用於肝細胞癌診斷的方法和組合物的製作方法

2023-07-30 23:35:51

>名稱pIMW(kd)名稱pIMW(kd)PL1無186，073PL86.4747，195PL26.20100，000PL95.2943，541PL34.7393，708PL105.2223，000PL45.1373，465PL114.4725，183PL54.9752，739PL125.5213，800PL64.10無PL157.8036，962PL74.8040，997PL168.58無在數據集中的每一個凝膠中鑑定儘可能多的這些界點特徵。根據最靠近的兩條已經分配pI值的界點，使用內插法/外推法(使用MELANIEⅡ軟體)為原版膠中所有特徵分配一個pI值；根據最靠近的兩條已經分配MW值的界點，使用內插法/外推法(使用MELANIEⅡ軟體)為原版膠中所有特徵分配一個MW值。每一個特徵使用成為其分子簇序號(MCI)的唯一數字作為標記。第二原版膠選擇硬化膠和HCC膠。使用MELANEⅡ軟體提供的運算法則(MELAMEⅡ2DPAGE(版本2.2)使用說明(Melanie集團，日內瓦，瑞士)中A節第8-10頁，對這些凝膠中的特徵與原版膠中的共同特徵進行配對。能夠配對的特徵就可以與相應的MCI聯繫起來，因而可以獲得相應的pI和MW值。這些第二原版膠中不能配對的特徵可以通過使用MelanieⅡ軟體參考界點的pI和MW，由線性內插/外推法為其分配pI和MW。然後為這些特徵分配一個MCI入口值。6.9.1圖形的構建數據集中所有的凝膠現在都和第一和第二原版膠相匹配，配對的特徵都在分子簇索引(MCI)中與相應的入口值聯繫起來。通過界點和匹配方法將多份膠排列比較，以找到平行凝膠中成對的相同點。它可以提高分析的準確度，以保證隨後的pI和MW測量的準確，因為配對的斑點顯示分離的重複性，同時可以去除人為假象。測定每一個蛋白質斑點的強度並保存。每一個蛋白質斑點被分配一個鑑定碼並與原版膠中的斑點匹配。產生了對於代表一個血清樣品的每一個平行組分析這一方面的最終結果。對於每一個鑑定斑點的數位化圖形包含1)唯一的一個給定鑑定碼；2)X，Y值；3)等電點；4)分子量；5)信號值；6)每一個前述測定的標準偏差；以及7)與該斑點匹配的原版膠上斑點的MCI的指針。藉助實驗室信息管理系統(LIMS)的能力，這種圖形可以回溯到產生該圖的實際儲存的凝膠上，因此，由計算機分析凝膠圖形資料庫所鑑定的蛋白質是可以檢索的。同時，LIMS可以允許將圖形回溯到原始樣品或患者。6.9.2樣品間的交叉配合一旦形成了圖形，分析就指向目標蛋白質的選擇。圖形中的每一個有意義的特徵都被賦予一個索引，「分子簇索引」，它能夠鑑定所有凝膠中的特徵，並且可作為前述特徵的(1)-(7)參數的指針。對於每一種樣品類型(也就是肝細胞癌血清和肝硬化血清)，可以由原版膠產生一個分子簇表。相同類型的所有其它樣品的凝膠都可以和相關的第一和第二原版膠進行匹配。然後，每一個樣品的數位化圖形通過增加(已匹配的特徵)分配給在原版膠中的特徵相應的MCI來加以注釋。6.9.3圖形的差別分析在每一個樣品組中(肝細胞癌血清或肝硬化血清)，分析圖形以鑑定和選擇在至少50％以上的圖形中存在的那些特徵。然後將這些選擇的特徵組成一個肝細胞癌血清特徵組和一個肝硬化血清特徵組。然後比較每一個特徵組中的匹配特徵，來鑑定在肝細胞癌血清和肝硬化血清間平均強度至少有2倍差異的那些特徵。不同存在的這些特徵可以鑑定為肝細胞癌診斷特徵(HF)。6.9.4HF的統計學分析對於每一個HF，使用學生t檢驗比較33例肝細胞癌患者血清圖形和19例肝硬化患者血清圖形中的HF的信號強度的分布，進行統計學分析。對於每一個HF可以得到一個P值。6.10所選蛋白質的回收與分析使用美國申請第08/980，574(此處完整引入用作參考)所述的優選技術，HF中的蛋白質可以被機械切除，並被加工形成胰蛋白酶切肽。這些肽的部分胺基酸序列可以通過質譜分析使用從頭測序加以測定。6.11結果與肝硬化血清進行比較，這些初始實驗鑑定出在肝細胞癌血清中降低的17個特徵和升高的44個特徵。這些HF的詳細資料和相應的P值列於表Ⅰ和表Ⅱ中。每一個HF在肝細胞癌血清中以不同於在非肝細胞癌血清中的方式存在(p＜0.1)。對於某些優選的HF(HF-1、HF-3、HF-10、HF-15、HF-16、HF-17、HF-18、HF-19、HF-20、HF-21、HF-23、HF-24、HF-25、HF-26、HF-28、HF-29、HF-31、HF-32、HF-33、HF-34、HF-36、HF-37、HF-38、HF-39、HF-40、HF-42、HF-44、HF-46、HF-47、HF-48、HF-49、HF-51、HF-52、HF-53、HF-54、HF-55、HF-56、HF-59和HF-60)，差異更顯著一些(p≤0.01)；對於一些高度優選的HF(HF-1、HF-17、HF-18、HF-20、HF-21、HF-23、HF-24、HF-25、HF-28、HF-29、HF-31、HF-33、HF-34、HF-36、HF-39、HF-44、HF-51、HF-52、HF-54、HF-55、HF-59和HF-60)，差異甚至更顯著一些(p≤0.001)。這些HF中不同存在的HPI的部分胺基酸序列已鑑定出。這些HPI的詳細資料列於表Ⅲ和表Ⅳ。公用資料庫的計算機檢索發現，至少有兩個HPI的部分胺基酸序列和編碼其肽序列的寡核苷酸在所檢資料庫中沒有記錄。表Ⅳ所示幾個HPI為同一蛋白質的同種型。例如HPI-2、HPI-6、HPI-8、HPI-14、HPI-15、HPI-17和HPI-18是補體因子4的同種型；HPI-4、HPI-5和HPI-12是補體因子3的同種型；HPI-19、HPI-20和HPI-21是血漿銅藍蛋白的同種型。這些同種型據信來源於翻譯後加工過程(例如糖基化、磷酸化、乙醯化和最小蛋白質水解)。本發明不局限於特定的列舉的實施方案，這些實施方案意在將發明的單一方面表述清楚。實際上，根據前面描述對本發明進行除此處所列出的以外的修改對於本領域技術人員來說是顯而易見的。這些修改都落在所附帶的權利要求書的範圍內。此處所引用的出版物都以完整形式引入用作參考。序列表110PAREKH,RajeshBhikhuPATEL,ThakorbhaiParshotambhaiTOWNSEND,RobertReidMOYSES,ChristopherJOHNSON,PhilipJOxfordGlycoSciences(UK)Ltd.120用於肝細胞癌診斷的方法和組合物130OxfordGlyco140PCT/GB99/004581411999-02-15150GB9803138.81501998-02-13150GB9803269.11511998-02-1616038170PatentInVer.2.0210121112212PRT213人4001ArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArg1510210221110212PRT213人4002ArgGlyLeuGlnAspGluAspGlyTyrArg1510210321112212PRT213人4003LysIleThrLeuLeuSerAlaLeuValGluThrArg1510210421110212PRT213人4004LysGlyTyrThrGlnG1nLeuAlaPheArg1510210521115212PRT213人4005ArgIleProIleGluAspGlySerGlyGluValValLeuSerArg15101521062119212PRT213人4006ArgThrTyrAsnValLeuAspMetLys15210721114212PRT213人4007LysAlaGluMetAlaAspGlnAlaSerAlaTrpLeuThrArg1510210821112212PRT213人4008LysHisLeuSerLeuLeuThrThrLeuSerAsnArg1510210921110212PRT213人4009ArgValGlyTyrValSerGlyTrpGlyArg15102101021115212PRT213人40010LysTyrValMetLeuProValAlaAspGlnAspGlnCysIleArg1510152101121113212PRT213人40011LysThrIleTyrThrProGlySerThrValLeuTyrArg1510210122116212PRT213人40012AlaGluThrThrAspPhe152101321110212PRT213人40013ArgGlnGlySerPheGlnGlyGlyPheArg15102101421110212PRT213人40014ArgPheAlaHisThrValValThrSerArg1510210152119212PRT213人40015ArgThrTyrAsnValLeuAspMetLys152101621114212PRT213人40016LysGlyAlaTyrProLeuSerIleGluProIleGlyValArg15102101721113212PRT213人40017LysAlaLeuTyrLeuGlnTyrThrAspGluThrPheArg1510210182117212PRT213人220223Xaa是Ile或Leu40018XaaTrpXaaGlyThrThrArg152101921113212PRT213人40019ArgGlnSerGluAspSerThrPheTyrLeuGlyGluArg15102102021121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40020athtggathggnacnacnagr212102121121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40021athtggathggnacnacncgn212102221121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40022athtggttrggnacnacnagr212102321121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40023athtggttrggnacnacncgn212102421121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40024athtggctnggnacnacnagr212102521121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40025athtggctnggnacnacncgn212102621121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40026ttrtggathggnacnacnagr212102721121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40027ttrtggathggnacnacncgn212102821121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40028ttrtggttrggnacnacnagr212102921122212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40029ttrtggttagggnacnacncgn222103021121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40030ttrtggctnggnacnacnagr212103121121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40031ttrtggctnggnacnacncgn212103221121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40032ctntggathggnacnacnagr212103321121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40033ctntggathggnacnacncgn212103421121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40034ctntggttrggnacnacnagr212103521121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40035ctntggttrggnacnacncgn212103621121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40036ctntggctnggnacnacnagr212103721121212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40037ctntggctnggnacnacncgn212103821118212DNA213人工序列220223人工序列的描述探針40038gcngaracnacngaytty18權利要求1．一種用於人類受試者中肝細胞癌的篩選、診斷或預後，或者用於監測向人類受試者施用的抗肝細胞癌藥物或治療的效果的方法，包括(a)用雙向電泳分析受試者血清或血漿樣品，以產生特徵的雙向圖譜；(b)對於強度與肝細胞癌的存在與否相關的至少兩個所選特徵，將所選特徵中的每一個特徵在樣品中的強度與在一個或多個無肝細胞癌的受試者血清或血漿中所選特徵的強度相比較，其中，樣品中所選特徵的強度表明受試者存在或不存在肝細胞癌。2．權利要求1的方法，其中所選特徵不包括甲胎蛋白(AFP)。3．權利要求l的方法，其中甲胎蛋白(AFP)是一個所選特徵。4．一種用於人類受試者中肝細胞癌的篩選、診斷或預後，或者用於監測向人類受試者施用的抗肝細胞癌藥物或治療的效果的方法，包括(a)用雙向電泳分析受試者血清或血漿樣品，根據等電點和電泳遷移率分離多種蛋白質；(b)定量檢測至少一種下列肝細胞癌診斷特徵(HF)HF-1，HF-2，HF-3，HF-4，HF-5，HF-6，HF-7，HF-8，HF-9，HF-10，HF-11，HF-12，HF-13，HF-14，HF-15，HF-16，HF-17，HF-18，HF-19，HF-20，HF-21，HF-22，HF-23，HF-24，HF-25，HF-26，HF-27，HF-28，HF-29，HF-30，HF-31，HF-32，HF-33，HF-34，HF-35，HF-36，HF-37，HF-38，HF-39，HF-40，HF-41，HF-42，HF-43，HF-44，HF-45，HF-46，HF-47，HF-48，HF-49，HF-50，HF-51，HF-52，HF-53，HF-54，HF-55和HF-56。5．權利要求4的方法，其中(b)步驟包括定量檢測至少一種下列HFHF-17，HF-18，HF-20，HF-21，HF-23，HF-24，HF-25，HF-28，HF-29，HF-31，HF-33，HF-34，HF-36，HF-39，HF-44，HF-51，HF-52，HF-54和HF-55。6．權利要求5的方法，其中(b)步驟包括定量檢測至少一種下列HFHF-17，HF-18，HF-20，HF-23，HF-24，HF-25，HF-29，HF-33，HF-34，HF-39，HF-44和HF-55。7．權利要求4、5或6的方法，其中(a)步驟包括等電聚焦後十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。8．一種用於人類受試者中肝細胞癌的篩選、診斷或預後，或用於監測向人類受試者施用的抗肝細胞癌藥物或治療的效果的方法，包括(a)在受試者血清或血漿樣品中，定量檢測至少一種下列肝細胞癌診斷蛋白質同種型(HPI)HPI-1，HPI-2，HPI-3，HPI-4，HPI-5，HPI-6，HPI-8，HPI-9，HPI-10，HPI-11，HPI-12，HPI-13，HPI-14，HPI-15，HPI-16，HPI-17，HPI-18，HPI-19，HPI-20，HPI-21和HPI-22。9．權利要求8的方法，其中定量檢測的步驟包括檢測至少一個樣品等份，所述檢測步驟包括(a)將針對預選HPI的免疫特異性抗體與樣品等份接觸；且(b)檢測是否樣品等份中至少一種成分與抗體之間發生結合。10．權利要求9的方法，其中抗體為單克隆抗體。11．權利要求9的方法，其中定量檢測步驟包括用多重抗體檢測多個樣品等份。12．權利要求11的方法，其中抗體為單克隆抗體。13．一種包括下列已分離的肝細胞癌診斷蛋白質同種型(HPI)之一的製品HPI-1，HPI-2，HPI-3，HPI-4，HPI-5，HPI-6，HPI-8，HPI-9，HPI-10，HPI-11，HPI-12，HPI-13，HPI-14，HPI-15，HPI-16，HPI-17，HPI-18，HPI-19，HPI-20，HPI-21和HPI-22。14．一種包含權利要求13的製品的試劑盒。15．一種包含多種權利要求13的製品的試劑盒。16．一種包含已分離的人類蛋白質的製品，所述蛋白質包含具有AETTDF序列的肽。17．權利要求16的製品，其中蛋白質的等電點(pI)約為7.44，表觀分子量(MW)約為63，882。18．權利要求17的製品，其中pI在7.44的10％變動範圍以內，分子量在63，882的10％變動範圍以內。19．權利要求18的製品，其中pI在7.44的5％變動範圍以內，MW在63，882的5％變動範圍以內。20．權利要求19的製品，其中pI在7.44的l％變動範圍以內，MW在63，882的1％變動範圍以內。21．一種包含已分離的人類蛋白質的製品，所述蛋白質包含帶有下列序列中的一個的肽IWIGTTR、IWLGTTR、LWIGTTR或LWLGTTR。22．權利要求21的製品，其中蛋白質的等電點(pI)約為5.29，表觀分子量(MW)約為43，541。23．權利要求22的製品，其中pI在5.29的10％變動範圍以內，MW在43，541的10％變動範圍以內。24．權利要求23的製品，其中pI在5.29的5％變動範圍以內，MW在43，541的5％變動範圍以內。25．權利要求24的製品，其中pI在5.29的1％變動範圍以內，MW在43，541的1％變動範圍以內。26．一種能夠免疫特異性結合下列肝細胞癌診斷蛋白質同種型(HPI)中的一種的抗體HPI-1、HPI-2、HPI-3、HPI-4、HPI-5、HPI-6、HPI-8、HPI-9、HPI-10、HPI-11、HPI-12、HPI-13、HPI-14，HPI-15、HPI-16、HPI-17、HPI-18、HPI-19、HPI-20、HPI-21和HPI-22。27．一種包含權利要求26的抗體的試劑盒。28．一種包含多種權利要求26的抗體的試劑盒。29．權利要求4定義的一個或多個HF在人類受試者中的肝細胞癌之篩選、診斷或預後中的用途，或用於監測抗肝細胞癌藥物的作用中的用途。30．權利要求8定義的一個或多個HPI在人類受試者中的肝細胞癌之篩選、診斷或預後中的用途，或用於監測抗肝細胞癌藥物的作用中的用途。31．權利要求16-25中任一項定義的蛋白質在人類受試者中的肝細胞癌之篩選、診斷或預後中的用途，或用於監測抗肝細胞癌藥物的作用中的用途。32．免疫特異性針對權利要求8定義的一個或多個HPI的一種或多種抗體在人類受試者中的肝細胞癌之篩選、診斷或預後中的用途，或用於監測抗肝細胞癌藥物的作用中的用途。33．權利要求32的用途，其中一種或多種抗體如權利要求26所定義。34．權利要求29-33中任一項的用途，其用於與針對B型肝炎和/或C型肝炎的分析或評估聯合應用。全文摘要本發明提供了用於肝細胞癌篩選、診斷、預後、和用於監測肝細胞癌治療效果和藥物開發的方法和組合物。描述了可以使用雙向電泳分析血清或血漿來測定的肝細胞癌診斷特徵(HF)。本發明進一步提供了在血清或血漿中可檢出的肝細胞癌診斷蛋白質同種型(HPI)、包含已分離的HPI的製劑、針對HPI的免疫特異性抗體,以及包含前述的試劑盒。文檔編號G01N33/15GK1295668SQ99804506公開日2001年5月16日申請日期1999年2月15日優先權日1998年2月13日發明者R·B·帕爾克,T·P·帕特爾,R·R·唐森德,C·莫伊賽斯,P·J·詹森申請人:牛津糖科學(英國)有限公司