軍曹魚MHC-Ⅱβ基因序列的製作方法

2023-07-31 10:40:06

專利名稱：軍曹魚MHC-Ⅱβ基因序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種蛋白編碼序列，尤其是涉及一種軍曹魚MHC-Iie基因序列。
背景技術：
MHC (major histocompatibility complex)即主要組織相容性複合體，是指染色體上由一系列緊密連鎖的基因位點所組成的具有高度多態性的複合遺傳系統或區域。是由MHC編碼的一類細胞表面轉膜蛋白，能結合併呈遞內源抗原和外源抗原給T淋巴細胞。根據化學結構和功能的不同，MHC可分為MHC I類分子和MHC II類分子。其中，II類MHC分子呈遞的抗原多是細胞外源性多肽，它在內質網內由a 、P和輔助分子Y鏈組裝成完整三聚體，蛋白酶水解Y鏈，抗原多肽與II類MHC分子結合，形成穩定的II類MHC-多肽複合體，再運至細胞表面，外源性抗原在線粒體或溶酶體中與MHC II類分子結合後呈遞給協助T淋巴細胞(Th，CD4+)，從而觸發免疫反應。魚類MHC II類分子是由a鏈和P鏈以非共價鍵的形式組成一個異二聚體。 MHC廣泛參與免疫應答的誘導與調節，激發機體特異性免疫反應，在免疫學上具有極為重要的意義。由於MHC具有多態性、與疾病的相關性以及連鎖不平衡性的特點，因此，了解魚類MHC基因的結構與功能，尋找與疾病相關聯的易感基因或疾病抵抗基因，對預防疾病具有很高的價值。此外，由於MHC的高度多態性，故可用於種群遺傳學研究，並作為種群分子進化的標記之一。再者，MHC具有的多態性、與疾病的關聯及其連鎖不平衡等特點可以用來選育抗病品系。

發明內容
本發明的目的是提供一種軍曹魚腿C-II |3基因序列。 本發明通過以近源物種腿C-Iie基因的CDS序列的保守區設計的兼併引物，並用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到軍曹魚MHC-II P鏈基因的全表達序列；通過對MHC-II P基因設計有效地鑑定引物，從而可以通過半定量來分析該基因的組織分布情況，並運用螢光定量PCR對經LPS剌激後的脾臟中的MHCIie的表達量進行了分析。具體DNA核苷酸及相應的胺基酸序列如下 agagctctcaactcaccatcatggcttcatccttcgtctgcctctgcctcgtcttcatcg
〈 Leader peptide MASSFVCLCLVFI ctgcctecacagcagatggattcatgaatttcgcggtgggtcgctgtgacttteactcct
X P 1 domain AAYT^DGFMNFAVGRCDFNS ctgatccteaagacatcgagtecattcagtcttettettecaacgaactggagttcatca SDPKDIEYIQSYYYNELEFI ggttc3gC3gC3gtgtgggg皿gtttgttgg3tec3C3g3gcttgg3gtg皿g皿cgC3g
憶
60
13120
33180
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RFSSSVGKFVGYTELGVKNA 73 皿cgctgg皿c皿3ggtcc3g3gttggttc3g3tg皿gggtg3g皿gg3C3g3tectgtg 300 ERWNKGPELVQMKGEKDRYC 93 tcaggaccgtgggactegactecacagctettctgacteagtcagtcgaaccctcggtca 360
X domain VRTVGLDYTAILTKSYEPSV 113 ggctgcactcgaccacgccccctetgggcaaacacccggccatgctggtctgcagcgtct 420 RLHSTTPPMGKHPAMLVCSV 133 acgacttcteccccaaatecatcagggtgagttggtgccgagatggacaggaagtggcct 480 YDFYPKYIRVSWCRDGQEVA 153 ctgatgtcagctccactgaggagctggctgacggcgactggtecteccagatccactctc 540 SDVSSTEELADGDWYYQIHS 173 acctggagtecacgcccaggtctggagagaagatctcctgtgtggtggagcacgccagcc 600 HLEYTPRSGEKISCVVEHAS 193 tgaaagaacctctggttettgactgggatccgtccatgcctgagtcagagagaaacaaaa 660
〉〈 CP/TM/CYT regi on LKEPLVIDW2PSMPESERNK 213 ttgccattggagcttcaggactgatcctgggtctgatcttetctctggctggattcatct 720 IAIGASGLILGLILSLAGFI 233 actecaagaggaaggcccgaggaaggatcctggttcccacteactgagccaggtcctgte 780 YYKRKARGRILVPTN* 248 tgctggacctggacctggacctggacctgcttctcagatggaagaaaatcagctgctgct 840 tteaactgcttcttgtttctcagtgctgccacttgttggaccagctgaacacctcagtct 900 ggtccaggactggrtctgacagtctgctggtcteaacctggtycatgaggtcacaggagt 960 cttgatcgggactctgacagtcctggaccaggttteatgtggactcacgtgtetcagctg 1020 gatctggactctgctgctttectgtgtgaatcaaaaccagatcagggctctggtgtcaaa 1080 tccttcatgatccagatgttttctecgctgtcatgt attta caateaaaaccaccagaaa 1140 c t c t g皿皿皿皿皿皿皿皿 1161 本發明的優點本基因的獲得不僅為研究魚類MHC-II |3類分子的作用機理以及MHC-II 13基因多態性與魚體抗病力的關係奠定基礎，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為進一步研究MHC-Iie的免疫學功能奠定了基礎提供理論基礎。本基因為魚類種群遺傳學及進化遺傳學研究提供材料，可用於種群遺傳學研究，並作為種群分子進化的標記之一。同時可以進行抗病相關性及抗病輔助育種的研究。


圖i是本發明在軍曹魚正常組織中的分布；
A.正常軍曹魚組織的腿CIie基因的組織表達
B. e-actin 1.頭腎；2.皮膚；3.脾；4.腸；5.鰓；6.腦；7.心
圖2是本發明經LPS剌激後軍曹魚脾臟組織中的MHC-II P基因隨時間的表達變化圖。
具體實施例方式
1.總RNA的提取 取健康的軍曹魚(體重約1000g)在養殖桶中養殖3日後，腹腔注射1ml的鯊魚弧菌(JT2)。剌激192h後，解剖魚體取出脾臟約250mg，放入-8(TC冰箱備用。取備用組織約lOOmg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol (美國invitrogen公司)進行勻漿，按照試劑盒說明提取總RNA。 2. cDNA第一鏈的合成 取軍曹魚總RNA5iig與反轉錄引物(oligodT接頭引物)1 (1Opmol/L)混合，65。C加熱5min後，立即放置冰上靜置2min，然後加入5Xbuffer， 10mmol/LdNTP混合液，Ribo皿clease Inhibitor, M-MLV反轉錄酶，反應體系為20 ii 1 。反應程序為37°C 、60min，最後放入-S(TC保存備用。
3.引物設計依據，引物合成的方法 從GenBank中下載近源物種(如人、鼠、虹鱒等)MHCII-e同源基因CDS序列，利用Clustal W軟體進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼併引物，擴增片段大小約為460bp。引物設計後提交英駿生物工程技術服務有限公司進行DNA合成。
4.對軍曹魚MHC-II P基因cDNA全序列的克隆 以近源物種MHC-II 13基因CDS序列的保守區設計的兼併引物，擴增片段大小約為460bp。 以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼併引物進行PCR擴增，所擴增的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然後將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌TOP 10感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經簡併引物PCR檢測後，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。
根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物，利用cDNA末端快速擴增技術(R即id Amplification of cDNA ends,RACE)對目的基因的3'和5'末端進行PCR擴增。
在3' RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側引物和接頭引物進行PCR反應，所得產物利用內側和接頭引物再進行PCR擴增。 在5' RACE中，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly (C)尾後，以加尾後的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和OligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產物再利用內側引物和OligodG進行第二次PCR擴增。 所得到的PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化後，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌TOP 10感受態細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼併引物擴增所得的序列利用DNAStar軟體進行拼接。 5.對軍曹魚MHC-II |3基因的測定 所得到的PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化後，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌T0P IO感受態細胞，挑取陽性克隆。測序結果用BLAST軟體進行同源性測定，來確定為軍曹魚MHC-II P基因同源序列。
6、MHC-Iie基因在不同組織中的RT-PCR分析 用引物肌動蛋白F和肌動蛋白R擴增P-actin為內參照，取健康的軍曹魚(185g) 心臟、脾臟、鰓、頭腎、皮膚、心和腦等組織，設計特異性引物(J2BF， J2BR)對MHC-IIP的 cDNA進行特異性擴增。用13 -actin基因作為內參照(引物分別為P -ActinF， P -ActinR)， 擴增500bp左右的片段，調整各樣品模板濃度。PCR反應參數為94t:預變性5min，然後 94t:變性50S，58t:退火50S，72t:延伸50S，共35個循環，然後72。C延伸10min。 PCR產物 用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測。如圖l所示，在正常大菱鮃組織中MHC-Iie基因 均擴增出約165bp的片段，其中較強的表達於鰓、脾、頭腎、小腸中，中等程度表達於皮膚， 在心、腦中表達較弱。 7 、 RT-PCR檢測MHC-II P mRNA的表達情況 提取經LPS剌激的不同時間點的脾臟組織RNA，利用合成的cDNA —鏈為模板進行 RT-PCR( P -ActinF2， P -ActinR2， J2BF， J2BR)，檢測LPS剌激後的脾臟中表達調控規律。設 計|3 -actin引物(13 -ActinF2， P -ActinR2)。利用2—A ACT法計算相對表達量，如圖2所示， 經LPS剌激後MHC-II 13基因表達呈現下降的趨勢，並且在96小時後逐漸恢復到正常水平。 除96小時外，其餘都具有顯著性差異。
序列表 〈110〉中國水產科學研究院南海水產研究所 〈120〉軍曹魚MHC-II P基因序列 〈160>2 〈210>1 〈211>1161 〈212>RNA 〈213>軍曹魚(Rachycent皿canadium) 〈220〉 〈221>3， UTP 〈222〉 (768) . . (1161) 〈220〉 〈221>5， UTR 〈222〉 (1) . (20) 〈220〉 〈221>CDS 〈222>(21). . (767) 〈220〉 〈221>PolyA site 〈222〉 (1146) . (1161) 〈400〉 1 agagctctcaactcaccatcatggcttcatccttcgtctgcctctgcctcgtcttcatcg 60
〈 Leader peptide




































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X PI domain AAYT^DGFMNFAVGRCDFNS ctgatccteaagacatcgagtecattcagtcttettettecaacgaactggagttcatca SDPKDIEYIQSYYYNELEFI ggttcagcagcagtgtggggaagtttgttggatecacagagcttggagtgaagaacgcag RFSSSVGKFVGYTELGVKNA aacgctggaacaaaggtccagagttggttcagatgaagggtgagaaggacagatectgtg ERWNKGPELVQMKGEKDRYC tcaggaccgtgggactegactecacagctettctgacteagtcagtcgaaccctcggtca
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X CP/TM/CYT region
LKEPLVIDWHPSMPESERNK ttgccattggagcttcaggactgatcctgggtctgatcttetctctggctggattcatct IAIGASGLILGLILSLAGFI 3ctec朋g3gg朋ggcccg3gg朋gg3tcctggttccc3cteactg3gcc3ggtcctgte YYKRKARGRILVPTN承 tgctggacctggacctggacctggacctgcttctcagatggaagaaaatcagctgctgct tteaactgcttcttgtttctcagtgctgccacttgttggaccagctgaacacctcagtct ggtccaggactggrtctgacagtctgctggtcteaacctggtycatgaggtcacaggagt cttgatcgggactctgacagtcctggaccaggttteatgtggactcacgtgtetcagctg gatctggactctgctgctttectgtgtgaatcaaaaccagatcagggctctggtgtcaaa
tccttcatgatccagatgttttctacgctgtcatgt .attta' caataaaaaccaccagaaa
〈210>2
〈211>248
〈212>PRT
〈213>軍曹魚(Rachycentron canadium)
7
13 120
33 180
53 240
73 300
93 360
113 420 133
■ 153 540 173 600 193 660
213 720 233 780 248 840
■ 960
1020 1080
1140
〈400>2 GRILVPTN 248
權利要求
一種軍曹魚MHC-IIβ基因序列，其特徵在於它的DNA核苷酸及相應的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
全文摘要
本發明公開了一種軍曹魚MHC-IIβ基因序列，它的DNA核苷酸及相應的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本基因的獲得不僅為研究魚類MHC-IIβ類分子的作用機理以及MHC-IIβ基因多態性與魚體抗病力的關係奠定基礎，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為進一步研究MHC-IIβ的免疫學功能奠定了基礎提供理論基礎。
文檔編號C07K14/74GK101709302SQ20091021368
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月10日 優先權日2009年12月10日
發明者侯月娥, 馮娟, 徐力文, 王江勇, 蘇友祿, 茅莉娜, 郭志勳 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所