一株多環芳烴降解菌s8-t8-L9及其應用的製作方法
2023-07-31 10:17:51 1
一株多環芳烴降解菌s8-t8-L9及其應用的製作方法
【專利摘要】一株多環芳烴降解菌s8-t8-L9及其應用，涉及環境汙染物生物處理。所述一株多環芳烴降解菌(Bacillus?sp.)s8-t8-L9，登記入冊編號為CGMCC?No.9032。可在降解各種有機化合物中應用。所述有機化合物為多環芳烴類化合物，所述多環芳烴類化合物包括但不限於萘，菲，芘等化合物。該菌含有與多環芳烴相關的基因。這些基因在該菌降解多環芳烴時發揮重要作用。該菌能夠利用混合PAHs，萘，菲，芘等多環芳烴以及柴油作為唯一能源和碳源生長繁殖，該菌20天能將無機鹽培養基中的混合PAHs，萘，菲，芘，柴油降解57.94％，58.46％，52.14％，23.14％，47.54％。
【專利說明】—株多環芳烴降解菌s8-t8-L9及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境汙染物生物處理，尤其是涉及一株多環芳烴降解菌S8-t8-L9及其應用。
【背景技術】
[0002]多環芳經(polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs)是分子中含有兩個以上苯環的碳氫化合物，包括萘、蒽、菲、芘和苯並芘等在內的150餘種。它們化學結構十分穩定，不易揮發(蒸氣壓:0.0015Χ10-9 ~0.0051mm Hg, 25°C)，難溶於水(0.00014 ~2.lmg/L, 25。。)，溶沸點高(>100 °C ) (Sato H, Aoki Y.Mutagenesis by environmental pollutants andbio-monitoring of environmental mutagens [J].Curr Drug Metab.2002, 3(3): 311-319 ；Phillips DH.Fifty years of benzo (a)pyrene[J].Nature.1983, 303(5917):468-472 ；Sternberg SS.The carcinogenesis, mutagenesis and teratogenesis of insecticides.Review of studies in animals and man[J].Pharmacology&Therapeutics.1979, 6(I):147-166.)。高環多環芳烴(四個環以上)具有「三致」用，即:「致畸」、「致癌」和「致突變」作用。美國環境保護局列出地優先治理汙染物黑名單中就包括16種PAHs，其中7種是可能的致癌物質，而苯並花是第一個被發現的環境化學致癌物(Autrup H, Harris CC, Trump BF etal.Metabolism of benzo (a) pyrene and identification of the major benzo (a) pyrene-DNAadducts in cultured human colon [J].Cancer Res.1978, 38 (IlPtl): 3689-3696.)。
[0003]海洋中PAHs的主要行為有揮發、與沉積物互作和生物積累。揮發過程取決於PAHs的蒸氣壓和溶解度等特徵，蒸氣壓越低揮發率越低，發生揮發作用的PAHs主要是兩環的，四環以上的PAHs的揮發作用是很小的；由於PAHs的憎水性使得它易於分配進入富含有機物的沉積物和顆粒物，這給微生物對PAHs降解造成了困難；生物積累其實也是一個PAHs在水和有機物之間平衡分配過程，由於它的高脂溶性，所以易被水生生物吸收(林穎，蔡容華.芳香族化合物生物降解的研究進展[J].福建輕紡.2006，(002):6-10.)。在上世紀80年代就發現，將烏賊暴露於原油90d後，發現其組織中的主要PAHs與原油中相同，而萘的富集倍數高達150倍。1997年，俄羅斯油輪在日本海發生油的洩漏事故，在該漏油事件發生後的第I個月，該環境中一種魚體內的PAHs迅速上升，但到第2個月該魚體內PAHs濃度又恢復到原來的濃度。
[0004]微生物降解是海洋環境(尤其是沉積物環境)中PAHs去除的最主要途徑，微生物降解分好氧降解和厭氧降解(Dua M, Singh, A.，Sethunathan, N.，Johri, A.Κ..Biotechnology and bioremediation:successes and limitations [J].ApplMicrobiolBiotechnol.2002, 59 (2-3): 143-152.)。多數好氧降解限速步驟是第一步雙加氧酶對苯環氧化生成二氫二醇，然後通過斷裂加氧酶的作用使雙羥基化的PAHs開環，生成中間產物兒茶酚或兒茶酸，再開環生成乙醛和琥珀酸進入三羧酸循環。白腐菌或木質素降解菌降解PAHs的第一步是通過過氧化氫或蟲漆酶催化生成喹啉，而後苯環開裂生成羧酸。目前從海洋環境中分離到的好氧PAHs降解菌主要集中在以下菌屬:Sphingomonas、Novosphingobium、Cyclocasticus、NeptunomonasΛPseudomonasΛ MarinobacterΛ Halomonas0
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一株多環芳烴降解菌(Bacillus sp.) s8_t8_L9。
[0006]本發明的另一個目的是提供一株多環芳烴降解菌(Bacillus sp.) s8-t8_L9在降解各種有機化合物中的應用。
[0007]所述一株多環芳烴降解菌(Bacillus sp.) s8-t8_L9,已於2014年04月09日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101，登記入冊編號為CGMCC N0.9032。多環芳烴降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9來源於南大西洋的海底表層沉積物，經人工富集培養、分離純化得到。該菌為革蘭氏染色陽性的芽孢屬(Bacillus sp.)的菌株S8_t8_L9，生物學特性為觸酶陽性，氧化酶陽性，非發酵型，專性需氧，菌體形態為呈圓形，乳白色不透明，邊緣規則，表面光滑凸起，無暈環，直徑3~4_。該菌的最適生長條件為:pH = 6.5~
8.5』溫度 28 ~30°C。
[0008]所述一株多環芳烴降解菌(Bacillus sp.) S8_t8_L9可在降解各種有機化合物中應用。
[0009]所述有機化合物為多環芳烴類化合物，所述多環芳烴類化合物包括但不限於萘，菲，芘等化合物。
[0010]對所述多環芳烴降解菌(Bacillus sp.) S8_t8_L9進行基因組測序發現，該菌含有與多環芳烴相關的基因。這些基因在該菌降解多環芳烴時發揮重要作用。
[0011]實驗證明，該菌能夠利用混合PAHs，萘，菲，芘等多環芳烴以及柴油作為唯一能源和碳源生長繁殖，該菌20天能將無機鹽培養基中的混合PAHs，萘，菲，芘，柴油降解57.94%, 58.46%, 52.14%, 23.14%,47.54%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為s8-t8_L9在各種碳源中的降解率。
【具體實施方式】
[0013]實施例一:Bacillus sp.s8_t8_L9的分離與降解混合多環芳烴的性能
[0014]現場採集南大西洋的海底表層沉積物，採用IOOmL海水培養基加入萘、菲、芘混合多環芳烴在25°C 180r/min條件下進行富集培養。兩周後，在固體培養基(M2)中稀釋塗布平板，得到多株純菌，純菌經過接種至液體培養基中驗證其降解石油烴的能力，最後得到一株多環芳烴烴的高效降解菌s8-t8-L9，該菌經16S rDNA鑑定為芽孢菌屬(Bacillussp.)。固體培養基(M2)的成分:乙酸鈉5g/L，檸檬酸鈉0.05g/L，普通肉湯培養基0.5g/L，蛋白腖0.lg/L,酵母粉0.lg/L,蘋果酸0.05g/L,葡萄糖lg/L,鹿糖0.5g/L,硝酸銨lg/L,氯化銨0.2g/L，酒石酸鈉0.05g/L，可溶性澱粉0.5g/L，瓊脂粉15g/L，加海水至1L，調pH7.5，115°C高壓蒸汽滅菌30min後補加I %體積已滅菌的KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1%體積 0.22 μ m 濾膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0015]將BaciIlussp.S8_t8_L9接種至含萘、菲、芘混合多環芳烴的海水培養基中，在180r/min、25°C搖床中培養20天後，測定該菌對於混合多環芳烴的降解能力，經過測定得到，該菌對含萘、菲、芘混合多環芳烴的降解率為57.94% (圖1)。
[0016]實施例二:Bacillus sp.s8_t8_L9單多環芳烴的降解性能測定
[0017]將Bacillus sp.s8-t8_L9接種至不同碳源(萘，菲，芘，柴油)的人工海水培養基(MMC)中，同時設置底空白對照(只加底物不加菌)，在180r/min、28°C搖床中培養20天後觀察菌株的生長狀況，並測定該菌對各底物的降解率。結果表明該菌株能夠利用萘，菲，芘，柴油生長，降解率分別為58.46%、52.14%,23.14%,47.54% (見圖1)。
[0018]人工海水培養基(MMC):NaC124g/L，MgSO4.7H207g/L, NH4NO3lg/L, KC10.7g/L,KH2P042g/L, Na2HP043g/L, pH7.4。滅菌後補加適量微量元素混合液,微量元素經0.22 μ M濾膜過濾除菌。
[0019]MMC 微量元素混合液=CaCl2, 2mg/L ；FeCl3.6H20, 50mg/L ；CuSO4, 0.5mg/L ；MnCl2.4H20, 0.5mg/L ；ZnSO4.7H20, 10mg/L。
[0020]實施例三:Bacillus sp.s8_t8_L9相關芳香烴降解基因的應用
[0021]將Bacillus sp.S8_t8_L9進行基因組測序，從基因組中尋找與石油烴和芳香烴降解相關的基因，發現了與芳香烴降解相關的基因(表1)。
[0022]表1Bacillus sp.s8_t8_L9基因組中與石油烴和芳香烴降解相關基因
【權利要求】
1.一株多環芳烴降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9，於2014年04月09日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，登記入冊編號為CGMCC N0.9032。
2.如權利要求1所述一株多環芳烴降解菌(Bacillussp.) s8-t8-L9在降解各種有機化合物中的應用。
3.如權利要求2所述應用，其特徵在於所述有機化合物為多環芳烴類化合物。
4.如權利要求3所述應用，其特徵在於所述多環芳烴類化合物包括但不限於萘，菲，芘等化合物。
5.如權利要求1所述一株多環芳烴降解菌(Bacillussp.) s8-t8_L9,其特徵在於其具有與多環芳烴降解相關的單加氧酶、P450基因；
6.如權利要求5所述一株多環芳烴降解菌(Bacillussp.) S8_t8_L9，其特徵在於所述基因在降解芳香烴中應用。
【文檔編號】C12R1/07GK104004684SQ201410247988
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】邵宗澤, 王萬鵬, 王淋, 莊玲萍 申請人:國家海洋局第三海洋研究所, 中國大洋礦產資源研究開發協會