一種天貝生產菌株及其應用的製作方法

2023-08-09 23:41:36 1

本發明涉及一種培養發酵製品的微生物，特別是涉及一種新的天貝生產菌株及利用該菌株在大豆發酵生產天貝方面的應用。

背景技術：
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天貝(Tempeh)又稱為丹貝、天培，是通過對蒸煮的大豆進一步發酵而形成的豆製品。

發酵優良的天貝，風味口感佳、營養價值高、富含高活性的異黃酮苷元、多種游離胺基酸、不飽和脂肪酸、B族維生素、生育酚和抗氧化劑超氧化物歧化酶(SOD)等營養物質；研究表明，這些物質對於防治肥胖、糖尿病、高血脂、高血壓和心腦血管病均有明顯的作用。由於天貝具備上述優點，且其製作方法簡易、生產成本低等，使其在歐美等發達國家廣泛發展並深受喜愛。

我國是大豆生產和消費大國，但是目前市場上主要是豆漿、豆腐和豆粉等大豆初加工產品，而高營養價值、高附加值的天貝產品並未實現市場化銷售。

天貝發酵過程所依賴的發酵菌株是黴菌，其中最常見的是少孢根黴菌(Rhizopous oligosporus)。但用少孢根黴菌發酵生產天貝所需時間較長，通常約需要48小時。

目前真正可用於產業化生產天貝產品的發酵菌株卻非常匱乏。因此，發現高活性的天貝發酵菌株，進行最佳發酵條件的摸索，提供優良的天貝製作工藝，得到高質量(如外觀、質地、氣味及口感風味)的天貝產品，很有意義。

技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種新的高活性天貝生產菌株。

本發明的另一個目的是提供一種利用該新菌株生產天貝產品的方法。

發明人從一種「幹豆豉」中分離到了一種真菌，經鑑定為無接合孢子根黴菌(R.azygosporus)LT0229，該菌株屬於根黴屬真菌，已於2016年3月1日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12164，以下簡述為LT0229。

LT0229的形態特徵為：

無接合孢子根黴LT0229在PDA綜合培養基上會長出白色杆狀菌體和白色菌絲體，隨後，菌絲體上長出褐色孢子囊，囊柄基部帶有匍匐枝和假根狀分枝，孢子囊壁破裂後會散 落出圓形或橢圓形的灰黑色孢子。菌體生長形態見圖1所示。

提取LT0229的基因組，以NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)為引物，擴增18S rDNA的序列，該18S rDNA序列如序列表所示。通過NCBI資料庫進行Blast序列比對，發現LT0229與無接合孢子根黴(Rhizopus azygosporus)CBS357.93的相似度最高，相似度為100％。從NCBI資料庫中選取了與LT0229相似度≧99％的前17種菌株進行了系統進化樹分析，結果如圖2所示。該結果顯示LT0229與無接合孢子根黴菌(R.azygosporus)CBS357.93的進化距離非常近，處於同一分支中，故初步鑑定LT0229為無接合孢子根黴(R.azygosporus)。

結合菌株培養特徵觀察及18S rDNA的鑑定結果，參照《根黴菌鑑定手冊》初步鑑定為無接合孢子根黴。

LT0229的培養方式為：在PDA綜合培養基上、25-30℃靜置，或者在PDB綜合培養液中25-30℃震蕩培養3-7天。

經實驗證實：LT0229生產繁殖速度快，可以在短時間內(35h)生產出天貝產品。極大地節約了生產時間和能耗。

本發明通過對各種發酵條件的摸索，如研究適宜的發酵溫度、pH和發酵時間等，得到了利用LT0229生產天貝的工藝方法，其步驟如下：

大豆原料精選→清洗→浸泡→去皮→蒸煮→加澱粉→瀝水→加白醋→接菌→裝袋→扎孔→發酵→殺菌。

所述無接合孢子根黴LT0229的接種量無特別限制，一般為105～107個孢子/mL篩選培養基。

本發明固體發酵所用的原料為精選大豆，發酵溫度為25～30℃，優選最適溫度為28～30℃。

本發明所用pH為4-5，優選pH4.5。

所述天貝製備方式為：靜置培養32～48h，優選35h。

由無接合孢子根黴LT0229發酵產生的發酵製品也屬於本專利的保護範圍，所述發酵製品可以是發酵產品本身，也可以是以發酵產品為原料的深加工產品或從發酵產品中分離提取的營養成分。

天貝製備工藝研究證實，無接合孢子根黴菌(R.azygosporus)LT0229發酵生產天貝的周期短，所得發酵製品的品質優良：大豆接種該無接合孢子根黴菌35小時後便在大豆表面和內部形成均勻白色的菌絲黏膜，所得天貝製品具有發酵醬香味，無氨味，該天貝製品可鮮食、涼拌、作為佐菜烹飪或者進一步加工成休閒食品和分離提取功能成分(圖3)。

本發明的無接合孢子根黴菌LT0229的優點如下：

1、發酵周期短，35小時即可發酵生產天貝，少於市場少孢根黴菌發酵生產天貝所需的48小時。

2、發酵所得天貝品質好，具有發酵醬香味，沒有氨臭味；少孢根黴等天貝菌株由於發酵時間較長，容易產生孢子，使得產品出現黑斑，進而影響品質。

因此，無接合孢子根黴LT0229是理想的天貝製作菌株，並具有產業化大規模生產能力，且在食品、保健品和醫藥治療等領域均具有廣闊的市場前景。

附圖說明：

圖1為無接合孢子根黴(R.azygosporus)LT0229的菌體形態的光學顯微鏡圖；

圖2為無接合孢子根黴(R.azygosporus)LT0229的系統進化樹圖；

圖3為無接合孢子根黴(R.azygosporus)LT0229對大豆進行發酵後的天貝製品形態圖。生物材料保藏信息：

名稱：無接合孢子根黴(Rhizopus azygosporus)LT0229

保藏編號：CGMCC No.12164

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏時間：2016年3月1日

保藏地點：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

具體實施方式

以下實施例僅用於舉例說明本發明的方法，並不限制本發明的範圍。

實施例1無接合孢子根黴(Rhizopus azygosporus)LT0229的分離篩選

通過對孢囊柄特徵和適宜生長的溫度範圍將天貝發酵菌株分離出來，分離樣品來自湖南株洲國強湘菜特製加工廠生產的「幹豆豉」中。取5g幹豆豉溶於20ml無菌水中，加入玻璃珠於30℃搖床振搖30min，取1ml上清液並接種至20ml PDB液體培養基中，在30℃、180rpm下，振蕩培養至有菌絲球生成，挑取菌絲球至另一盛有20ml新鮮PDB培養基的三角瓶中培養5天，取富集後的菌體做一系列的梯度稀釋，取稀釋濃度為1.0×107CFU/mL的菌液塗布PDA平板，倒置30℃恆溫培養，分離能夠旺盛生長的菌株。用接種環從PDA平板挑取少量該菌株的孢子，繼續在PDA平板上傳代培養2-3次。用接種環將得到的純菌種接種到PDA斜面培養基上培養，4℃保存備用。

實施例2無接合孢子根黴(Rhizopus azygosporus)LT0229的菌種鑑定

對純化出的菌株的表型特徵、培養特徵和18S rDNA進行系統鑑定，結果如下：

培養特徵及表型觀察：

將分離純化後的菌株接種到PDA培養基上培養，隨時觀察菌體生長狀態。在PDA培養基上培養1天便可長出白色菌絲體，隨後菌絲體上開始長出褐色孢子囊，囊柄基部帶有匍匐枝和假根狀分枝，隨後孢子囊壁開始破裂，散落出圓形或橢圓形的灰黑色孢子。菌體生長過程的形態如圖1所示。

鑑定結果：

提取LT0229的基因組，以NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)為引物，PCR擴增獲得18S rDNA序列，測序結果如序列表所示。通過NCBI資料庫進行Blast序列比對，發現LT0229與無接合孢子根黴(R.azygosporus)CBS357.93的相似度最高，相似度為100％。從NCBI資料庫中選取了與LT0229相似度≧99％的前17種菌株進行了系統進化樹分析，結果如圖2所示。該結果顯示LT0229與無接合孢子根黴菌(Rhizopus azygosporus)CBS357.93的進化距離最近，確實處於同一分支中，故初步鑑定LT0229為無接合孢子根黴(R.azygosporus)。

根據菌株培養特性、形態觀察及18S rDNA的鑑定結果，參照《根黴菌鑑定手冊》初步鑑定為無接合孢子根黴。

實施例3無接合孢子根黴(R.azygosporus)LT0229發酵生產天貝的製備工藝

1、孢子懸液製備

用接種鏟從PDA平板上刮取新鮮的無接合孢子根黴LT0229的菌絲體到20mL液體培養基，30℃培養1天，將菌絲體轉接入大瓶PDB液體培養基，30℃培養3-5天，離心收集菌體，生理鹽水或無菌水清洗三次，重懸菌體製成1.0×107CFU/mL的孢子懸液，用於固體發酵。

2、豆子預處理

2.1、浸泡：器具洗淨，用沸水燙過後放涼。取精選大豆500克，洗淨後加清水浸泡，用乳酸或者檸檬酸調節pH為4.5，浸泡約16小時，待豆子充分吸水。

2.2、去皮：將浸泡好的豆子手抓去掉豆皮，以得到脫皮的豆瓣；

2.3、水煮：將去皮的豆瓣放入清水中蒸煮15分鐘至變軟，蒸煮時間應控制得當，軟度合適的豆瓣才能保證發酵菌株的快速繁殖，但又要有足夠的強度使之在後續的加工過程中保持完整；

2.4、添加澱粉：將煮好的豆子撈出趁熱拌入20克玉米澱粉，攪拌均勻；

2.5、瀝水：將混勻的豆子倒入漏筐或帘子上瀝水；

2.6、添加白醋：將白醋加入控幹的豆子裡，攪拌均勻；

2.7、發酵過程：加入前期準備的LT0229的孢子懸液，接種量為1％，攪拌均勻後裝入5號塑封袋後置於30℃進行發酵，溼度設定在75～85％。發酵過程應注意控制好氧氣含量。嚴格厭氧條件下的黴菌生長不良，甚至不生長，而氧氣過多又會導致黴菌產生孢子影響產品感官。只有氧氣平衡時黴菌才能形成緊密的乳白色狀菌絲，並縛在豆子上形成一個堅硬的糕狀物。因此，發酵過程需要在帶有小孔的塑封袋中進行(每個小孔間隔大約1釐米)，這可以使黴菌生長良好而無孢子產生(雖然在袋子上的小孔處有時會發現微小的黑色區域)。由於薄膜的透明性，因此通過視覺觀測就可以實現對黴菌生長的控制。35小時後發酵成熟，成品見圖3所示。