同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的試劑盒及檢測方法

2023-07-31 10:16:36

同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒和同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法。該同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒包括有分別特異性擴增呼吸道合胞病毒基因、腺病毒基因、人博卡病毒基因的如SEQ?ID?NO：1、2、4、5、7、8引物基因序列，用於檢測呼吸道合胞病毒基因、腺病毒基因、人博卡病毒基因的如SEQ?ID?NO：1、6、9的分子信標探針。本發明同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒採用能同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒，且檢測周期短，效率高。另外，還能保證兩兩螢光信號之間無相互幹擾，其靈敏度高。
【專利說明】同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的試劑盒 及檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於衛生防預病毒檢測【技術領域】，具體的涉及一種同時檢測呼吸道合胞病 毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒及檢測方法。

【背景技術】
[0002] 急性呼吸道感染（Acute respiratory tract infactions，ARTIs)是世界範圍內 影響兒童健康的主要問題，是導致小於5歲兒童死亡的第二大病因。引起呼吸道感染的病 原體主要包括病毒、細菌、支原體和衣原體。病毒是導致呼吸道感染的重要病原體。引起 呼吸道感染症狀的病毒主要包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒、腺病毒。 至2001年之後，又相繼研究發現，人偏肺病毒（Human metapneumovirus，HMPV) (Van den Hoogen et al，2001)、人冠狀病毒 NL63 (van der Hoek 兒童 al，2005)、HKU1 (Woo et al，2005)、 人博卡病毒 HB〇V (A1 lander et al，2005)。
[0003] 腺病毒（HAV)是一種沒有包膜的DNA病毒，基因組長約25-45kb，理論上可編碼 22-40個基因。HAV引起的症狀一般表現為呼吸道感染、眼部感染、胃腸炎、兒童出血性膀胱 炎、女性宮頸炎和男性尿道炎等。HAV主要在冬春季節流行。
[0004] 呼吸道合胞病毒HRSV是屬於副粘病毒科，主要有A和B兩個亞型。在分子生物學 診斷技術出現之後，HRSV在成人獲得性下呼吸道感染髮揮的重要作用才被發現。在呼吸道 疾病感染的病原體中，最常見的是人呼吸道合胞病毒HRSV尤其在患有細支氣管疾病的患 兒中，70%是由HRSV引起的。在患有慢性阻塞性肺炎的患者中，HRSV -般會使這些病患的 症狀加重。
[0005] 隨著分子生物學檢測方法的改進，HB0V在呼吸道感染樣本中才被發現，即2005年 8月，瑞典科學家Allander運用分子生物學技術，首次在兒童呼吸道分泌物中發現。目前 人博卡病毒的感染在亞洲、歐洲、北美洲、非洲和大洋洲等18個國家和地區都有發現。人博 卡病毒是一種無包膜、單鏈DNA病毒，基因組DNA長度大約為5299nt。人博卡病毒主要的 感染人群是兒童。據統計，在患有急性呼吸道疾病的兒童中，3-19%是由HB0V造成的，但是 目前HB0V的病理學特點還不是很清楚，因為在HB0V的陽性樣本中，一般有其它病原體的存 在。人博卡病毒會使嬰幼兒感染肺炎、支氣管炎和支氣管肺炎等疾病，臨床症狀上表現為咳 嗽、發熱、喘息和腹瀉等，高發人群為6個月至3歲的嬰幼兒，高發季節為秋冬季。2012年9 月份在深圳口岸連續發現了四個人感染博卡病毒病例。人博卡病毒在受感染的兒童呼吸道 中普遍存在，但是研究者還在血清、糞便以及尿液的標本中也檢測到了人博卡病毒，推測該 病毒可能與胃腸道疾病相關。
[0006] 呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒是兒童呼吸道感染的常見病原體，對其檢 測的常規方法包括：細胞培養和直接螢光抗體實驗、固相免疫測定，其中細胞培養和直接熒 光抗體實驗的靈敏度低，並且費時費力。固相免疫測定價格低廉迅速，但是它只限於單病毒 感染的樣本，靈敏度和特異性較低。免疫學檢測方法只限於對一些病毒某個亞型的檢測，例 如腺病毒、腸道病毒和鼻病毒。傳統的PCR和實時PCR與上述檢測相比，靈敏度和特異性顯 著提高，但是該方法只能檢測單一的病毒感染，對於多種病毒的檢測顯得過程繁瑣，成本較 商。
[0007] 越來越多的研究和實驗證實，引起呼吸道感染症狀的病原體往往是由多種病原體 共同感染，混合感染引起的症狀往往顯著嚴重於單一病原體感染，特別是死亡或者超死亡 病例都是由多種病原體混合感染的結果。傳統的檢測方法，一般情況下獲得結果周期較長， 需要數周甚至數月；而且每次實驗只能鑑定一種病原體，不能滿足快速應急的病原診斷， 不利於即時採取措施控制傳播，所以必須將高通量快速檢測技術應用於呼吸道病原體的檢 測，以便為治療疾病、控制疫情為政府決策提供可靠的依據。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的在於克服現有技術的上述不足，提供一種能同時檢測呼吸道合胞病 毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒及其同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方 法。旨在解決現有檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法存在的效率低，周期 長，成本高的技術問題。
[0009] 為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：
[0010] 一種同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒，所述試劑盒包括：
[0011] 特異性擴增呼吸道合胞病毒基因的引物和用於檢測呼吸道合胞病毒基因的分子 信標探針，所述引物鹼基序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；所述分子信標探針鹼基 序列如SEQ ID N0 :3所示；
[0012] 特異性擴增腺病毒基因的引物和用於檢測腺病毒基因的分子信標探針，所述引物 鹼基序列如SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示；所述分子信標探針鹼基序列如SEQ ID N0 :6 所示；
[0013] 特異性擴增人博卡病毒基因的引物和用於檢測人博卡病毒基因的分子信標探針， 所述引物鹼基序列如SEQ ID N0 :7和SEQ ID N0 :8所示；所述分子信標探針鹼基序列如SEQ ID N0 :9 所示。
[0014] 以及，一種同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法，包括如下步 驟：
[0015] 提取待測樣本RNA;
[0016] 以所述提取待測樣本RNA為模板，採用如權利要求1-5任一所述的同時檢測呼吸 道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒進行RT-PCR處理後收集螢光數據；
[0017] 將螢光信號檢測結果與陽性對照組比較判斷。
[0018] 本發明與現有技術相比，具有以下優異技術效果：
[0019] 上述同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒以及同時檢測呼 吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法採用祀序列富集多重PCR (Target enriched multiplex PCR, Tem-PCR)技術原理，採用相同標籤輔助無二聚體（Homo-Tag Assisted Non-Dimer，HAND)和多色組合探針編碼技術（Multicolor Combination Probe Coding, MCPC)實現單管對呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒三種病原體進行同時檢測。
[0020] 因此，上述同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒採用上述 Tem-PCR技術原理和採用HAND和多色組合探針編碼技術設計呼吸道合胞病毒、腺病毒和人 博卡病毒基因引物和探針的設計，使得該試劑盒能同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人 博卡病毒，且檢測周期短，效率高。另外，還能保證兩兩螢光信號之間無相互幹擾，其靈敏度 商。
[0021] 上述同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒方法採用上述Tem-PCR技術 原理和採用HAND和多色組合探針編碼技術，有效克服了目前所有螢光PCR儀檢測信號通道 的同時，大大提高了檢測效率和檢測質量，彌補了目前應急應對預防和控制呼吸道合胞病 毒、腺病毒和人博卡病毒感染症候病因學確認等領域存在的缺陷和不足，具有重要的實用 價值和現實推廣意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是本發明實施例2中陽性對照腺病毒HAV的擴增曲線；
[0023] 圖2是本發明實施例2中陽性對照腺病毒HAV擴增製得的標準曲線；
[0024] 圖3是本發明實施例2中陽性對照呼吸道合胞病毒HRSV的擴增曲線；
[0025] 圖4是本發明實施例2中陽性對照呼吸道合胞病毒HRSV擴增製得的標準曲線；
[0026] 圖5是本發明實施例2中陽性對照人博卡病毒HB0V的擴增曲線；
[0027] 圖6是本發明實施例2中陽性對照人博卡病毒HB0V擴增製得的標準曲線；
[0028] 圖7是本發明實施例3中待測樣的擴增製得的曲線。

【具體實施方式】
[0029] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不 用於限定本發明。
[0030] 本發明實施例提供了一種效率高、靈敏度高的能同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病 毒和人博卡病毒試劑盒。該試劑盒包括RT-PCR處理的常規必要的酶、反應液等組分。其還 包括如下必要的引物和探針：
[0031] 1.特異性擴增呼吸道合胞病毒基因的正向引物P1和反向引物P2,該正向引物P1 的喊基序列如SEQ ID N0 :1所不；該反向引物P2的喊基序列如SEQID N0 :2所不。
[0032] 2.用於檢測呼吸道合胞病毒基因的分子信標探針T1，該分子信標探針T1的鹼基 序列如SEQ ID N0 :3所示；
[0033] 3.特異性擴增腺病毒基因的正向引物P3和反向引物P4,該正向引物P3的鹼基序 列如SEQ ID N0 :4所示；該反向引物P4的鹼基序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0034] 4.用於檢測腺病毒基因的分子信標探針T2,該分子信標探針T2的鹼基序列如SEQ ID N0 :6 所示；
[0035] 5.特異性擴增人博卡病毒基因的正向引物P5和反向引物P6,該正向引物P5的鹼 基序列如SEQ ID N0 :7所不；該反向引物P6的喊基序列如SEQ ID N0 :8所不。
[0036] 6.用於檢測腺病毒基因的分子信標探針T3,該分子信標探針T2的鹼基序列如SEQ ID N0 :9 所示。
[0037] 上述各引物和分子信標探針的鹼基序列如下表1所示：
[0038] 表1引物與探針列
[0039]

【權利要求】
1. 一種同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒，其特徵在於：所述試 劑盒包括： 特異性擴增呼吸道合胞病毒基因的引物和用於檢測呼吸道合胞病毒基因的分子信標 探針，所述引物喊基序列如SEQ ID NO : 1和SEQ ID NO :2所不；所述分子彳目標探針喊基序列 如 SEQ ID NO :3 所示； 特異性擴增腺病毒基因的引物和用於檢測腺病毒基因的分子信標探針，所述引物鹼基 序列如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示；所述分子信標探針鹼基序列如SEQ ID NO :6所示； 特異性擴增人博卡病毒基因的引物和用於檢測人博卡病毒基因的分子信標探針，所述 引物喊基序列如SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所不；所述分子彳目標探針喊基序列如SEQ ID NO :9所示。
2. 根據權利要求1所述的同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒， 其特徵在於：用於檢測呼吸道合胞病毒基因的分子信標探針的5'端連接有標記螢光基團 R0X。
3. 根據權利要求1所述的同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒，其 特徵在於：用於檢測腺病毒基因的分子信標探針的5'端連接有標記螢光基團HEX。
4. 根據權利要求1所述的同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒，其 特徵在於：用於檢測人博卡病毒基因的分子信標探針的5'端連接有標記螢光基團FAM。
5. 根據權利要求1-4任一所述的同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑 盒，其特徵在於：還包括呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的陽性對照物。
6. 根據權利要求5所述的同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒，其 特徵在於：所述陽性對照物分別為連有所述呼吸道合胞病毒基因片段的大腸桿菌、連有所 述腺病毒基因片段的大腸桿菌、連有所述人博卡病毒基因片段的大腸桿菌。
7. -種同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法，包括如下步驟： 提取待測樣本RNA ; 以所述提取待測樣本RNA為模板，採用如權利要求1-6任一所述的同時檢測呼吸道合 胞病毒、腺病毒和人博卡病毒試劑盒進行RT-PCR處理後收集螢光數據； 將螢光信號檢測結果與對照組比較判斷。
8. 根據權利要求7所述的同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法，其 特徵在於：所述RT-PCR處理的反應體系包括： ? χ buffer 25 μ? RNA模板 5 μ? SEQ ID NO: 1 0.4 μΜ SEQ IDNC): 2 0,4 μΜ SEQ ID NO: 4 0.4 μΜ SEQ ID NO: 5 0.4 μΜ SEQ ID NO: 7 0.4 μΜ SEQ ID NO: 8 0.4 μΜ SEQ ID NO: 3 0.2 μΜ SEQ ID NO: 6 0.2 μΜ SEQ ID NO; 7 0.2 μΜ〇
9.根據權利要求7或8所述的同時檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法， 其特徵在於：所述RT-PCR處理的反應條件為：42°C、10min ; 95〇C>10s ； 95°C、5s，60°C、lmin，共 40 個循環； 在60°C退火階段收集FAM、HEX和R0X螢光數據。
【文檔編號】C12Q1/70GK104059995SQ201410248109
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】房師松, 張然, 張仁利 申請人:深圳市疾病預防控制中心