感者健康，部分國家和地區對食物過敏原的標籤標註進行了嚴格規定並列入了立法範 圍。魚類和甲殼類水產品及其製品是聯合國糧農組織公認的兩類易引起食物過敏的 主要致敏食物。據調查，在我國15 M歲年齡段人群中，約6%的人有過食物過敏的經 歷，在我國青少年過敏人群中對魚類等海產品過敏的約佔3-6%，位居其它致敏食物的首 位。水產品的主要過敏原可分為兩大類，一為貝類及蝦蟹等甲殼類動物中的原肌球蛋白 (Tropomyosin)，另外一種則是鱈魚等魚類中的小清蛋白(Parvalbumin)。由於食物成分的 複雜性，加之食品加工過程中使用各種配料和添加劑，傳統的化學分析很難滿足食物過敏 原的檢測要求，因此，食物過敏原的快速檢測技術研究一直是國內外科學家的研究熱點。目前，食物過敏原的檢測技術以分析全蛋白或酶解後肽段胺基酸序列的質譜技 術、檢測編碼過敏原DNA片段的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術 及分析過敏原性的免疫學檢測技術為代表。質譜技術能精確測定全蛋白或酶解後肽段的胺基酸序列，再根據相應資料庫來確 定致敏蛋白，但是質譜技術存在著費時、所用儀器昂貴、檢測費用相對較高等缺點。PCR方法則在檢測過程中易因操作不當受到汙染而產生假陽性結果，存在操作要 求技術性強、不能反映食物的真正過敏性即人們攝入該食物後會產生過敏反應等缺陷。食物過敏原的免疫學檢測技術有酶聯免疫吸附法(ELISA)、生物傳感器法和免疫 層析法。其中ELISA法是目前技術較為成熟的方法，市場上已有杏仁、大豆、花生、甲殼類、 芝麻、芥末、羽扇豆、牛奶等食物過敏原的ELISA檢測試劑盒，這些試劑盒可在30 60min 中內實現定性或半定量檢測，但是存在假陽性和假陰性反應。此外，公開號CN101285840A 專利申請公開了一種食品中過敏原的固相免疫檢測方法，採用可拆式酶標板作為檢測載 體，利用雙抗夾心模式，直接在過敏原特異性單抗上標記酶，再通過底物顯色反應來實現檢測。該方法檢測原理同ELISA法，與雙抗夾心ELISA的唯一區別是不需要使用酶標二抗。因 此雖然具有多樣本同時檢測優點，但也存在著假陰性或假陽性反應，檢測結果易於受到外 界因素的影響(如食品基質，食品的加工程度等)等缺點。生物傳感器法是根據待測物質和分子識別元件特異性結合，發生生物化學反應， 產生的生物學信息通過信號轉換器轉化為可以定量處理的電、光等信息，再經儀表放大和 輸出，從而達到分析和檢測的目的。目前，微型SI^R生物檢測器已應用於食品生產過程中花 生過敏原的檢測，該檢測器可實現在線定量檢測。但是生物傳感器法需要特定的設備和配 件，檢測成本高，對硬體設施要求極高。食品工業界需要的是快速、簡便、高效、特異性強且 成本低廉的檢測方法，上述這些方法皆無法滿足食品工業界的需求。免疫層析技術是ELISA技術原理的擴展應用，一般使用乳膠顆粒、膠體硒、膠體金 以及脂質體等作為著色標記物。在層析時，標記物與待測物之間形成的複合物可被相應的 配體所捕獲而聚集於硝化纖維膜上的檢測線並呈現出標記物所帶有的顏色，因此可以通過 纖維膜上顯色條的有無、顏色深淺和反射光線等從而實現檢測目的，具有操作簡便、快速的 優點。在目前公開的報導中，大都以膠體金作為指示劑，因此又被稱為膠體金檢測法。已公 開文獻中涉及了一種檢測水產品食物過敏的免疫膠體金層析方法，可以實現過敏原的定性 檢測，但是難以進行定量檢測，而且目視檢測使檢測結果不易記錄和保存。此外，在免疫層析檢測技術中，除了採用膠體金作為標記物外，也有採用其它標記 物作為指示劑的報導。專利號為US5753517的專利公開了一種使用乳膠顆粒作為標記物的 定量免疫層析方法和儀器。公開號CN1480391A的專利申請公開了一種在常溫下製備膠體 納米硒顆粒及其以此材料作為標記物的免疫層析檢測方法，獲得了高於膠體金方法的靈敏 度的檢測方法。公開號CN1645146A公開了一種用螢光稀土納米顆粒作為標記物的免疫層 析方法及其檢測試紙條，可用於定量的新型免疫層析檢測。近些年，以磁性納米顆粒作為標記物的免疫層析檢測報導也陸續出現。如
發明者盧瑛, 王錫昌, 石良, 鄭誠 申請人:上海海洋大學